1和D2图；ACTL6A高表达的孤立性大肝癌患者 总生存时间值1)和无瘤生存时间值2)明显短于低表达患者；图2中E1和E2 ;ACTL6A高表 达的结节性肝癌患者总生存时间巧1)和无瘤生存时间巧2)亦明显短于低表达患者。
[0080] 单多因素Cox比例风险回归模型分析发现ACTL6A的高表达是肥C总生存时间和 无瘤生存时间的独立危险预后因素，详见表2,表3。
[0081] 表2.肝癌总生存率的单因素及多因素COX回归分析
[0082]
[0084]P< 0. 05结果有显著性差异。皿，风险比；CI，可信区间。
[0085] 表3.肝癌无瘤生存率的单因素及多因素COX回归分析
[0086]
[0088] P< 0. 05结果有显著性差异。
[0089] 综合免疫组化与临床病理特征及预后的研究，提示ACTL6A高表达是肝细胞癌不 良临床类型及不良预后的重要标志，其可能促进肝癌袭转移及复发。
[0090] 3.体外实验中ACTL6A过表达可促进肝癌细胞侵袭转移，敲除ACTL6A可抑制肝癌 细胞侵袭转移
[0091] 为研究ACTL6A如何调控肝癌侵袭转移，首先根据ACTL6A表达水平不同，选择 ACTL6A低表达的化C/PR巧细胞系进行ACTL6A质粒过表达慢病毒转染，构建ACTL6A过表达 的化C/PR巧细胞株；选择ACTL6A高表达的化p3B细胞系进行ACTL6A短发夹RNA敲除质粒 慢病毒转染，构建ACTL6A低表达的化p3B细胞株；同时分别构建相应的空质粒病毒转染株 做为对照组，详见图3。图3中可见巧光显微镜拍照可见ACTL6A过表达和ACTL6A敲除的3 个序列（ACTL6A-敲除-1、ACTL6A-敲除-2和ACTL6A-敲除-3)相比肝癌细胞转染效率均 高于70%。
[0092] 转染效率经实时定量PCR和Western-blot验证发现化C/PRF5过表达ACTL6A细 胞较化C/PR巧对照组细胞的ACTL6A信使RNA和ACTL6A蛋白表达增高2倍W上；而敲除序 列经实时定量PCR和Western-blot验证发现SMCTL6A-3的效率最高，因此选择该序列进 行下一步实验，详见图4。参见图4中的A图为实时定量PCR证实化C/PRF5过表达ACTL6A 细胞的ACTL6A信使RNA表达量较对照组化C/PR巧对照组细胞超出2倍W上。参见图4中 的B图实时定量PCR验证各敲除序列的化p3B敲除ACTL6A细胞与对照组化p3B对照组细 胞中ACTL6A信使RNA表达量的差异，其中Hep3B敲除ACTL6A-3细胞敲除效率最高。参见 图4中的C图通过Western-blot验证ACTL6A蛋白在各不同转染处理的细胞中表达情况，结 果与实时定量PCR-致，后续体内外功能学实验选取化C/PR巧过表达ACTL6A细胞和化p3B 敲除ACTL6A-3细胞及相应对照组进行研究。
[0093]构建的细胞株分别进行细胞骨架免疫巧光实验、划痕愈合实验和transwell侵袭 小室实验W检测ACTL6A过表达/敲除对细胞运动、迁移和侵袭能力的影响。
[0094]采用了罗丹明鬼笔环肤标记肝癌细胞的肌动蛋白W此观察细胞骨架形态，对比PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞和化C/PR巧对照组细胞骨架形态的差异。在400倍巧光正置 显微镜下看W清楚地观察到相较于化C/PR巧对照组细胞，PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞骨 架亮度更强，细胞的形态舒展呈狭长型，并伸出更多的伪足，说明细胞运动性增强。而对比 Ifep3B敲除ACTL6A细胞和化p3B对照组细胞，发现化p3B敲除ACTL6A细胞形态较化p3B对 照组细胞呈卵圆形，伪足等明显减少，说明细胞运动性可能降低，详见图5A1，A2。参见图5 中的A1和A2 ;细胞骨架免疫巧光实验显示过表达ACTL6A质粒的化C/PRF5过表达ACTL6A 细胞形态较对照组化C/PR巧对照组明显变得舒展、细长，并有小伪足（A1);敲除ACTL6A的 Ifep3B敲除ACTL6A细胞形态较对照组化p3B对照组细胞明显呈鶴卵石样改变，细胞纤维丝 减少、密度降低，突触减少（A2)。 细胞划痕愈合实验则显示化C/PRF5过表达ACTL6A细胞相较于化C/PR巧对照组细胞 的愈合能力明显增强，24小时及48小时划痕的愈合面积均明显增加，提示转染后细胞运 动、迁移能力明显增加，详见图5B1，B2。参见图5中的图B1和图B2 ;划痕愈合实验显示过 表达ACTL6A质粒的化C/PRF5过表达ACTL6A细胞迁移能力较化C/PR巧对照组细胞明显增 强。而化p3B敲除ACTL6A细胞的愈合能力较化p3B对照组细胞明显减弱，24小时及48小 时划痕的愈合面积均明显减少，提示提示敲除ACTL6A后细胞运动、迁移能力明显减弱，详 见图5CLC2。参见图5中的图C1和图C2;敲除ACTL6A的化p3B敲除ACTL6A细胞迁移能 力较化p3B对照组细胞明显减弱。
[0095]细胞划痕愈合实验则显示化C/PRF5过表达ACTL6A细胞相较于化C/PR巧对照组 细胞的愈合能力明显增强，24小时及48小时划痕的愈合面积均明显增加，提示转染后细胞 运动、迁移能力明显增加，详见图5B1，B2。参见图5中的图B1和图B2 ;划痕愈合实验显示 过表达ACTL6A质粒的化C/PRF5过表达ACTL6A细胞迁移能力较化C/PR巧对照组细胞明显 增强。而化p3B敲除ACTL6A细胞的愈合能力较化p3B对照组细胞明显减弱，24小时及48 小时划痕的愈合面积均明显减少，提不提不献除ACTL6A后细胞运动、迁移能力明显减弱， 详见图5CLC2。参见图5中的图C1和图C2 ;敲除ACTL6A的化p3B敲除ACTL6A细胞迁移 能力较化p3B对照组细胞明显减弱。
[0096]Transwell侵袭小室实验表明化C/PRF5过表达ACTL6A细胞相较于化C/PR巧对照 组细胞的侵袭能力明显增加，结果如图5D1-D2所示。参见图5中的D1和D2 ;Transwell侵 袭小室实验显示过表达ACTL6A质粒的化C/PRF5过表达ACTL6A细胞侵袭能力较化C/PRF5 对照组细胞明显增强；敲除ACTL6A的化p3B敲除ACTL6A细胞侵袭能力较化p3B对照组细 胞明显减弱。说明24小时化C/PRF5过表达ACTL6A细胞穿过小室的数目要明显多于化C/ PR巧对照组细胞，提示转染ACTL6A后细胞的侵袭能力明显增强。而化p3B敲除ACTL6A细 胞的侵袭能力较化p3B对照组细胞明显减弱，如图抓1-D2所示，24小时化p3B敲除ACTL6A 细胞穿过小室的数目要明显少于化p3B对照组细胞，提示敲除ACTL6A后细胞的侵袭能力明 显减弱。
[0097] 综合细胞骨架免疫巧光、划痕愈合和Transwell侵袭小室实验结果，说明ACTL6A过表达能明显促进肝癌细胞的运动、迁移和侵袭能力，而敲除ACTL6A能减弱肝癌细胞的运 动、迁移和侵袭能力。
[0098] 4.裸鼠体内实验ACTL6A过表达可促进肝癌细胞生长和转移
[0099] 将化C/PRF5过表达ACTL6A细胞和化C/PR巧对照组细胞分别注射到裸鼠左腹股 沟皮下，每组各6只，一个月后将裸鼠处死，取出皮下瘤拍照并测量皮下瘤体积，结果列于 图6中的A1~A3中。参见图6中的A1图~A3图；裸鼠皮下成瘤实验显示化C/PRF5过表 达ACTL6A细胞皮下瘤明显较对照组化C/PR巧对照组细胞皮下瘤体积大（A1图，A2图）； 皮下瘤生长曲线亦提示化C/PRF5过表达ACTL6A细胞皮下瘤形成速度快于化C/PR巧对照 组细胞（A3图）。如图6A1~A2显示，PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞组所行成的皮下瘤体 积明显大于化C/PR巧对照组细胞所形成的皮下瘤体积。如图6A3所示，PLC/PR巧过表达 ACTL6A细胞组皮下瘤的生长曲线也明显快于LC/PRF5K°ntMi细胞组。
[0100] 进一步的肝脏原位种植成瘤实验中将各组皮下瘤切成约1皿3的小块后种植于裸 鼠肝被膜下，1个月后分别比较各组原位肝肿瘤体积的差异，结果列于图6中的B1~B3中。 参见图6中的B1~B3图：裸鼠肝脏原位成瘤实验显示化C/PRF5过表达ACTL6A细胞肝脏 原位成瘤体积明显较对照组化C/PR巧对照组细胞原位瘤体积大，且差异有统计学意义；肝 脏原位瘤免疫组织化学提示化C/PRF5过表达ACTL6A细胞原位瘤内ACTL6A呈细胞核内高 表达，而对照组化C/PR巧对照组内低表达炬3)。如图她1-B3,结果显示化C/PRF5过表达 ACTL6A细胞组所行成的肝脏肿瘤体积明显大于化C/PR巧对照组细胞所形成的肝脏肿瘤。 皮下成瘤及原位成瘤的实验结果充分证明，在肝癌细胞中过表达ACTL6A在体内同样可W 明显提高肝癌的生长能力。在获取肝脏原位肿瘤标本的同时，我们也检测了肿瘤的肝内转 移和肺转移情况，结果列于图6中的C1和C2 W及D1和D2中。参见图6中的C1和C2 ;肝 脏原位成瘤照片显示ACTL6A高表达的化C/PRF5过表达ACTL6A细胞构建的原位瘤较化C/ PR巧对照组细胞易发生肝内转移；参见图6中的D1和D2;肺切片肥染色显示ACTL6A高表 达的化C/PRF5过表达ACTL6A细胞较化C/PR巧对照组细胞构建的肝癌原位瘤容易发生肺 转移。如图6C1-C2，D1-D2所示，PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞的肝内转移和肺转移明显高 于化C/PR巧对照组细胞组，提示过表达ACTL6A能在体内促进肝癌的侵袭和转移，该一研究 结果进一步提示ACTL6A可能成为治疗肝癌侵袭转移的重要生物祀点。
[010。 由W上实验结果及其分析可知ACTL6A在肝癌细胞系和肝癌组织中的高表达情况 及与侵袭转移潜能相关；临床病理特征及生存分析发现ACTL6A高表达患者具有不良临床 病理因素及不良生存时间和预后；细胞功能学实验亦提示了ACTL6A高表达可促进肝癌细 胞运动、迁移、侵袭和转移潜能，抑制ACTL6A可抑制肝癌细胞运动、侵袭和转移潜能。体内 实验亦证实过表达ACTL6A能促进肝癌生长。因此，ACTL6A可作为肝癌生物祀向治疗的一 个重要祀点。我们设计不同祀向给药系统进行实验，W了解祀向抑制ACTL6A治疗肝癌的潜 能。可将该基因通过基因给药的方式，调节该基因控制的蛋白在细胞核内的表达量，从而控 制患者的预后情况，防止肝癌细胞发生EMT-MET过程导致转移。显然此处的给药方式可W 为各种可W控制细胞核中相关蛋白表达量的给药方式。举例来说可W为祀向敲除ACTL6A 质粒可W经慢病毒载体包装后进行静脉注射给药，或经电荷翻转型药物载体将药物