像。
[0058] 6. 2划痕愈合实验
[0059]细胞划痕实验参照Xu,J.等狂UJ，LiX，YangH，etal.SINlpromotes invasionandmetastasisofhepatocellularcarcinomabyfacilitating epithelial-mesenchymaltransition.Cancer, 2013, 119:2247-2257.的实验方法进行，并 根据实验要求进行了相应的调整，简要步骤如下；（1)细胞进入对数生长期后，消化、稀释 并计数，吸取约5X105个细胞加入到无菌六孔培养板中（NEST，无锡，中国），然后将其放置 在细胞培养箱中，当达到90%的细胞覆盖率时开展划痕实验。（2)将培养皿中的培基完全 吸掉后，用Tip头在培养皿中轻轻的快速划痕，注意不要划伤底部，然后用PBS缓冲液清洗 细胞数次，最后加入2ml细胞完全培养基。（3)将培养板放于倒置显微镜下观察并拍照，24 小时和48小时再次观察并拍照。根据两组细胞划痕的愈合率来进行统计分析。
[0060] 6. 3Transwell小室侵袭实验
[0061]侵袭小室实验参照Xu,J.等（XuJ,LiX,YangH,etal.SINlpromotes invasionandmetastasisofhepatocellularcarcinomabyfacilitating epithelial-mesenchymaltransition.Cancer, 2013, 119:2247-2257.)的实验方法进行， 简要步骤如下；（1)将Matrigel胶炬D，RranklinLakes，NJ)放于冰上缓慢融化，Matrigel 胶和PBS溶液按1:4混合，将20y1稀释后的Matrigel胶加入到Transwell板（Corning， NY，USA)的上室中，轻轻摇匀后放到细胞培养箱中培养24小时。（2)在下室中加入600 的完全培养基，并把Transwell小室放于其中，然后将培养板放于细胞培养箱中水化15分 钟。（3)在Transwell小室中加入2X105个细胞并添加200y1不含胎牛血清的细胞培养 基，在细胞培养箱中放置24小时。（4) 24小时后用棉团把上室内部的细胞和培养基擦掉，然 后放在冰甲醇中浸没10分钟。（5)将Tranwell小室倒扣在桌面上并在上面滴一滴结晶紫 溶液，染色15分钟。（6)15分钟后用蒸馈水洗掉结晶紫溶液，干燥后放于倒置显微镜下观 察。（7)在100倍显微镜下计数各组穿过的细胞数目，进行统计分析。7.裸鼠体内成瘤实 验
[0062] 7. 1裸鼠肝癌细胞皮下成瘤实验
[0063] BALB/c免疫缺陷鼠购买自长沙景达实验动物公司，并在中南大学动物学部SPF级 动物实验室中喂养。参照Yang, H.等（Yang H, Fang F, Qiang R, Yang L. MicroRNA-14〇-5p suppresses tumor growth and metastasis by targeting transforming growth factor beta receptor land fibroblast growth factor 9in hepatocellular carcinoma. 舶patology，2013, 58:205-217.)等的试验方法进行如下操作：将状态良好的细胞用膜酶 消化下来后用生理盐水制成悬浮液，并将细胞的浓度调整至SXloVml。裸鼠皮下瘤采取 皮下注射肿瘤细胞方法成瘤，注射部位选取左腹股沟，注射量为0. 1ml(约5 X 106细胞）， 接种时由裸鼠体侧腰部稍靠下的部位进针，要保证与接种点的距离小于针头的长度，向尾 部方穿行，绝对不能刺破皮肤或者刺破肌肉层，当针头到达接种位点时注射，可看到鼓起的 小包，退出针头。从第二天开始通过每天测量皮下瘤的长径和短径来比较两组皮下瘤生长 速度的差异；一个月后待皮下瘤长到一定体积，将裸鼠用颈椎脱位法处死，取出皮下瘤并拍 照，用游标卡尺测量皮下瘤的长径和短径。皮下瘤体积的计算公式为：体积（皿3)=(长径 (mm) X短径（mm)2)/2。
[0064] 7. 2裸鼠肝癌细胞肝脏原位成瘤实验
[0065]原位成瘤实验方法参照Yang,H.等（YangH,FangF,ChangR,Yang L.MicroRNA-14〇-5psuppressestumorgrowthandmetastasisbytargeting transforminggrowthfactorbetareceptorlandfibroblastgrowthfactor9in hepatocellularcarcinoma.化patology, 2013, 58:205-217.的方法。将 7. 1 的皮下瘤分组 取出后生理盐水浸泡，用手术刀片切割成约1mm3的小块。采用10%水合氯醒腹腔注射麻醉， 每只裸鼠约注射60y1。麻醉后，用舰伏棉球擦拭消毒裸鼠胸腹部3次，切开剑突左侧皮肤， 再横向剪开腹壁肌层及腹膜层，显露肝脏，眼科剪将左肝被膜剪开，将皮下瘤小块塞入肝被 膜下，并用明胶海绵压迫止血，缝线关闭腹腔。种植2个月后，将裸鼠用颈椎脱位法处死，完 整取出裸鼠的肝脏和肺脏，将裸鼠的肝脏分组观察并拍照，并观察有无肉眼可见转移灶。然 后采用4%甲醒浸泡所取下来的肝脏和肺脏。将裸鼠肝脏和肺脏石蜡包埋后，用切片机切成 厚度约4ym的切片，肥染色后显微镜下观察裸鼠肝脏和肺脏内的有无转移灶。
[0066] 上述各实验的实验结果及其分析如下：
[0067] 1.ACTL6A信使RNA和蛋白在肝癌细胞和肝癌组织中呈显著高表达，且与侵袭转移 潜能密切相关。
[0068] 首先采用实时定量PCR方法检测ACTL6A在肥C细胞系中ACTL6A信使RNA的表达， 结果发现ACTL6A信使RNA在肝癌细胞系中表达较L02细胞中表达明显增高；且其在高侵袭 转移能力的肝癌细胞系HCXLM3、M肥C97-H等中的表达水平也明显高于低侵袭转移能力的 肝癌细胞系SMMC772UPLC/PRF5等，RT-PCR检测也得到了一致的结果，由此可见ACTL6A与 肝癌细胞系的侵袭转移能力关系密切。同时，我们采用Western-bolt方法检测ACTL6A蛋白 在肝癌细胞系中的表达，与实时定量PCR结果完全一致，详见图1A1，A2，D1。图1中的A1: 实时定量PCR(实时定量巧光PCR，简称实时定量PCR)显示ACTL6A信使RNA在肝癌细胞系 (PLC/PRF5,SMMC7721，HepG2,Hep3B，Huh7,M肥C97-L]fflCC97-H，肥化M3)中较L02 细胞相 对高表达。参见图1中的A2，RT-PCR同样显示ACTL6A信使RNA在肝癌细胞系中表达较L02 中的表达增高，且在高转移潜能的细胞系化p3B，M肥C97-H，肥化M3中表达较低转移潜能细 胞系化C/PRF5，SMMC7721，化pG2中的高；图1中的DlWestern-blot(蛋白质印记法）显示 ACTL6A基因的蛋白表达在各肝癌细胞系中的表达较L02细胞中的高。
[0069] 接着我们检测ACTL6A在新鲜冰冻的肝癌组织（T)及配对的邻近非肿瘤正常肝组 织（ANLT)中的表达，实时定量PCR检测发现ACTL6A信使RNA在肝癌组织中较邻近非肿瘤 正常肝组织中表达明显增高，Western-bolt检测发现ACTL6A蛋白表达在肝癌组织中亦明 显较邻近非肿瘤正常肝组织中表达增高，详见图1B1，B2，D2。图1中的B1 ;实时定量PCR显 示ACTL6A信使RNA在30对肝癌组织（T)中的表达较配对的邻近非肿瘤肝组织（ANLT)中 表达明显增高；图1中的B2 ;RT-PCR检测结果显示肝血管瘤肝组织（L495)与4对肝癌组织 (T)和与T配对的邻近非肿瘤肝组织（ANLT)中ACTL6A信使RNA在肝癌组织中的表达较肝 组织及配对的ANLT中的表达明显增高；图1中的D2显示肝癌组织中ACTL6A基因的蛋白表 达较肝组织及与肝组织配对的ANLT中的表达明显增高。
[0070] 同时，根据不同临床类型的肝癌进行ACTL6A的检测，发现结节性肝癌中ACTL6A信 使RNA的表达水平明显高于孤立性大肝癌和小肝癌，详见图1C。图1中C;实时定量PCR显 示ACTL6A信使RNA的表达在结节性肝癌中较该基因在孤立性大肝癌和小肝癌中的表达均 明显增高。
[0071] 2.ACTL6A高表达与不良临床病理特征及预后密切相关
[007引进一步采用免疫组化法检测肥C组织中ACTL6A蛋白的表达，结果显示，ACTL6A蛋 白在肥C组织中高表达，而癌旁肝组织中则未见明显表达，详见图2A1。参见图2A1可见免 疫组化染色显示ACTL6A信使RNA在肝癌组织中表达明显高于相应癌旁肝组织。
[007引进一步分层研究我们发现小肝癌组和孤立性大肝癌组ACTL6A的高表达率相近， 但二者均显著低于结节性肝癌组，详见图2A2。图2A2 ;免疫组化染色显示ACTL6A在邻近非 肿瘤肝组织、无转移肝癌组织和有转移肝癌组织中表达呈现逐渐增高趋势。
[0074] 统计分析ACTL6A的高低表达与肥C患者临床病理特征的关系发现其与患者血清 甲胎蛋白水平，肿瘤结节数目，肿瘤包膜，Edmondson-Steiner分级，静脉浸润，TOM分期和 复发明显相关，详见表1。
[007引表1.ACTL6A表达水平与肝癌临床病理特征的相关性 [0076]
[0078] 注：不包括肝功能分级为化ild-化曲C级的患者。P< 0. 05结果有显著性差异。 ACTL6A低表达定义为：免疫组化评分为0-1 ;ACTL6A高表达定义为：免疫组化评分为2~ 4。
[0079] 生存分析发现ACTL6A高表达肥C患者的总生存时间及无瘤生存时间均明显短于 ACTL6A低表达者（详见图2BLB2)，且根据不同临床类型的肝癌分层分析发现ACTL6A高表 达小肝癌、孤立性大肝癌和结节性肝癌患者的总生存时间及无瘤生存时间均分别明显短于 ACTL6A低表达者（详见图 2(：1，〔2,01，02,61，62)。图281;1(3口1311-1116161'法绘制的1(-111曲 线生存分析显示ACTL6A高表达肝癌患者的总生存时间明显短于低表达的患者，图2B2显示 ACTL6A高表达肝癌患者的无瘤生存时间也明显短于低表达患者。参见图2中的C1和C2 ; 根据肝癌临床类型分层分析显示ACTL6A高表达的小肝癌患者总生存时间（C1)和无瘤生存 时间（C2)明显短于低表达患者。图2中D