、4号 (乙醇体积百分含量为3%，多糖浓度为40 y g/mL)和5号（乙醇体积百分含量为3%，多糖 浓度为50 y g/mL)。
[0085] 3)药物孵育：细胞培养结束后，吸除培养孔中的细胞培养液，分别加入200 y L步 骤2)中的1-5号含乙醇和毛木耳多糖提取物的培养液（治疗组），对照组加入等体积的含 10% FBS的RPMI1640培养液（乙醇体积百分含量为0,多糖浓度为0 y g/mL)，损伤模型组 加入等体积的含3% (体积百分含量）乙醇的培养液，置于温度为37°C，相对湿度为95%， CO2浓度为5%的培养箱中继续培养48h后，药物孵育结束。实验设置三个复孔。
[0086] 4) MTT检测：操作同步骤一。
[0087] 细胞存活率公式：细胞存活率（％ )=实验组的OD562值/对照组的OD 562 值 X 100%。
[0088] 将对照组的细胞存活率设定为100 %，结果如图3所示，治疗组的L-02细胞存活 率均高于损伤模型组的L-02细胞的存活率，毛木耳多糖提取物对L-02细胞具有不同程度 的保护作用，能够提升细胞的存活率。当培养液中毛木耳多糖提取物中多糖浓度为40 y g/ mL时，治疗组L-02细胞存活率最高，可以达到84. 79%，比损伤模型组（细胞存活率为 47. 39% )的细胞存活率提高37. 4%，因此将该浓度设定为最佳保肝剂量。
[0089] 4、毛木耳多糖提取物缓解酒精性人肝细胞损伤的特征性指标检测
[0090] 将对数生长期的L-02细胞采用0. 25 %的胰蛋白酶进行消化并用含10% FBS的 RPMI1640培养液收集重悬细胞，接种于6孔培养板中（每孔3mL，细胞密度为3 X IO5个/ 孔），置于温度为37 °C，相对湿度为95 %，CO2浓度为5 %的培养箱中培养24h。
[0091] 细胞培养结束后，吸除培养孔中的细胞培养液，治疗组加入3mL含有3% (体积百 分含量）乙醇和40 y g/mL(毛木耳多糖提取物中多糖的浓度）多糖的培养液；对照组加入 等体积的含10% FBS的RPMI1640培养液（乙醇体积百分含量为0,多糖浓度为0 y g/mL)， 损伤模型组加入等体积的含3% (体积百分含量）乙醇的培养液置于温度为37°C，相对湿 度为95%，CO2浓度为5%的培养箱中继续培养48h后，药物孵育结束。实验设置三个复孔。
[0092] 1)细胞内甘油三酯（TG)含量的检测
[0093] 药物孵育结束后，吸除培养液后收集培养皿中贴壁的细胞，采用组织甘油三脂测 定试剂盒进行TG含量的检测，同时采用BCA蛋白定量试剂盒测定样品中的蛋白含量，具体 操作参见说明书。细胞内TG的含量以ymol/mg蛋白质表示。
[0094] 结果如表2所示，治疗组L-02细胞内的TG含量明显低于损伤模型组，治疗组L-02 细胞内的TG含量（617±52ymol/mg蛋白质）比损伤模型组（2627±llymol/mg蛋白质） 降低了 76. 51 %，毛木耳多糖提取物有效降低了 L-02细胞内的TG含量，减少了 L-02细胞的 损伤。治疗组与损伤模型组能够形成统计学上显著性差异（P< 0.05)。
[0095] 2)细胞内活性氧（ROS)含量的检测
[0096] 药物孵育结束后，吸除培养孔内的培养液，收集培养皿中贴壁的细胞，加入荧光探 针，采用组织内活性氧检测试剂盒进行ROS含量的检测，具体操作参见说明书。
[0097] 结果如表2所示，治疗组L-02细胞内的ROS含量明显低于损伤模型组，治疗组 L-02细胞内的ROS的平均荧光强度（5258±582)比损伤模型组（10548±319)降低了 50. 15 %，毛木耳多糖提取物有效降低了 L-02细胞内的ROS含量，减少了 L-02细胞的损伤。 治疗组与损伤模型组能够形成统计学上显著性差异（P < 0. 05)。
[0098] 3)胞外谷丙转氨酶（ALT)和谷草转氨酶（AST)含量的检测
[0099] 药物孵育结束后，收集每孔中的培养液，采用血清内谷丙转氨酶测定试剂盒和血 清内谷草转氨酶测定试剂盒分别测定胞外ALT和AST的含量，同时采用BCA蛋白定量试剂 盒测定样品中的蛋白含量，具体操作参见说明书。ALT和AST的含量均以U/mg蛋白质表示。
[0100] 结果如表2所示，治疗组L-02细胞释放的ALT和AST的含量明显低于损伤模型组， 治疗组L-02细胞释放的ALT含量（10628±437U/mg蛋白质）比损伤模型组（16544±468U/ mg蛋白质）降低了 35. 76% ;治疗组L-02细胞释放的AST含量（6389±374U/mg蛋白质） 比损伤模型组（15072±57即/!^蛋白质）降低了57.61%，毛木耳多糖提取物有效降低了 L-02细胞释放ALT和AST的含量，保护了 L-02细胞的完整性。
[0101] 表2、毛木耳多糖提取物保护L-02细胞特征指标值
[0102]
[0103] 注：F 525nm为525nm处的荧光值。
【主权项】
1. 毛木耳提取物在制备缓解酒精性肝细胞损伤产品中的应用，所述毛木耳提取物由下 述方法制备：用乙醇沉淀毛木耳子实体水提液，收集沉淀，得到所述毛木耳提取物；所述毛 木耳子实体水提液是用水从毛木耳子实体中提取出来的水溶性物质。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述沉淀经干燥得到所述毛木耳提取物。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述毛木耳子实体水提液按照包括 如下步骤的方法制备：用水浸泡粉碎后的毛木耳子实体8-12小时，加热至90-100°C保持 3-4小时，收集水溶性物质，该水溶性物质即为所述毛木耳子实体水提液。4. 根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述缓解酒精性肝细胞损伤为 下述1)-5)中的至少一种： 1) 提高肝细胞的存活率； 2) 降低肝细胞内的甘油三酯含量； 3) 降低肝细胞内的活性氧含量； 4) 降低肝细胞对谷丙转氨酶的释放量； 5) 降低肝细胞对谷草转氨酶的释放量。5. 毛木耳提取物在制备缓解酒精性肝损伤产品中的应用，所述毛木耳提取物由下述方 法制备：用乙醇沉淀毛木耳子实体水提液，收集沉淀，得到所述毛木耳提取物；所述毛木耳 子实体水提液是用水从毛木耳子实体中提取出来的水溶性物质。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述沉淀经干燥得到所述毛木耳提取物。7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述毛木耳子实体水提液按照包括 如下步骤的方法制备：用水浸泡粉碎后的毛木耳子实体8-12小时，加热至90-100°C保持 3-4小时，收集水溶性物质，该水溶性物质即为所述毛木耳子实体水提液。8. 根据权利要求5-7中任一所述的应用，其特征在于：所述缓解酒精性肝损伤为下述 1)-5)中的至少一种： 1) 提高肝细胞的存活率； 2) 降低肝细胞内的甘油三酯含量； 3) 降低肝细胞内的活性氧含量； 4) 降低肝细胞对谷丙转氨酶的释放量； 5) 降低肝细胞对谷草转氨酶的释放量。
【专利摘要】本发明公开了毛木耳多糖提取物在制备缓解酒精性肝细胞损伤产品中的应用。采用本发明的方法制备的毛木耳多糖提取物中多糖浓度低于50μg/mL时对于L-O2细胞无细胞毒性，能够提升酒精性损伤L-O2细胞的存活率，具有保肝的作用，可用于缓解酒精性肝细胞损伤。当培养液中毛木耳多糖提取物中多糖浓度为40μg/mL时，治疗组L-O2细胞存活率最高，可以达到84.79％，比损伤模型组(细胞存活率为47.39％)的细胞存活率提高37.4％。毛木耳多糖提取物可以有效的降低细胞内TG和ROS的含量，使治疗组与模型组能够形成统计学上显著性差异(P<0.05)。同时，毛木耳多糖提取物还可以减少L-O2细胞损伤，降低胞内酶ALT和AST的释放，保护L-O2细胞的完整性，具有保肝的作用。
【IPC分类】A61K31/715, A61P1/16
【公开号】CN104971072
【申请号】CN201510333794
【发明人】赵爽, 刘宇, 高宜, 荣成博, 王守现, 许峰, 王兰青, 宋爽
【申请人】北京市农林科学院
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年6月16日