的成骨诱导的细胞外基质。经成骨诱导分化4周后的细胞电镜图如附图1所示；经脱细胞处理后得到的成骨诱导的细胞外基质的电镜图如附图2所示。
[0027]对成骨诱导的细胞外基质采用深低温粉碎法进行粉碎，将成骨诱导的细胞外基质碎片化至体积为0.01?0.1mm3的颗粒，深低温粉碎法的具体步骤为:深低温冷冻后进行真空干燥，然后低温粉碎，即得到高活性的成骨诱导的细胞外基质颗粒。经碎片化处理后得到的成骨诱导的细胞外基质颗粒的电镜图如附图3所示。
[0028]最后，将成骨诱导的细胞外基质颗粒与藻酸钙凝胶基质混合，每I毫升藻酸钙凝胶基质中混合0.05mg成骨诱导的细胞外基质颗粒，本实施例中所采用的混合方法为:将上述制备得到的成骨诱导的细胞外基质颗粒与藻酸钠溶液混合均匀，加入等比的氯化钙溶液，均匀混合，即制备得到注射型组织工程骨凝胶载体。
[0029]实施例2制备实验例(诱导多功能干细胞来源+胶原基质)
[0030]取诱导多功能干细胞培养于1cm的培养皿中，加入I %的三抗、10%的胎牛血清的低糖DMEM，置于37°C、5% 0)2培养箱中，三天换一次液，当细胞达到90%融合时按1:3传代，直到第四代(P4)。当诱导多功能干细胞达到细胞融合后，更换成骨诱导液(10%胎牛血清、50mg/L抗坏血酸、10mmol/L|3 -甘油磷酸钠、I X 10_7mol/L地塞米松)对其进行培养，使诱导多功能干细胞发生成骨诱导分化，三天换一次液，持续28天至其生长成致密组织结构，此时，诱导多功能干细胞已分泌出足够量的细胞外基质。然后采用超声波法对其进行脱细胞处理，得到高活性的成骨诱导的细胞外基质。
[0031]对成骨诱导的细胞外基质采用深低温粉碎法进行粉碎，将成骨诱导的细胞外基质碎片化至体积为0.01?0.1mm3的颗粒，深低温粉碎法的具体方法为:首先深低温冷冻，然后真空干燥，最后低温粉碎，即得到高活性的成骨诱导的细胞外基质颗粒。
[0032]最后，将成骨诱导的细胞外基质颗粒与胶原基质混合，每I毫升胶原基质中混合
0.06mg成骨诱导的细胞外基质颗粒，即制备得到注射型组织工程骨凝胶载体。
[0033]实施例3制备实验例(胚胎干细胞来源+纤维蛋白凝胶基质)
[0034]取胚胎干细胞培养于1cm的培养皿中，加入I %的三抗、10 %的胎牛血清的低糖DMEM，置于37°C、5% 0)2培养箱中，三天换一次液，当细胞达到90%融合时按1:3传代，直到第四代(P4)。当胚胎干细胞达到细胞融合后，更换成骨诱导液(10%胎牛血清、50mg/L抗坏血酸、lOmmol/L β -甘油磷酸钠、I X 10-7mol/L地塞米松)对其进行培养，使胚胎干细胞发生成骨诱导分化，三天换一次液，持续28天至其生长成致密组织结构，此时，胚胎干细胞已分泌出足够量的细胞外基质。然后采用化学法对其进行脱细胞处理，得到高活性的成骨诱导的细胞外基质。
[0035]对成骨诱导的细胞外基质采用深低温粉碎法进行粉碎，将成骨诱导的细胞外基质碎片化至体积为0.01?0.1_3的颗粒，深低温粉碎法的具体方法为:深低温冷冻，然后真空干燥，最后低温粉碎，即得到高活性的成骨诱导的细胞外基质颗粒。
[0036]最后，将成骨诱导的细胞外基质颗粒与纤维蛋白凝胶基质混合，每I毫升凝胶基质中混合0.05mg成骨诱导的细胞外基质颗粒，本实施例中所采用的混合方法为:将上述制备得到的成骨诱导的细胞外基质颗粒与纤维蛋白成分A混合均匀，然后再加入等量纤维蛋白B成分，混合均匀，即制备得到注射型组织工程骨凝胶载体。
[0037]实施例4应用实验例(兔颅骨节段性缺损修复实验)
[0038]—.建立动物模型
[0039]目前临床中的骨缺损大体上可分为腔穴性骨缺损、节段性骨缺损两大类别，本实施例中选择对注射型组织工程骨凝胶基质的修复性能要求更高的节段性骨缺损模型进行实验。选取成年雄性大白兔，5月龄，颜骨15mm缺损做为本实验动物模型。
[0040]二.实验分组
[0041]实验组:使用本发明实施例1制备得到的组织工程骨凝胶载体(即间充质干细胞来源+藻酸钙凝胶基质)携带200万BMSC单细胞悬液植入骨缺损部位，具体实验步骤见下文；
[0042]对照组:使用单纯藻酸钙凝胶载体携带200万BMSC单细胞悬液植入骨缺损部位，其余实验操作步骤与实验组相同(对照组的具体操作步骤略)。
[0043]三.实验组具体实验步骤:
[0044]1、首先制备PCL聚己内酯支架材料:
[0045](I)取聚己内酯原料15克，作为3D打印原材料。
[0046](2)先通过计算机建模软件建立几何模型:设计为内部呈蜂窝状立体结构，且内部形成直径为0.5mm的孔隙，最后生成STL格式文件。
[0047](3)打印实体模型:将上述得到的STL格式文件输入到3D打印机中，对打印参数根据需要进行设置，包括喷头行走路径、熔融温度和挤压速度等，然后打印出三维模型，即得到呈蜂窝状立体结构且内部形成直径为0.5mm的孔隙的聚己内酯支架材料。
[0048]2、支架材料、凝胶载体携带细胞植入骨缺损部位:
[0049]将200万BMSC单细胞悬液接接种于实施例1制备得到的凝胶载体(即间充质干细胞来源+藻酸钙凝胶基质)上，与上一步中制备得到的蜂窝状立体结构PCL聚己内酯支架材料一起植入动物模型的骨缺损部位。
[0050]3、实验结果:
[0051]附图4和附图5分别显示了实验组和对照组在进行骨缺损修复三个月后的新骨显微CT影像图。从附图4和附图5的对比中可以看到，实验组的缺损修复效果远优于对照组，说明利用本发明所提供的方法制备的凝胶载体与传统凝胶载体相比，可显著促进注射型组织工程骨在兔颅骨缺损部位的原位成骨效果。
[0052]本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
【主权项】
1.一种注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，其特征在于，包含下述步骤: (1)对具有成骨活性的细胞体外培养后，进行成骨诱导分化，使所述具有成骨活性的细胞分泌出细胞外基质，然后进行脱细胞处理，得到成骨诱导的细胞外基质； (2)对所述成骨诱导的细胞外基质进行碎片化处理，得到成骨诱导的细胞外基质颗粒； (3)将所述成骨诱导的细胞外基质颗粒与凝胶基质混合，制备得到所述注射型组织工程骨凝胶载体。2.根据权利要求1所述的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，其特征在于，所述具有成骨活性的细胞为诱导多能干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞或成骨细胞。3.根据权利要求2所述的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，其特征在于，所述具有成骨活性的细胞为间充质干细胞。4.根据权利要求3所述的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，其特征在于，所述成骨诱导分化的时间为2?4周。5.根据权利要求1所述的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，其特征在于，所述脱细胞处理的方法为超声波法、冻干法或化学法。6.根据权利要求1所述的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，其特征在于，所述碎片化处理时使用深低温粉碎法。7.根据权利要求6所述的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，其特征在于，所述碎片化处理时将成骨诱导的细胞外基质碎片化至体积为0.0l?0.1mm3的颗粒。8.根据权利要求1所述的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，其特征在于，所述凝胶基质为胶原、纤维蛋白凝胶或藻酸钙凝胶。9.根据权利要求1所述的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，其特征在于，将所述成骨诱导的细胞外基质颗粒与凝胶基质混合时，每I毫升凝胶基质中混合0.01?Img成骨诱导的细胞外基质颗粒。10.权利要求1?9中任一项所述的方法制备得到的注射型组织工程骨凝胶载体在骨缺损修复中的应用。
【专利摘要】本发明涉及医学高分子材料技术领域，公开了一种注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法及其应用。该制备方法包含下述步骤：(1)对具有成骨活性的细胞体外培养后，进行成骨诱导分化，使其分泌出细胞外基质，然后进行脱细胞处理，得到成骨诱导的细胞外基质；(2)对成骨诱导的细胞外基质进行碎片化处理，得到成骨诱导的细胞外基质颗粒；(3)将成骨诱导的细胞外基质颗粒与凝胶基质混合，即制得注射型组织工程骨凝胶载体。以该种方法构建得到的凝胶载体是一种更具生物活性、更为安全、更能精确模拟生理状态下组织修复微环境的仿生型凝胶载体，将其应用于骨缺损修复中可显著提高注射型组织工程骨在骨缺损部位的原位成骨效果。
【IPC分类】A61L27/24, A61L27/52, A61L27/20, A61L27/54, A61L27/22, A61L27/36
【公开号】CN104984398
【申请号】CN201510379594
【发明人】张智勇, 吴鼎宇, 汪振星, 王进兵, 张占召, 李昱
【申请人】上海交通大学医学院附属第九人民医院
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月1日