一种甘草多糖脂质体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物制备技术领域，具体涉及一种甘草多糖脂质体的制备方法。
【背景技术】
[0002] 甘草在我国有悠久的药用历史，是一种补益中草药。甘草多糖（glycyrrhiza polysaccharide，GP)是甘草的主要活性成分之一，是从甘草中提取出的一类α-D-P比喃多 糖，多糖组分由鼠李糖、葡聚糖、阿拉伯糖和半乳糖组成，并以葡聚糖为主链。该多糖类物 质，其基本结构为a-(1，4)键连接的单一葡聚糖具有抗炎、增强机体免疫力等功能，甘草 多糖分子的形貌结构为螺旋结构图像。
[0003] 脂质体（liposomes)是人工合成的双分子层的单层磷脂或多层可溶性物质隔开 的呈同心圆的微环体脂质小囊，可包裹各种物质及疫苗，进入机体后主要被网状内皮系统 吞噬而激活机体的自身免疫功能。它既是抗原也是免疫佐剂，由于其膜结构致密，抗原不易 漏出，能长久地将抗原传递给适免疫细胞，促进抗原对抗原提呈细胞的定向作用，从而显著 增强机体对抗原的免疫应答，产生保护性抗体和细胞免疫应答。通过各种给药途径，它还可 以使包裹的药物具有靶向作用，准确的命中病变部位、组织和细胞，从而增强药物的疗效， 并具有较大的发展前景。
[0004] 脂质体作为新型药物载体，在中药制剂中获得广泛的应用以来，可以防止药物快 速降解、延缓药物释放而延长药物在体内的作用时间，提高药物的溶出度和稳定性，增加药 物对靶区的指向性，降低对正常细胞的毒性，提高药物的生物利用度。以脂质体作药物包 埋，不但能提高药物的靶向定位作用，还能减少药物的用量及降低毒副作用。
[0005] 当前甘草多糖主要被制备成胶囊剂型，然而甘草多糖直接用于临床，存在着多糖 在体内代谢快、作用时间短、作用范围不集中、临床用量大等缺点。现有技术中没有甘草多 糖脂质体的制备，研究者没有任何参考，同时由于各种方法中参数之间的相互影响，无法通 过有限次的实验确定合适的方法参数，所以在如何制备甘草多糖脂质体时存在技术难题。
[0006] 虽然现有技术中有关其他脂质体制备方法的介绍，例如CN201310456446. 0公开 了一种地黄多糖脂质体逆相蒸发法的制备方法，先取大豆磷脂、胆固醇和吐温80,溶于溶剂 旋转蒸发中，超声溶解；30~70°C减压蒸发除去有机溶剂，旋转蒸发加入乙醚溶解；将地黄 多糖的PBS溶液导入反应旋转蒸发容器，形成两相体系，冰水浴超声，至形成稳定的旋转蒸 发W/0型乳剂；30~70°C减压蒸发形成胶态后加入旋转蒸发PBS，继续旋蒸除去有机溶剂； 置于超声细胞粉碎机进行超声处理，使地黄多糖融合到脂质体中，得旋转蒸发到地黄多糖 脂质体混悬液；再将混悬液分别挤压旋转蒸发过微孔滤膜，得地黄多糖脂质体。
[0007] 但是由于多糖的结构具有各自的特点，例如单糖的种类、连接位点、单糖和糖苷键 的构型以及重复单元的数量等都会因提取多糖的种类不同而不同，上述专利中公开的一种 地黄多糖脂质体的制备方法，是针对玄参科植物特别是地黄这中多糖的特点而形成的，所 以即使现有技术中有其他脂质体的制备方法，但是对甘草多糖脂质体的制备没有过多的指 导价值。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种甘草多糖脂质体的制备方法，包 括以下步骤：
[0009] (1)准确称取分析纯的大豆磷脂、胆固醇和吐温80,溶于氯仿和乙醚（体积比 0. 5-1. 5:2-3 ;优选1:2,在氯仿与乙醚以1:2的比例，在保证最佳溶解效果的同时，减慢溶 剂的挥发。）中，超声使其充分溶解；其中大豆磷脂和胆固醇的质量比为2:1-10:1，吐温80 和大豆磷脂的质量，1:1-1:20 ;
[0010] (2)将含甘草多糖的PBS溶液（磷酸盐缓冲溶液，pH = 7. 4)缓慢导入反应容器， 形成两相体系，冰水浴超声，至形成稳定的W/0型乳剂；其中大豆磷脂与甘草多糖的质量比 为 5:1-25:1 ;
[0011] (3) 25~65°C减压蒸发，形成胶态后加入PBS溶液，继续旋转蒸发，除去有机溶 剂；
[0012] (4)置于超声细胞粉碎机进行超声处理，得到甘草多糖脂质体混悬液；
[0013] (5)再将混悬液分别挤压过孔径为0. 45 μπι、0. 22 μπι的微孔滤膜3次，得甘草多糖 脂质体，置于4°C保存。
[0014] 所述步骤⑵中，大豆磷脂与甘草多糖的质量比为20:1，如图4和5,当脂药比 20:1时，包封率达最大值，而载药量随着脂药比的增加而增加，当15:1以后不再增加。
[0015] 所述步骤⑴中，大豆磷脂与胆固醇的质量比为8:1，如图6和7,当大豆磷脂与胆 固醇的比率为8:1时，包封率和载药量均达到最大值。
[0016] 所述步骤⑴中，吐温80与大豆磷脂的质量比为1:8,如图10和11，包封率和载 药量随着吐温80量的增加先增加后降低，当吐温80与磷脂比为1:8时，包封率达最大值， 而吐温80与磷脂比为1:16时，载药量达最大值。
[0017] 所述步骤（3)中，减压蒸发与旋转蒸发的温度均为45°C，如图8和9,当旋转蒸发 温度为45 °C时，包封率和载药量达到最大值。
[0018] 所述步骤⑷中，超声时间为15min，（强度40%，2.58开，2.58停），如图2和3， 当超声时间在15min时，包封率和载药量均为最大值。
[0019] 所述步骤（2)中，大豆磷脂与甘草多糖的质量比为24.24:1 ;所述步骤（3)中，旋 转蒸发温度为46. 45°C，所述步骤（4)中，超声时间为16. llmin，在此条件下包封率和载药 量达到最大值。
[0020] 所述步骤（2)中，大豆磷脂与甘草多糖的质量比为24:1 ;所述步骤（3)中，旋转蒸 发温度为46°C，所述步骤（4)中，超声时间为16min，在此条件下包封率和载药量达到最大 值。
[0021] 本发明的有益效果：
[0022] 本发明首次将甘草多糖包封于脂质体中，制备出甘草多糖脂质体，利用脂质体的 缓释作用和靶向作用维持甘草多糖在机体内的有效浓度，提高其生物利用度。
[0023] 本发明采用逆相蒸发法，通过响应面优化，能够最大可能地节约原材料同时获得 较高的药物包封率；结合超声作用，使制备的脂质体更均一更具稳定性。其中，最佳制备工 艺为：大豆磷脂与甘草多糖的质量比为24,旋转蒸发温度为46°C，超声时间为16min，包封 率平均值约为79%，其平均粒径为136. 4±0. 15lnm，见图15。
[0024] 本发明选用有机溶剂氯仿和乙醚，并且选用1:2的用量，配合合适的旋蒸时间与 以及旋蒸温度避免了逆向蒸发中常用溶剂甲醇的不易溶解，同时解决了现有技术中旋转蒸 发时的贴壁现象。
[0025] 超声的时间与处方有关，同时若加入胆固醇后更加的不易超声，本发明选用了合 适的超声时间搭配其他的参数，避免超声出现的无法成乳的现象。
【附图说明】
[0026] 图1是葡萄糖标准曲线图；
[0027] 图2是超声时间对GUPL包封率的影响结果图；
[0028] 图3是超声时间对GUPL载药量的影响结果图；
[0029] 图4是脂药比对GUPL包封率的影响结果图；
[0030] 图5是脂药比对GUPL的载药量影响结果图；
[0031] 图6是膜材比对GUPL包封率的影响结果图；
[0032] 图7是膜材比对GUPL载药量的影响结果图；
[0033] 图8是旋转蒸发温度对GUPL包封率的影响结果图；
[0034] 图9是旋转蒸发温度对GUPL载药量的影响结果图；
[0035] 图10是吐温80与磷脂比对GUPL包封率的影响结果图；
[0036] 图11是吐温80与磷脂比对GUPL载药量的影响结果图；
[0037] 图12是脂药比和旋转蒸发温度对脂质体包封率影响的的等高线和响应面图；
[0038] 图13是脂药比和超声时间对脂质体包封率影响的的等尚线和响应面图；
[0039] 图14是旋转蒸发温度和超声时间对脂质体包封率影响的的等高线和响应面图；
[0040] 图15是本发明方法制备的甘草多糖脂质体的粒度分布图。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。以下实施例中所使用的主要药 物、试剂、设备和计算方法具体如下：
[0042] 试验药物：生甘草（安徽省祥和药业有限公司生产批号：140402)。
[0043] 主要试剂：大豆磷脂（上海太伟药业有限公司，生产批号20120904)，胆固醇（天 津市博迪化学有限公司