）的水中，经0. 45ym的滤膜过滤除菌后，制得抗菌药液，各药液在4°C条 件下备用。
[0024] (3)检测各药液对细菌的最小抑菌浓度（MIC)。即细菌在LB培养基中于37°C条件 下过夜培养，1:15转接到新的LB培养基中继续培养到0D62Q= 0. 2±0. 02。细菌1:10000稀 释到LB培养基中，加入等体积的药液，混匀后取相同体积的混合物加入到下一个稀释度， 一直对倍稀释到最后一个浓度。阴性对照加入等体积的含体积百分数2%DMS0的水。
[0025] (4)细菌在37°C条件下培养18-20小时，读取0D62。，0D62。小于0. 1 (即小于本底数 值）判定为无细菌生长，试验结果如表1所示。
[0026]表1
[0027]
[0028] 上述结果表明，当三叶青叶的乙醇提取物的浓度大于等于0.5mg/mL时，能够抑制 金黄色葡萄球菌ATCC6538的生长；当浓度大于等于0. 5mg/mL，能够抑制单核细胞增多性李 斯特菌NCTC7973的生长；当浓度大于等于lmg/mL，能够抑制大肠杆菌ATCC8739的生长。以 上结果说明三叶青叶的乙醇提取物对细菌具有较好的抑制作用，具有抑菌杀菌作用。
[0029] 实施例2
[0030] (1)取干燥的三叶青的叶粉碎得到干粉，用体积百分数70%的乙醇水溶液提取 90min，干粉的质量与乙醇水溶液的体积之比为lg:15mL，过滤，滤液干燥得到三叶青叶的 乙醇提取物；
[0031] (2)三叶青叶的乙醇提取物以16mg/mL的浓度溶解于含体积百分数2%乙醇的水 中，0. 45iim的滤膜过滤除菌后，制得抗菌药液，各药液在4°C条件下备用。
[0032] (3)检测各药液对细菌的最小抑菌浓度（MIC)。即细菌在LB培养基中于37°C条件 下过夜培养，1:15转接到新的LB培养基中继续培养到0D62Q= 0. 2±0. 02。细菌1:10000稀 释到LB培养基中，加入等体积的药液，混匀后取相同体积的混合物加入到下一个稀释度， 一直对倍稀释到最后一个浓度。阴性对照加入等体积的含体积百分数2%乙醇的水。
[0033] (4)细菌在37°C条件下培养18-20小时，读取0D62。，0D62。小于0. 1 (即小于本底数 值）判定为无细菌生长。试验结果如表2所示。
[0034]表2
[0035]
[0036] 上述结果表明，当三叶青叶的乙醇提取物的浓度大于等于0.5mg/mL时，能够抑制 金黄色葡萄球菌ATCC6538的生长；当浓度大于等于lmg/mL，能够抑制单核细胞增多性李斯 特菌NCTC7973的生长；当浓度大于等于lmg/mL，能够抑制大肠杆菌ATCC8739的生长。以 上结果说明三叶青叶的乙醇提取物乙酸乙酯部位对细菌具有较好的抑制作用，具有抑菌杀 菌作用。
[0037] 对比例1
[0038] 取干燥的三叶青的根粉碎得到干粉，用体积百分数50%、75%、95%的乙醇水溶液 提取90min，干粉的质量与乙醇水溶液的体积之比为lg:3mL，过滤，滤液干燥得到三叶青的 提取物（即三叶青根的醇提物），加水配制成16mg/mL浓度的抗菌药液。试验结果如表3所 示，其中，三叶青根的水提物是指提取溶剂用水代替乙醇水溶液，其他不变。
[0039]表 3
[0040]
[0041] 上述结果表明，16mg/mL的三叶青的根的水提物和醇提物对金黄色葡萄球 菌ATCC6538，单核细胞增多性李斯特菌NCTC7973，大肠杆菌ATCC8739，肠炎沙门氏菌CGMCG50760,铜绿假单胞菌ATCC9027,副溶血弧菌ATCC17082,鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 均无抑制作用。与表1和2结果相比较，三叶青根的水提物和醇提物的抑菌效果要明显低 于三叶青叶的醇提物。
【主权项】
1. 一种三叶青叶的乙醇提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 取干燥的三叶青的叶粉碎得到干粉，用乙醇水溶液提取，过滤，滤液经干燥后得到三叶 青叶的乙醇提取物。2. 根据权利要求1所述的三叶青叶的乙醇提取物的制备方法，其特征在于，所述的乙 醇水溶液中乙醇的体积百分数为70%~95%，用乙醇水溶液提取60min~120min。3. 根据权利要求2所述的三叶青叶的乙醇提取物的制备方法，其特征在于，所述的乙 醇水溶液中乙醇的体积百分数为95%，用乙醇水溶液提取90min。4. 根据权利要求1所述的三叶青叶的乙醇提取物的制备方法，其特征在于，所述的乙 醇水溶液的用量为干粉质量的5-50mL/g。5. 根据权利要求4所述的三叶青叶的乙醇提取物的制备方法，其特征在于，所述的乙 醇水溶液的用量为干粉质量的15mL/g。6. 根据权利要求1~5任一项所述的制备方法制备的三叶青叶的乙醇提取物。7. 根据权利要求6所述的三叶青叶的乙醇提取物在制备抑菌杀菌用品的应用。8. -种抗菌药液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 将三叶青叶的乙醇提取物溶解于含溶解剂的水中，经〇. 2~0. 5 ym的滤膜过滤除菌 后，制得抗菌药液； 所述的三叶青叶的乙醇提取物的质量与含溶解剂的水的体积之比为l_16mg :lmL ; 所述的溶解剂为二甲基亚砜或乙醇，所述的含溶解剂的水中溶解剂的体积百分数为0?1%~2%〇9. 一种抗菌药液在制备抑菌杀菌用品中的应用，其特征在于，所述的抗菌药液采用权 利要求8所述的制备方法制备。
【专利摘要】本发明公开了一种三叶青叶的乙醇提取物及其制备方法和应用，该制备方法，包括：取干燥的三叶青的叶粉碎得到干粉，用乙醇水溶液提取，过滤，滤液经干燥后得到三叶青叶的乙醇提取物。本发明中，通过乙醇水溶液提取，将三叶青的叶中抑菌和杀菌成分提取出来，最后得到三叶青叶的乙醇提取物，得到的三叶青叶的乙醇提取物。所述的制备方法制备的三叶青叶的乙醇提取物，可用于制备抑菌杀菌用品，用于药物、化妆品、保健食品、食品以及用于人、动物、水产养殖过程中的抑菌和抗菌，能够有效抑制细菌生长和杀死细菌。
【IPC分类】A61K36/87, A61P31/04, A01P1/00, A23L1/29, A61K8/97, A01N65/08
【公开号】CN105012551
【申请号】CN201510460189
【发明人】吴学谦, 俞盈, 苏庆亮, 熊科辉, 许海顺, 徐娟, 吴学良, 楼利明
【申请人】浙江五养堂药业有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月30日