均匀后加入压膜内压片，制成厚约I _、直径约为10 mm左右的透明压片。用FT-1R(傅里叶变换红外光谱仪，型号为VERTEX 70，德国Bruker公司)对PPl压片在500 ~ 4000cm1区间进行扫描，采集样品的红外吸收图谱。由图2侧柏叶多酚的红外光谱图可知，在3377.64 cm 1附近有一个强而宽的吸收峰，这是属于羟基的伸缩振动特征吸收峰(3600 ~3200 cm 1X在2935.83 cm 1附近的吸收峰是属于C-H伸缩振动吸收峰(2950 ~ 2850 cm ')；1654.66 cm1附近的吸收峰是属于C=O双键的伸缩振动吸收峰(1680 ~ 1620 cm ')^268.00cm1附近的吸收峰是属于C-O伸缩振动吸收峰。1074.57 cm 1和1032.44 cm 1是C-C伸缩振动吸收峰；810.56 cm 1附近的吸收峰是属于苯环上C-H面外弯曲振动吸收峰；630.49 cm 1是O-H面外弯曲振动吸收峰。
[0062]2、侧柏叶多酚的液质连用(LC-MS)结构分析
采用液质连用(LC-MS)分析纯化后的侧柏叶多酚的结构，如图3，其中纵坐标intens表示强度。仪器型号为Agilent 1100/Esquire HCT PLUS，生产厂家为德国布鲁克公司。色谱分析条件:AgiIentZorbaxSB -C18 色谱柱(100 mm X 4.6 mm, 1.8 μ m，美国 Agilent 公司);流速0.2 mL/min，柱温25 ° C，进样量5.0 yL。流动相A为水、流动相B为乙腈，梯度洗脱过程:1 min,85% A, 15%B ；3 min，15% A, 85%B ；9 min, 15% A，85%B ；9.1 min,85% A,15%B ；10 min, 85% A，15%B。紫外采集数据范围为200 ~ 400 nm，检测波长360 nm。质谱分析条件:ESI负离子模式，喷雾气压力50 psig，干燥气流速4.0 L/min，干燥气温度180 ° C，毛细管电压2500 V ;扫描范围(m/z)50 ~ 1000。通过液质连用(LC-MS)的一级质谱图和二级质谱图分析得知，本方法制备的侧柏多酚含有厚朴酚(Magnolol，分子式C18H18O2、分子量266.32)(图4);丹皮酸(卩&60]101，分子式(]9!11。03、分子量 166.18)(图 5);阿魏酸(Ferulicacid，分子式 C9H1Q03、分子量 194.19)(图 6);芥子酸(Sinapic acid，分子式 C11H12O5、分子量 224.21)(图 7);香?酸(Coumaric acid，分子式 C9H8O3、分子量 164.16)(图 8)、迷迭香酸甲酯(Methyl rosmarinate,分子式 C19H18O8、分子量 374.35)(图 9)、序菜素(Apigenin，分子式C15H1Q05、分子量270.24)(图10)、条叶蓟素(Cirsil1l，分子式C17H14O7、分子量330)(图 11)、胡麻素(Pedalitin，分子式 C16H1207、分子量 316)(图 12)、Dicaffeoylshikimicacid (分子量 498)(图 13)、穗花杉双黄酮(Amentoflavone’C^AA。、分子量 538.46)(图14)。其中厚朴酚、丹皮酚、阿魏酸、芥子酸、香豆酸、迷迭香酸甲酯、芹菜素、条叶蓟素、胡麻素、Dicaffeoylshikimic acid为首次研究报道的侧柏叶多酸类物质。
[0063]3、侧柏叶多酚的降尿酸活性测定
配制0.1 mol/1 pH 7.5磷酸盐缓冲液(PBS);配制0.43 μ mo I/mL的黄嘌呤溶液;配制0.4U/mL黄嘌呤氧化酶溶液。将待测样品稀释或者配制成10 mg/mL,向96孔酶标板中，每孔加入50 μ L待测样品以及50 μ L黄嘌呤氧化酶溶液，以10 μ g/mL的别嘌呤醇为阳性对照。37° C保温15 min，加入200 μ L黄嘌呤溶液，在292nm波长下每30 s读数一次，共读数80次反应40 min。得出吸光值后，计算样品抑制率。黄嘌呤氧化酶是促进黄嘌呤转化成为尿酸的关键酶，抑制黄嘌呤氧化酶的活性可以抑制尿酸生成，降低血清尿酸含量。如果样品对黄嘌呤氧化酶活性有抑制作用，则说明样品具有抑制尿酸生成的功效。由图15结果知，侧柏叶多酚PFl具有良好的黄嘌呤氧化酶抑制活性，在较低浓度下，即测定体系中多酚样品终浓度为50 mg/L (即50 μ g/mL)时，对黄嘌呤氧化酶抑制活性可达44.93%。因此，通过黄嘌呤氧化酶抑制活性实验说明侧柏叶多酚具有降尿酸活性，可用于相关功能性健康食品的生产。
【主权项】
1.一种具有降尿酸活性的侧柏叶多酚的制备方法，其特征在于以侧柏叶为原料，经过如下工艺制备:超高压低温浸提、常压高温浸提、过滤浓缩、大孔吸附树脂纯化后获得。2.根据权利要求1所述的一种具有降尿酸活性的侧柏叶多酚的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤: (1)将侧柏叶于50-90 ° C下干燥3 ~ 6 h，然后用打粉机粉碎，得侧柏叶粉末； (2)将侧柏叶粉末与溶剂按料液比混合搅拌均匀，进行超高压浸提，得浸提液，将浸提液离心，收集滤液，并将滤渣进行常压高温浸提，再次离心，合并两次浸提滤液； (3)采用抽滤法或离心法去除不溶物，取滤液或上清液进行真空旋转蒸发浓缩； (4)利用大孔吸附树脂纯化步骤(4)浓缩后的粗提取液，洗脱溶剂为乙醇水溶液，以洗脱液中总酚含量为评价指标，收集侧柏叶多酚洗脱峰； (5)对大孔吸附树脂纯化后的侧柏叶多酚洗脱液进行真空旋转蒸发浓缩，后进行冷冻干燥，得到侧柏叶多酚固体粉末产品。3.根据权利要求2所述的一种具有降尿酸活性的侧柏叶多酚的制备方法，其特征在于步骤(2)的超高压浸提条件为:溶剂为水，料液比为1:15 ~ 1: 30 g/mL，用包装袋密封后置于聚四氟乙烯传压套筒内，控制浸提液温度30 ~ 40°C，高压处理条件为100 MPa -450MPa，保压时间 10 min~20 min。4.根据权利要求2所述的一种具有降尿酸活性的侧柏叶多酚的制备方法，其特征在于步骤(2)的常压高温浸提条件为:高压处理后的滤渣加热水至料液比为1:10~ 1: 15 g/mL，热水温度为70 ~ 95 ° C，浸提时间为3 ~ 6 h。5.根据权利要求2所述的一种具有降尿酸活性的侧柏叶多酚的制备方法，其特征在于步骤(2)所述离心的条件均为4000 r/min, 15 min。6.根据权利要求2所述的一种具有降尿酸活性的侧柏叶多酚的制备方法，其特征在于步骤(3)与步骤(5)所述真空旋转蒸发浓缩的温度为70° Co7.根据权利要求2所述的一种具有降尿酸活性的侧柏叶多酚的制备方法，其特征在于步骤(4)的大孔吸附树脂纯化中，所采用的树脂型号为HPD 300、HPD 600、HPD 722, DlOUNKA-9、ADaS-5、ADS-17 中的一种或多种。8.根据权利要求2所述的一种具有降尿酸活性的侧柏叶多酚的制备方法，其特征在于步骤(4)的大孔吸附树脂纯化中，所采用的洗脱溶剂是体积分数为30% ~ 80%的乙醇。9.由权利要求1所述制备方法制得的一种具有降尿酸活性的侧柏叶多酚。10.权利要求7所述的一种具有降尿酸活性的侧柏叶多酚在制备具有降尿酸功效的功能性食品或高尿酸血症、痛风疾病的辅助治疗药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种具有降尿酸活性的侧柏叶多酚及其制备方法和应用。本发明公开的侧柏叶多酚是经超高压低温浸提、常压高温浸提、过滤浓缩、大孔吸附树脂纯化获得。本发明制备的侧柏叶多酚安全性高并且热稳定性好，经黄嘌呤氧化酶抑制活性试验证明侧柏叶多酚具有良好的降尿酸活性，可用于制备具有降尿酸功效的功能性食品或高尿酸血症、痛风等疾病的辅助治疗药物。本发明的制备工艺合理简单、绿色环保，并且易于实现工业化大生产。
【IPC分类】A61K36/14, A61P19/06
【公开号】CN105055463
【申请号】CN201510449760
【发明人】任娇艳, 林泽华, 郑亚美, 揭异, 刘丹
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月28日