病毒小鼠的死亡保护和延长生命的作用
[0070] 将小鼠随机分为模型对照组、达菲组（3mg/kg)、山莓提取物①~⑤高、低剂量 (100、50mg/kg)组，每组10只，各组在乙醚轻度麻醉下感染25LD50甲1型流感病毒鼠肺适 应株50 y L，感染后4h开始ig给药，0. 2mL/次，每天2次，连续5d，另设正常对照组给予同 容积无菌蒸馏水。观察、记录动物发病和死亡数，共观察14d，计算死亡保护率[死亡保护 率=病毒对照组死亡数-给药组死亡数）/病毒对照组死亡数X 100% ]、生命延长率[生 命延长率=(给药组平均存活时间-病毒对照组平均存活时间）/病毒对照组平均存活时 间 X100% ]〇
[0071] 1. 10统计学分析：应用SPSS13. 0统计软件，对实验数据进行多因素方差分析。
[0072]二、结果
[0073] 2. 1病毒感染性滴度的测定：用Reed-Muench法计算病毒的半数感染量TCID5。为 10 4'57〇. lmL，病毒攻击量为 100TCID5。。
[0074] 2. 2山莓提取物对MDCK细胞的毒性：山莓提取物①~⑤在0? 125g/L时，对MDCK细 胞无不良影响，与正常细胞对照组无明显区别，表明山莓提取物低于〇.125g/L质量浓度对 MDCK细胞无毒性作用。
[0075] 2. 3体外抗甲1型流感病毒试验
[0076] 2. 3. 1药物对IAV的直接灭活作用
[0077] 提取物①~③各剂量组与病毒对照组（模型组）比，各组A值略有升高（P〈0. 01); 与对照药物达菲比，各组A值有所下降（P〈0.01);提取物④~⑤各剂量组与模型组比无 显著差异。见表1 (与正常细胞对照组比较：AA P〈0. 01 ;与病毒对照组比较：*P〈0. 05， **P〈0. 01 ;与达菲组比较：▲ P〈0. 05, ▲▲ P〈0. 01)。
[0078] 2. 3. 2药物对IAV吸附、侵入细胞的阻断作用
[0079] 提取物①~③各剂量组与模型组比较，各组的A值显著升高（P〈0. 01);与对照药 物达菲相比，A值无显著差异（P>0. 05);提取物④~⑤各剂量组与模型组比无显著差异。见 表1。
[0080] 2. 3. 3对IAV增殖的抑制作用
[0081] 提取物①~③各剂量组与模型组比较，各组的A值显著升高（P〈0. 01);与对照药 物达菲相比，各组A值略有下降（P〈0. 05);提取物④~⑤各剂量组与模型组比无显著差异。
[0082] 结果见表1。
[0083] 表1山莓提取物体外抗病毒作用（x土s，n = 8)
[0084]
[0085]
[0086] 2. 4对小鼠流感病毒性肺炎的影响
[0087] 高、低剂量山莓提取物①~③对流感病毒感染小鼠的肺指数具有抑制率；肺组织 悬液病毒血凝滴度和肺指数均有所降低，与模型对照组相比有显著性差异（P〈〇. 01)，与对 照药物组达菲相比，无统计学意义（P>〇. 05)。山莓提取物④~⑤高低剂量组与模型组无显 著差异。结果见表2(与模型对照组比较：**P〈0. 01)。
[0088] 表2山莓提取物对IAV感染小鼠肺指数和血凝滴度的影响（x土 s，n = 10)
[0089]
[0091] 2. 5对IAV感染小鼠生命的保护作用
[0092] 高、低剂量山莓提取物①~③对流感病毒感染小鼠的死亡保护率和生命延长率与 模型对照组相比有显著性差异（P〈〇. 01)，高剂量山莓提取物组与对照药物达菲相比，无统 计学意义（P>〇. 05);高、低剂量山莓提取物④~⑤对流感病毒感染小鼠的死亡保护率和生 命延长率与模型对照组相比无显著性差异。
[0093] 结果见表3 (与模型对照组比较：#P〈0. 01)。
[0094] 表3山莓提取物对IAV感染小鼠生命的保护作用
[0095]
[0096]诸多报道均表明达菲能够明显改善流感病毒所致的各项临床症状，因此它是此模 型中较为理想的阳性对照药物，其优异的抗病毒作用在本实验中得以证实。本实验结果证 实：山莓提取物在体外有显著的抗IAV活性的作用；对IAV感染小鼠的保护作用表现在：有 效降低小鼠肺指数、降低肺组织悬液病毒血凝效价，并延长感染小鼠平均存活时间，降低感 染病毒小鼠死亡率，且呈现出一定的量-效关系，但其临床治疗流感病毒感染的实际疗效 还有待于进一步研究。但是，本发明中党参含量对山莓提取物的上述疗效具有至关重要的 影响，过高或过低均不能产生上述作用。
[0097] 实施例8 :片剂的制备
[0098] 按实施例1方法先制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:8的比例加入赋形剂，制 粒压片。
[0099] 实施例9: 口服液的制备
[0100] 按实施例1方法先制得提取物，按常规口服液制法制成口服液。
[0101] 实施例1〇 :胶囊剂或颗粒剂的制备
[0102] 按实施例1方法先制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制 成胶囊或颗粒剂。
[0103] 实施例11:注射液的制备
[0104] 按实施例1方法制得提取物，加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
[0105] 实施例12:无菌粉针的制备
[0106] 按实施例1方法先制得提取物，溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗 过滤，再无菌精滤，分装于安瓿，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
[0107] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种山莓提取物，其特征在于所述提取物由以下方法制备：(a)以重量计，每100份 药材包含干燥的山莓80~90份和干燥的党参10~20份，混合粉碎；（b)用65~75%乙 醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味得到浓缩液；(c)对步骤（b)浓缩液依次用石油 醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物；（d)正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用20~30%乙醇冲洗7~9个柱体积除去多 糖，再用55~65%乙醇洗脱9~11个柱体积，收集55~65%乙醇洗脱液，减压浓缩，喷雾 干燥。2. 根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：步骤（d)中所述大孔树脂为AB-8型大 孔树脂。3. 根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：步骤（b)中所述用乙醇热回流提取采 用的乙醇浓度为70%。4. 根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：步骤（d)为用正丁醇萃取物用大孔树 脂富集，先用25 %乙醇冲洗8个柱体积除去多糖，再用60 %乙醇洗脱10个柱体积，收集 60%乙醇洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。5. 根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：所述提取物的液相分析方法为： 色谱柱：AgilentZorbaxSBC18 柱（4.6mmX250mm，5iim); 流动相：A为甲醇，B为0. 1 %磷酸水溶液； 梯度洗脱程序：0.01~151^11，4 25%~35%;15~25111111，4 35%~50%;25~32111111，A50% ;32 ~35min，A50%~25% ;35 ~40min，A25% ; 流动相流速：1.OmL?minS 检测波长：255nm; 柱温：30°C; 进样量：10yL。6. 药物制剂，其特征在于：含有治疗有效量的权利要求1所述的提取物和药学上可接 受的载体。7. 权利要求1所述的提取物在制备治疗甲1型流感病毒的药物中的应用。8. 权利要求6所述的药物制剂在制备治疗甲1型流感病毒的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种山莓提取物，该提取物的制备方法及医药用途，制备方法包括：(a)以重量计，每100份药材包含干燥的山莓80～90份和干燥的党参10～20份，混合粉碎；(b)用65～75％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味得到浓缩液；(c)对步骤(b)浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(d)正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用20～30％乙醇冲洗7～9个柱体积除去多糖，再用55～65％乙醇洗脱9～11个柱体积，收集55～65％乙醇洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。该提取物可以用于杀灭甲1型流感病毒。
【IPC分类】A61P31/16, A61K36/73, A61K36/344
【公开号】CN105055568
【申请号】CN201510589918
【发明人】张利文
【申请人】张利文
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月16日