以欧米茄-3脂质为基础的乳剂用于防止人类器官缺血性损伤的用图
【专利说明】以欧米茄-3脂质为基础的乳剂用于防止人类器官缺血性 损伤的用途
[0001] 本申请要求享有序列号61/767248,名为"用于治疗缺氧缺血性损伤的欧米茄-3 甘油三酯-DHA 乳剂（Omega-3 Triglyceride-DHA Emulsions for the Treatment of Hypoxic-ischemic Injuries)"並于2013年2月20日提交的美国临时申请的优先权，该申 请的全部内容并入本文。
【背景技术】
[0002] 脑缺氧缺血（中风）是在生命周期的所有阶段中的发病率和死亡率的主要原因， 其对象包括早产婴儿，特护病房的儿童以及具有脑血管病的老人。从缺血缺氧脑病幸存的 婴儿和儿童表现出终身的神经功能障碍，包括脑麻痹，神经发育迟缓，癫痫症和学习功能障 碍。Vannucci，R.C. (2000) "缺氧缺血性脑病（Hypoxic-ischemic encephalopathy)"，美 国围生医学期刊（American Journal of Perinatology) 17(3) :113_120〇
[0003] 脑缺氧缺血通常出现在危重患病儿童，和心肺骤停的联系最为显著。脂质乳剂普 遍在儿科重症监护中使用并且是这些危重患病儿童卡路里的重要来源。商业上最易得的乳 剂由具有高浓度的欧米茄-6(n-6)脂肪酸的豆油形成，富含诸如a-亚麻酸、二十碳五烯 酸（EPA)和二十二碳六烯酸（DHA)的欧米茄-3(n-3)脂肪酸的脂质乳剂来自鱼油，并且该 脂质乳剂没有广泛地应用到临床上。但是欧米茄-3油已经在诸如癫痫症，抑郁和行为紊乱 的神经疾病上显示有益效果。大多数研究支持一种由于膳食管理而造成改变的膜脂质组 成所产生的神经保护效果。在一项研究中，在神经损伤前和/或后供给的静脉内的a-亚 麻酸在两个动物模型有防护作用，动物模型为在成年斯普拉格-杜勒鼠（Sprague-Dawley rats)使用红藻氨酸诱发癫痫和通过四次血管阻塞而导致的全心缺血。Lauritzen I等 人，"多元未饱和脂肪酸是有效的神经保护体（Polyunsaturated fatty acids are potent neuroprotectors)，"EMB0 期刊（The EMB0 Journal)，20004 月 17 号；19 (8): 1784-93。但 是，仍需要方法来在初期缺血损害后，防止脑和其他器官和其他组织的受损。本发明实现这 种需求。中风是成人死亡最常见原因中的第三位或第四位，并且伴随着的巨大花费不仅是 因为死亡方面，还有在幸存者的中风后遗症护理的方面上。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了限制由缺氧-缺血导致的神经损伤的方法，包括在脑缺氧缺血损害 后，施用以欧米茄-3脂质为基础的乳剂，其中所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂包括有效 提供抗神经损伤的保护的欧米茄-3油。
[0005] 本发明也提供了限制由缺氧_缺血导致的细胞死亡的方法，包括在脑缺氧缺血损 害后，施用以欧米茄-3脂质为基础的乳剂，其中所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂包括有 效提供限制细胞死亡的保护的欧米茄-3油。所述以欧米茄_3脂质为基础的乳剂在肠内或 肠胃外给药。
[0006] 本发明的方法还包括给予常规的中风治疗或预防药物。
[0007] 本发明的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂包括以重量计的至少10%、优选地至少 20 %的欧米茄-3油。在特定实施例中，所述欧米茄-3油包括至少10%，优选地至少20% 的欧米茄-3甘油三酯和/或欧米茄_3甘油二酯，并且所述欧米茄-3甘油三酯和/或所述 欧米茄-3甘油二酯的脂肪酸包括至少40%的EPA和/或DHA。
[0008] 以欧米茄-3脂质为基础的乳剂可以任何有效剂量给药，例如0. 05g/kg到4g/kg 的剂量，并且可在缺氧-缺血损害后的任何时间给药，例如缺血损害后的20分钟-6小时或 缺氧缺血损害后的0-12小时。随后额外的给药也可预期会有，例如损害后的1-24小时后 提供随后额外的给药。所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂应当在所述缺氧-缺血损害后 尽快给药，优选地在损害后的一到两个小时内给药。
[0009] 当缺血出现在选自于由脑、心脏、肾、脊髓、大肠或小肠、胰腺和肺所构成的组中的 器官中时，本发明的方法有效。
[0010] 本发明也提供了适用于肠内或肠胃内给药的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂，其 中所述乳剂在缺氧-缺血损害后对细胞提供抗细胞死亡的保护益处，所述乳剂包括以重量 计的至少20%的欧米茄-3油，其中所述欧米茄-3油包括至少20%的欧米茄-3甘油三酯 和/或欧米茄-3甘油二酯，以及其中所述欧米茄-3甘油三酯和/或所述欧米茄-3甘油二 酯的脂肪酸包括至少40 %的EPA和/或DHA。
[0011] 本发明也提供了此处描述的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂用于制备限制由缺 氧-缺血导致的神经损伤和/或细胞死亡的药物的用途。
【附图说明】
[0012] 在附图中通过示例而非限制性的方式对本发明进行图示说明。
[0013] 图1A-1B为示出了在注射甘油三酯（TG)乳剂后血液中甘油三酯和血糖水平的图 表。图1A是示出了非禁食乳鼠（plO)体内总体血浆甘油三酯浓度（mg/dL)的图表，所述非 禁食乳鼠在清醒情况下向腹腔内部注射生理盐水或n-3甘油三酯乳剂（0.75g n-3甘油三 酯/kg体重）。*p〈0. 05 (n =每组3-8)。每个数据点代表3个分开实验的平均值土标准 误（mean土SEM)。附图1B是示出了非禁食乳鼠（plO)在经过缺氧-缺血（H/I)后期处理为 n-3甘油三酯或n-6甘油三酯或赋形剂（生理盐水）后的体内血浆血糖浓度（mg/dL)，其相 对于在H/I前或H/I后之间的时间。**p〈0. 001 (n =每组5-9)。
[0014] 附图2是示出了 H/I之后n-3甘油三酯注射和脑血流量的图表。脑血流量 (Cerebral blood flow, CBF)通过对做过颈动脉结扎术的乳鼠使用激光多普勒血流测定仪 (LDF)测量得到。在与身体同侧（右侧）半球的缺氧期间，使用激光多普勒血流测定仪每2 分钟测量得到相对CBF。经n-3甘油三酯处理（n = 3)和生理盐水处理（n = 5)的乳鼠中 响应缺氧的CBF变化被记录，该记录维持20分钟并且以前期缺氧程度百分数来表达。
[0015] 附图3A-3C是示出了 H/I之后老鼠脑的TTC着色冠状面且以损伤量化的图表。附 图3A是示出了分别进行生理盐水处理，n-3甘油三酯处理和n-6甘油三酯处理的老鼠脑的 TTC着色冠状面显微图。上面板显示了经过切片并且TTC着色（鲜活组织为灰色以及梗死 组织为白色）后的冠状老鼠脑的图像，以及下面板显示了用黑色染料追踪以量化的梗死区 域。附图3B是示出了进行n-3甘油三酯乳剂（n = 28)或n-6甘油三酯乳剂（n = 10)或 生理盐水控制（n = 27)处理后的前期-H/I老鼠的大脑梗死体积百分数的条形图。附图3C 是示出了在H/I之后进行n-3甘油三酯乳剂（n = 18)或生理盐水控制（n = 27)处理的老 鼠后期-H/I治疗方案中的大脑梗死体积百分数的条形图。
[0016] 附图4A-4B是示出了在H/I之后，Tri-DHA相对Tri-EPA在大脑梗死体积上的效 果的图表。附图4A是示出了老鼠受15分钟缺血损害，然后进行24小时再灌注并且接受2 次2剂量（0. lg n-3甘油三酯/kg和0. 375g n-3甘油三酯/kg)腹腔内部给药（紧接在缺 血损害和1小时的再灌注之后）的条形图。每个条代表使用相同H/I模型进行的5-7个独 立实验的平均值土标准误。附图4B是示出了分别接受生理盐水，0. lg Tri-DHA，0. 375g Tri-DHA以及O.lg Tri-EPA和0.375g Tri-EPA处理的老鼠脑TTC着色的冠状面的显微图。 *p〈0. 05 和除 0? lg Tri-DHA/kg 以外的其他群组相比。#p〈0. 05 和除 0? 375gTri-DHA/kg 和0. 375g Tri-EPA/kg以外的其他群组相比。
[0017] 附图5是示出了在H/I之后大脑梗死体积延迟治疗的效果的条形图。老鼠受了 15 分钟缺血损害然后进行了 24小时的再灌注并且在4个时间点接受2次腹腔内部给药（即 时[0, 1小时]，延迟1小时[1，2小时]，或2小时[2, 3小时]，或4个小时[4, 5小时]治 疗）。每个条代表5-7独立试验的平均值土标准误。*p〈0. 05 ;#p〈0. 001相对生理盐水（n =每组 10-20)。
[0018] 附图6是示出了在H/I之后在第8个星期Tri-DHA对脑组织死亡的长期影响的条 形图。老鼠受15分钟的H/I损害并且接受2次腹腔内部0. 375gTri-DHA/kg(n = 6)相对 生理盐水（n = 5)的给药。H/I之后第8个星期处死老鼠，将其脑用4%多聚甲醛固定并且 制作10 ym厚的切片加以保存。用尼氏着色方法（Nissl staining)鉴别神经元和脑结构。 如示例6的方法中所述，计算和对侧半球相关的右脑组织损失并且用百分数表示。每个条 代表平均值土标准误。*P〈〇. 05。
[0019] 附图7A-7C是示出了进行n-3甘油三酯给药后活体急性心肌梗塞降低的条形图。 附图7A是示出了 H/I损伤之后对老鼠心脏进行n-3甘油三酯给药（右侧）和对照（左侧） 的心肌梗死面积区域的减少的条形图。附图7B是示出了进行n-3甘油三酯给药（右侧） 和对照（左侧）的标记心脏细胞损伤的LDH释放减少的条形图。附图7C是示出了进行n-3 甘油三酯给药（右侧）和对照（左侧）的通过缩短百分数（％ )表示的n-3甘油三酯给药 的心脏功能的条形图。每个条代表平均值土标准误。*p〈〇. 01。
[0020] 附图8是示出了在缺血事件后，BCL-2基因表达和心脏蛋白质表达在含氧量正常 (左侧）、对照（中间）和n-3甘油三酯给药后（右侧）的增加的条形图，其中BCL-2是抗 凋亡的标记。每个条代表平均值土标准误。*p〈0. 05。
[0021] 附图9是示出了如对于幼鼠（左侧），成年鼠（中间）和新生鼠（右侧）的量化的 缺氧/缺血中急性n-3 TG神经保护作用的条形图。人们测量了梗死体积％并且断定和每 个条形图左侧的生理盐水治疗对照组相比，每个条形图右侧的ri-3TG治疗组的损伤显著减 少。
[0022] 附图10是示出了在H/I之后用n-3 FA治疗的大脑损伤减轻的图表。注射n-3 FA 后，脑的不同区域在H/I之后显著地免受中风之害。
[0023] 附图11A-11B是示出了在H/I之后急性n-3 TG的注射降低由脑Ca2+诱发的线粒 体通透性转换体（mPTP)开放的图表。线粒体功能在H/I之后和注射n-3 TG之后都得以维 持。
[0024] 附图12是示出了活体导航记忆评估的图表。中风后8个星期，神经元功能得以维 持并且在中风后初期以纯欧米茄-3 triDHA治疗的老鼠中表现更好。和tri EPA相比，使 用tri DHA结果更好。老鼠在H/I损伤之后即刻被喂食275mg triDHA/kg以及在H/I损伤 之后1个小时之后被喂食275mgtriDHA/kg。
[0025] 附图13A-13B是示出了 n-3DG降低H/I新生鼠的大脑损伤和梗死体积的图表。
[0026] 附图14是示出了脑线粒体中DHA含量的条形图。中风后n-3TG乳剂注射之后的 第4个小时，脑线粒体中DHA含量降低并且这种降低促成DHA的有益影响。注意EPA含量 没有在脑线粒体内降低（没有示出数据）。
[0027] 附图15是示出了在H/I后第24小时用NS(赋形剂）或NPD1 (20ng)后处理的老 鼠梗死体积的条形图，NPD1是DHA的分解代谢产物。
[0028] 附图16是示出了活体左冠状动脉前降支（Left anterior descending coronary artery, LAD)阻断模型的图表。
[0029] 附图17是显示n-3TG降低线粒体内的活性氧簇生成的曲线图。
[0030] 在对本发明的实施例进行描述前，可理解的是本发明不限定于特定的过程，组分， 或描述的方法，因为它们是可变化的。说明书中所用的术语仅为了达到描述特定变型或实 施例的目的，其意不在限制本发明的范围。除非另有定义，此处所使用的所有技术和科学术 语具有所属技术领域的技术人员所普遍理解的意义。虽然和此处描述的任何相似或相等的 方法和材料可用于本发明的实施例的实施或测试，现在还是要对优选的方法，设备以及材 料进行描述。此处所提及的所有出版物的全部内容通过引用而并入。此处没有任何被解释 为本发明不具有先于这些借助在先发明的公开的资格的承认。
【具体实施方式】
[0031] 在下述说明中，为了解释的目的，提出了大量的具体细节以提供对本发明进行全 面的理解。但是对于本领域的技术人员来说，显而易见地本发明不用这些具体细节也可实 施。
[0032] 定义
[0033] 除非另有定义，此处所使用的所有技术和科学术语具有所属技术领域的技术人员 所普遍理解的意义。虽然和此处描述的任何相似或相等的方法和材料可用于本发明的实施 例的实施或测试，现在还是要对优选的方法，设备以及材料进行描述。此处所提及的所有出 版物的全部内容通过引用而并入以公开和描述和所引用的出版物相关的方法和/或材料。
[0034] 通常，此处描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白 质、核酸化学以及杂交技术相关的术语是本领域技术人员所熟知并且普遍使用的。本发 明的方法和技术一般根据本发明所熟知的并且在各种普通和更加具体的除非另有所指通 过本发明引用和描述的参考文献常规方法而实施。例如，参见Sambrook等人，分子克隆 (Molecular Cloning);实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y. (1989); Ausubel 等人，分子生物学实验室指南（Current Protocols in Molecular Biology)，格林 尼出版公司（1992，并且于2002增补）；Harlow和Lan，抗体（Antibodies):实验室手册，冷 泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y. (1990);神经学原理（Principles of Neural Science)， 第四版，Eric R.Kandel, James H.Schwart, Thomas M.Jessell 编辑。McGraw-Hill/ Appleton&Lange:纽约，N. (2000) 〇
[0035] 如此处所用的"以欧米茄_3脂质为基础的乳剂"是包括至少10%的欧米茄-3油 (可多达100%欧米茄-3油）的水包油乳剂。优选地，所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂 包括至少20 % -35 %的欧米茄-3油。
[0036] 如此处所用的"欧米茄-3油"意指任何欧米茄-3脂肪酸，包括游离欧米茄-3脂 肪酸和欧米茄-3甘油三酯，甘油二酯和甘油单酯。
[0037] 术语"欧米茄-3脂肪酸"意指其中碳碳双键之一位于所述脂肪酸的碳氢侧链末端 的第三和第四个碳原子之间的多元不饱和脂肪酸。"欧米茄-3脂肪酸"的例子包括a -亚 麻酸（18:3n-3 ; a -ALA ; A3'6'9)，二十碳五烯酸（20:5n-3 ;EPA ;'"^，，二十二碳六烯 酸（22: 6n-3 ;DHA)以及二十二碳五烯酸（22: 5n-3 ;DPA ; A 7'1Q'13'16'19)，其中 EPA 和 DHA 是最 优选的。包括至少20个碳原子的欧米茄-3脂肪酸此处被称为"长链欧米茄-3脂肪酸"。
[0038] 术语"欧米茄-3甘油三酯"或"欧米茄-3甘油二酯"或"欧米茄-3甘油单酯"分 别地意指甘油三酯或甘油二酯或甘油单酯。如此处所用，术语"欧米茄-3甘油三/二酯"意 指包括欧米茄-3甘油三酯和/或甘油二酯或它们的混合物的欧米茄_3脂肪酸。
[0039] 在以脂质为基础的水包油乳剂中的欧米茄-3油或欧米茄-6油的量以每100mL乳 剂中欧米茄-3油或欧米茄_6油以g为单位的重量比表示。
[0040] 在欧米茄-3油或欧米茄-6油中甘油酯（单，二或三甘油）的量按甘油酯相对欧 米前-3油或欧米前-6油的总重量的重量百分数表示。
[0041] 诸如EPA或DHA的脂肪酸在甘油酯（单，二或三甘油）中的量按相应甘油酯的酰 基的重量百分数（wt. % )表示。
[0042] 如此处所用，缺氧意指体内或特定器官或组织的氧气短缺。
[0043] 如此处所用，缺血意指不足以提供充足氧化反应的血流量。缺血最常见的原因是 急性动脉血栓的形成，供血动脉的慢性收缩（变窄）时常是由动脉粥样硬化疾病和动脉血 管痉挛引起。当流到器官的血流量减少时，氧提取率增加。当组织不能提取足够氧气时， 组织内的氧气分压降低（缺氧）导致线粒体呼吸和氧化代谢的降低。并且，在许多器官缺 血-缺氧的急性情况下（例如中风、心肌梗死、肠扭转等等），患者病情过于严重以至于不能 服用治疗剂和进行肠内给药，因而需要肠胃外注射，例如立即注射脂质乳化剂。
[0044] 如此处所用，缺氧_缺血意指在组织或器官中同时出现缺氧和缺血。
[0045] 如此处所用，再灌注损害或再灌注损伤意指在对缺氧-缺血（H/I)组织恢复 血液供应时所导致的损害。再灌注损伤比初期缺血会更具有危害性。再引入血流将氧 气带回组织，会导致大量损害细胞的自由基和活性氧物种的生成。它也给组织带来更 多的钙离子进一步导致细胞钙超载并且导致潜在致命心肌梗死或心脏病发作，也会加速 细胞自杀。恢复的血流也增加了损害组织的炎性反应，导致白细胞摧毁原本可存活的 受损害细胞。参见Sims，N.R. ;Muyderman，H.，中风中的线粒体、氧化代谢和细胞死亡 (Mitochondria, oxidative metabolism and cell death in stroke)，生物化学和生物物 理学学报，2010年1月，1802(1): 80-91。Epub 2009年9月12号。文献服务检索系统PMID 号 19751827。
[0046] 虽然不希望被理论所约束，人们相信器官死亡或损伤经常由缺氧-缺血促成，或 和其相关的再灌注损伤、心脏梗死、器官移植、内皮功能紊乱、受损器官微量灌注、增加形成 血栓的风险或异常脂肪堆积等促成。异常脂肪堆积时常出现在不专门用来堆积脂肪的器 官，例如肝脏、胰腺或心脏。
[0047] 通常手术后和受伤后以及像脓毒症那样严重的情况，有以下特征：由免疫系统缺 陷再灌注综合征的大量刺激和形成血栓的倾向。免疫反应通过促炎性细胞因子（例如肿瘤 坏死因子和白介素）的释放而激活，当促炎性细胞因子处于较高水平时会导致严重的组织 损害。
[0048] 在这样的临床情况下，提供比内源脂质更快水解和排出的（防止血浆甘油三酯浓 度的过度增加）外源脂质尤其重要。这些脂质供给能够降低组织内细胞因子生成以及细胞 因子毒性作用的欧米茄_3脂肪酸。因此，脂肪酸通过诸如甘油三酯的脂质甘油酯得以最佳 给药方式。脂肪酸在体内脂质经由脂解作用代谢后释放和利用。当脂肪酸从脂质分子裂解 然后并入（以游离形式或作为磷脂质的组分）细胞膜并且在细胞膜内影响膜结构和细胞功 能时，用作第二信使（由此影响细胞代谢的管理），影响细胞核转录因子的调控，以及作为 二十烷类的前体。因此，希望该过程尽可能快地进行。
[0049] 人类身体能够合成某些脂肪酸。但是，长链欧米茄-3和欧米茄-6指定为"必要" 脂肪酸，因为它们不能被人体所生成并且必须靠其他来源获得。例如来自冷水性鱼的鱼油 具有含量高的欧米茄-3多元不饱和脂肪酸，以及含量较低的欧米茄_6脂肪酸。表1由n-3 Tri-DHA油的生产商费森尤斯卡比公司提供，并且表1描述了此处示例6和7所描述的一 些试验使用的n-3 Tri-DHA的组成。表1估计（在第2列）n-3鱼油包括1-7%范围的以 gm/100mL为单位的亚麻酸（C18:2n-6)和1-4%花生四烯酸（C20:4n-6)，理论上它们一起具 有的上限值为11%。但是，迄今为止，没有报道称鱼油有10%以上的欧米茄-6脂肪酸。本 发明的甘油二和三酯欧米茄-3乳剂从鱼油制备而来，采用具有10%或更少的欧米茄_6脂 肪酸的鱼油。大多数植物油（例如大豆和红花）具有含量高的欧米茄-6多元不饱和脂肪 酸（大多数以18:2(A 9'12)-亚麻油的形式存在）而含量较低的欧米茄-3脂肪酸（主要是 18:3(A9' 12'15)-a-亚麻酸）〇
[0050] 必要脂肪酸通过饮食或其他肠内或肠胃外给药获得。但是口服补充后，EPA和DHA 欧米茄-3脂肪酸富集速率实际上在不同组织间不同并且当作为必要脂肪酸前体和a -亚 麻酸供给时，其在脑和视网膜的特定区域中尤其低。而且，人类对欧米茄-3脂肪酸的消耗 在过去的30年降低了，但