TTC)着色。 然后在每个动物中的损害从〇(没有损害）到4打分（>60%同侧半球损害）。所有赋形剂 治疗的动物遭受脑损害，平均损害分数为2. 00+0. 89 ;用所述欧米茄-3甘油三酯脂质乳剂 治疗的老鼠明显更少受损，平均分为〇. 33+0. 52, p〈0. 05。脑梗死面积由TTC着色决定。
[0140] 这些结果显示当在缺氧-缺血之前和/或之后立即施用欧米茄-3甘油三酯，它们 会表现出显著的神经保护作用。当欧米茄-3甘油三酯胃肠外注射时，可获得非常相似的结 果。
[0141] 示例4 :缺氧-缺血后的治疗
[0142] 根据之前描述的方案，两种性别出生后19-21天的新生大鼠接受单侧（右侧）颈 动脉结扎手术并且接受60分钟的缺氧-缺血。在四个分开的场合，老鼠在损害后立即通过 注射以欧米茄-3脂质为基础的乳剂（100mg)而治疗，并且在损害後第4个小时再次进行相 同的治疗。所述乳剂在示例1中描述。脑损害通过72小时再灌注的TTC着色而评估。在 每个实例下，施用所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂提供了大于50%的保护，即降低组织 损害。
[0143] 附图4显示了这些试验的结果。附图4代表了全部14个对照主体（生理盐水治 疗）和21个被施用治疗的主体（以欧米茄-3脂质为基础的乳剂治疗）。平均损害分数 是：1. 93±0. 22(SEM),对照组，0. 78±0. 16 乳剂治疗（two-tailed test);通过双尾试验 p〈0. 0001。因此，除了对于整体保护的意义之外，可以看到的是40%得到治疗的老鼠得到 100%保护（和1/14未治疗的相比，几乎没有损害；和1/14中度损害未治疗动物相比，40% 仅遭受中度损害）。这些结果显示缺氧-缺血后的治疗提供了组织损害降低显示的神经保 护效益。
[0144] 成年鼠中实施的初期试验显示出和由缺氧-缺血损害的神经保护作用可相比较 的水平。
[0145] 缺氧-缺血后脑脂质的脂肪酰基组合物分析（通过气液色谱分析法）显示在梗死 脑组织相对无梗死脑组织之间没有相对差异，所述相对差异表明急性施用欧米茄-3乳剂 的效果不仅仅取决于脑细胞膜的脂肪酸组分变化。但是，在梗死区域，所有脂肪酸的绝对浓 度以约15% (yg脂肪酸/g脑水肿）下降到相似的程度，所述程度表明脑水肿的出现。施 用欧米茄-3乳剂不会出现这种降低，这就表明这些欧米茄-3脂肪酸预防脑水肿和梗死。
[0146] 示例5 :欧米茄-3甘油三酯治疗细胞靶标的效果量化
[0147] 进行了关于欧米茄-3甘油三酯治疗在活性氧簇（R0S)生成的和氧化损害的标记 方面的效果的试验以及在缺氧-缺血损害2、4、8和24小时后炎症指数的试验。初期缺 氧-缺血后第8个星期脑组织病理证实了存在持久的保护作用。脑切片用抗体着色（包括 涉及半球和未涉及半球），所述抗体识别已知参与神经元细胞凋亡（半胱天冬酶3,氨基末 端激酶），神经元存活（活化Akt磷酸化的BAD，FKHR)或调控NMDA-R信号效果（CAM KII， 和蛋白激酶C异构体，尤其是PKCy和PKCG)的活性蛋白。切片用识别神经特异性蛋白 (Tau)，星型胶质细胞（GFAP)或小神经胶质的抗体一起着色。这些分析使得欧米茄-3甘油 三酯对缺氧-缺血导致神经元的凋亡对抗凋亡信号的效果进行量化以及获得星型细胞或 小神经胶质的增益指数。而且，制备涉及和未涉及半球的全部脑提取物以量化半胱天冬酶 以及通过免疫印迹法活化的JNK和Akt的含量。
[0148] 示例6 :用于研究脑缺氧-缺血的材料和方法
[0149] 伦理学论述
[0150] 所有调查研究根据哥伦比亚大学制度性动物保护和使用委员会（IACUC)批准的 协议并且依照适于实验室动物保护指南评估和鉴定的协会执行。
[0151] 材料
[0152]从 Nu-Chek Prep 有限公司（Elysian, MN)购买 Tri-DHA 和 Tri-EPA。从 Avanti Polar-Lipids有限公司（阿尔巴尼亚，阿拉巴马）取得蛋黄卵磷脂。
[0153] 脂质乳剂
[0154] 使用四种不同类型的乳剂。以欧米茄-3(n-3)甘油三酯鱼油为基础和以欧米 茄-6 (n-6)豆油为基础的乳剂为商用制备的静脉内磷脂-稳定的乳剂。所述欧米茄-3甘 油三酯包括所述的高浓度n-3脂肪酸（FA)。u参见表1。这些欧米茄-3甘油三酯乳剂在 附图7-16中称为"n-3TG"，它们包括10 %欧米茄-3鱼油（n-3)，该欧米茄-3鱼油具有按 g/100mL乳剂的重量比计算的少于10%的欧米茄-6油，其中所述欧米茄-3油按欧米茄-3 油总重量计算是>90%的甘油三酯（TG)，并且其中高达约30% wt. - %的酰基为DHA和高达 约28%wt.-%是EPA。所述n-3 TG乳剂也被称为n-3 TG90-DHA30。其他具有纯（99%) DHA或纯（99%)EPA的乳剂也如所描述的那样接受测试。对于注射的n-3 TG乳剂的剂量， 对所述量进行计算以获得包括50%为DHA和EPA的TG - FA的给药（表1)。因而，lgm的 TG乳剂表达为0? 5gm的n-3 TG。
[0155] 表1描述和附图显示的n-6 TG乳剂包括按g/100mL乳剂的重量比计算的20%的 欧米茄-6〇1-6)、0%0撤、0%￡?4和55%源自亚油酸的了6(表1)。所述欧米茄-6了6乳剂 由富含n-6 FA的大豆油生产得到：亚油酸构成大约55%的总FA。
[0156] 表1.脂质乳剂的脂肪酸组合物1
[0157]
[0158] 1 数据由Fresenius Kabi AG ;FA,脂肪酸提供。
[0159] 纯Tri-DHA(99% DHA)和Tri-EPA(99% EPA)乳剂尺寸为VLDL并且利用所属领 域的技术人员所熟知的声波法和离心分离过程用TG油和蛋黄卵磷脂在实验室制备。 3'4 简略的，以 5:1 的重量比混合 200mg Tri-DHA(Tri-DHA oil>99%)或 Tri-EPA(Tri-EPA oil>99%)和蛋黄卵磷脂（40mg)。所述混合物在氮气下完全蒸发并且在4°C过夜进一步真 空干燥。干燥脂质于60°C用添加的蔗糖（100mg/lmL LPB)在lmL无脂蛋白缓冲剂（LPB) (150mmol/L NaCl，0.5ml of 0.1%甘油和 0.24mmol/L EDTA，pH 8.4,密度为 1.006g/mL) 中再悬浮以除去过量磷脂脂质体。所述脂质乳剂随后于50°C，使用布兰森超声破碎模型 450(Branson Sonifier model 450)(纽约，梅尔维尔，布兰森科技）产生的140W氮气流 下，进行1个小时的超声波处理。超声波处理后，溶液在4°C在LPB中透析24小时以移除 蔗糖。包括尺寸为VLDL的微粒的最终乳剂通过使用GP0-HMMPS的酶催化过程、甘油消隐方 法（弗吉尼亚，里士满，美国和光化学股份有限公司）以及胆碱氧化酶-DA0S方法（弗吉尼 亚，里士满，美国和光化学股份有限公司）进行TG和PL的分析。所述TG :磷脂的质量比例 为5. 0± 1. 0:1，和尺寸为VLDL的微粒的质量比例相似。随后所述乳剂在4°C下储存并且在 制备2个星期内使用。
[0160] 单侧脑H/I诱导
[0161] 从杰克森实验室（緬因州，巴哈伯）购买两种性别的出生3天的C57BL/6J新生鼠 以及它们的老鼠妈妈。使用H/I的Rice-Vannucci模型并且修改为plO新生鼠。5简略地， 出生10后天通过右侧颈总动脉的结扎诱导，在异氟烷麻醉下进一步灼烧和切割。研究者在 手术之中和之后对脂质乳剂治疗进行盲试。每个老鼠的整个手术过程5分钟内完成。幼崽 随后和它们的妈妈在一起恢复1.5个小时。实验过程中的环境温度维持在28°C。老鼠随后 在早产婴儿保育箱的低氧舱（潮湿的8%氧气/氮气，纽约白原市，Tech Air Inc.)中被暴 露在系统缺氧下15分钟。5在缺氧过程中所述低氧舱内部的环境温度稳定在37±0. 3°C。 为了将大脑损害程度的和温度相关的变异性最小化，再灌注的初始15分钟，将老鼠关在室 温32 °C的保育箱内。
[0162] 脑梗死的量化
[0163] 再灌注24小时后，将动物断头处死并且立即取其脑组织。使用脑切片模型切出 1-mm冠状切片。切片随后于37°C在包含2%三苯基-氯化四唑（TTC)的PBS溶液中浸渍 25分钟。TTC摄取进入到活体线粒体内，将其转换为红色。 6因此，活体组织着色为红砖色， 并且不能存活的（梗死的）组织可通过着色（白色）的缺失鉴别。使用Adobe Photoshop 和NIH Image J图像应用程序，一系列切片梗死的平面区域加和以得到梗死组织的体积 (_3)，其被颈动脉结扎术同侧的半球的全部（梗死+未梗死）体积所划分，并且以总体积 的百分数表示。
[0164] 试验组
[0165] 在不同动物组诱发H/I脑损伤，这些动物在H/I损伤之前或之后接受特定的治疗。 这些动物服从不同治疗方案的处理。
[0166] 方案1 :前期-H/I治疗n-3 TG (包含DHA和EPA)或n-6 TG的乳剂。
[0167] 给非禁食啮齿动物施用两个剂量的n-3 TG或n-6 TG的乳剂或赋形剂（生理盐水， 相等体积/Kg)，所述剂量固定为每次注射每个老鼠3mg的n-3或n-6 TG-FA(相当于1. 5g 总TG/kg的最大值，这些试验中plO老鼠体重4-6克）。第一个剂量在手术后立即腹腔内部 注射，第二剂量在缺氧阶段最后15分钟后立即腹腔内部注射。注射TG乳剂和生理盐水的 体积一直相等。
[0168] 因为n-3乳剂包括低浓度的作为抗氧化剂的a -生育酚，在分开的试验中，通过 5mga -生育酚/Kg体重的剂量腹腔内部注射a -生育酚（Vital E?，先灵葆雅，英特威）给 新生鼠施用和n-3乳剂含量匹配的当量剂量的纯a-生育酚，所述剂量为每次注射n-3 TG 乳剂的剂量。
[0169] 方案2 :n-3 TG (包含DHA和EPA两者）的后期-H/I治疗
[0170] 市场上可买到的两个剂量的n-3 TG乳剂或生理盐水以每个剂量0. 75g的n-3 TG/ kg体重（相当于1. 5g的总TG/kg)在腹腔内部注射到非禁食的啮齿动物。第一个剂量在缺 氧15分钟后立即施用，第二个剂量在再灌注阶段开始1个小时后施用。
[0171] 方案3 :n-3 TG的剂量反应，时间和特异性
[0172] 根据混合n-3 TG乳剂的DHA和EPA的剂量，给非禁食啮齿动物施用两次包含 Tri-DHA或Tri-EPA (每个剂量为0? lg n-3 TG/kg或0.375g n-3 TG/kg体重）两种类型的 n-3的脂质乳剂。参见表1。第一个剂量在初期缺氧15分钟后立即施用，第二个剂量在再 灌注1个小时后立即施用。然后在试验的不同组，Tri-DHA乳剂的功效通过4次初期注射 (H/I之后0小时，1-小时，2-小时或4-小时）而决定。对于立即治疗的0小时，第一个 剂量在初期缺氧15分钟后立即施用，第二个剂量在再灌注1个小时后立即施用。而在"延 迟"的治疗中，在再灌注后第1或第2或第4小时施用第一剂量，第1剂量后1个小时施用 第二个剂量。
[0173] 测量血液TG和血糖水平
[0174] 在单独分离的出生10天的非禁食的老鼠组别取血液样本，该血液样本在老鼠吸 入异氟醚情况下直接在其左心室取出以用于测定血液TG。样本在单次腹腔内部注射0. 75g n-3 TG/kg市场上可购买的n-3富集TG(DHA和EPA)乳剂或生理盐水后5个小时后取出样 品。总血浆TG通过GP0-HMMPS、甘油消隐方法（弗吉尼亚，里士满，美国和光化学股份有限 公司）酶促性地测量。对于血糖水平，血糖样品从单独分离的出生10天的非禁食的老鼠组 别得到的鼠尾采得血样。每个老鼠在两个时间点采样。第一个样品在手术和TG注射之前 的0时间采集，以及第二个样品在H/I和TG注射（在上述单侧脑H/I方案中描述的手术后 大约100分钟）后约10分钟采集。血糖水平通过血糖仪以mg/dL为单位电化学测量得到 (加利福尼亚，苗比达市，LifeScan,有限责任公司，稳豪血糖仪）。
[0175] 通过激光多普勒血流测定法（LDF)测量脑血流（CBF)
[0176] 在接受颈动脉结扎手术并且进行如上述描述的恢复的新生C57BL/6J老鼠的组别 中，使用激光多普勒流量计（Periflux 5000)在单侧（右侧）半球缺氧过程中测量相对 CBF。在这些老鼠中，为了准备测量CBF，在异氟烷麻醉下切开头皮并且使用光纤扩展将多普 勒探针依附于所述头盖骨（2mm后部和前囟外侧2mm)。只有局部麻醉（1 %利多卡因）在术 后使用。老鼠随后放入低氧舱（8% 02/92% N2)。记录20分钟的相应缺氧的CBF变化并且 以n-3治疗和生理盐水治疗的新生鼠的前期缺氧水平的百分数表示。
[0177] n-3注射后测量出血时间
[0178] 在被切断3-mm片段鼠尾的老鼠测量出血时间。7施用两个剂量的生理盐水对在如 原方案的相似时间框架内施用n-3TG :初次注射后2个小时进行第二次注射。第二次剂量 后45分钟后测量出血时间。被切断的尾巴于37°C浸渍在0. 9%等渗生理盐水中，并且血流 停止需要的时间定义为出血时间。如果10分钟内没有出现停止出血，尾巴就会灼烧并且将 600秒作为出血时间而记录。
[0179] 脑组织死亡的长期评估
[0180] 在新生H/I损害后的第8个星期进行脑损伤的长期评估。这个组别的plO老鼠接 受单侧H/I然后在H/I后期注射0. 375g Tri-DHA/kg (n = 6)或如上述的生理盐水（n = 5)。 H/I后的第8个星期，老鼠斩首处死。大脑被移除，并且嵌入Tissue Tck-OTC包埋剂（加利 福尼亚，托伦斯，樱花Finteck)后在干燥冷冻异戊烷（_30°C)中快速冷冻，在_80°C保存。 对于分析，冠状切面（每500 y m 10 y m)在莱卡低温恒温器中连续切割并且安装在急速冷 冻玻片上（伊利诺伊斯，赛默飞世尔科技）。切片通过尼氏着色使用甲酚紫（密苏鲁市，奥 德里奇）处理切片。使用Adobe Photoshop和NIH Image图片应用程序，每个左侧和右侧 半球的脑组织的9个切片用来描摹脑组织区域。如前所述8每个动物的左侧对照或没有受 损伤对侧半球的区域给与一个100%的数值。右侧受损身体同侧的半球剩余的脑区和左侧 半球对照，对每个动物来说，差异看作是右侧半球组织损失的百分数。
[0181] 数据分析
[0182] 数据表示为平均值土标准误。腹腔注射n-3TG乳剂后，每个时间点对照血浆TG水 平。使用2组群比较进行學生t测试（Student' s t test)。单向方差分析用来比较贯穿 冠状切片梗死区域的乳剂之间的差异，随后进行的邦弗朗尼程序（Bonferroni procedure) 用于事后分析以更正多重比较的结果。统计数据，使用SPSS软件16. 0 (伊利诺伊州，芝加 哥，SPSS有限公司）以p〈0. 05决定。
[0183] 示例7 :在新生鼠脑缺氧-缺血损伤之后，富含TG乳剂的n-3脂肪酸具有神经保 护作用
[0184] N-3 TG对血液甘油三酯和血糖水平以及出血时间的效果
[0185] 为了确定来自n-3 TG乳剂的TG是否已经被全身吸收，在腹腔内部注射后5个小 时检测血液TG水平。在n-3 TG注射后，在1. 5小时处血液TG水平和基线相比大幅提升到 高于三倍（P〈〇. 05)，然后在3到5个小时降到基线水平。参见附图1A。这就表明n-3 TG 进入血流并且被代谢掉。对照之下，注射生理盐水的老鼠的TG水平在5小时的期间内保持 不变，反映新生鼠正常血液TG水平。
[0186] H/I之后，血糖水平可影响梗死面积。9因此，在手术之前和在注射TG或生理盐水 后进行H/I的15分钟后测量每个组（n-3 TG相对n-6 TG相对生理盐水）的血糖水平。参 见附图1B。当在相同时间点下比较时，人们没有观察到群组之间血糖水平存有差异。而且， 在H/I损害后，所有群组血糖水平都同样地降低大约30%或更多（p〈0. 05)。
[0187] 和生理盐水对照组（418±90秒）相比，N-3治疗老鼠的毛细管出血时间（437±82 秒）没有差异。
[0188] H/I之后n-3 TG剂量没有改变脑血流量
[0189] 和生理盐水治疗的动物相比，对n-3治疗的新生鼠在同侧半球的CBF没有显示效 果。右颈总动脉结扎手术之后立即开始8%氧气的缺氧，在对照组和n-3治疗组的同侧半球 的CBF大约都为25%的初始水平（H/I之前），并且这在缺氧的期间一直保持。在对侧（未 结扎）半球血流在两个群组没有改变。在不管在这个模型中，新生H/I损害老鼠是生理盐 水治疗还是n-3治疗，新生H/I损害老鼠维持了非常相似的血流水平。参见附图2.
[0190] 是n-3 TG而非n-6 TG防止H/I损伤
[0191] 冠状脑组织切片用TTC着色以量化H/I后期脑损伤和n-3 TG注射效果的程度。参 见附图3。附图3A显示了分别进行了生理盐水治疗、n-6 TG乳剂治疗和n-3 TG乳剂治疗 的新生鼠大脑的代表图像。在所有的H/I损伤的动物中，组织死亡定位在如附图3A的上面 板的白色区域图示的右半球。下面板的图像，附图3A显示了使用NIH Image J量化梗死体 积的梗死区域的描摹。生理盐水治疗的脑组织显示出涉及和结扎同侧的皮质和皮质下区域 有同样的坏死灶。大多数动物中，n-3 TG注射后的神经保护作用大部分在皮质下区域被标 记，但是生理盐水治疗的老鼠具有大的皮质和皮质下的梗死。参见附图3A。
[0192] 和生理盐水治疗的同窝幼畜（对照组）（n = 27)相比，n-3 TG治疗的老鼠（n = 28)的梗死体积大幅度减少，分别是19. 9 ±4. 4 %相对35. 1± 5. 1%。参见附图3B。和生理 盐水对照组（P = 0.03)和n-3 TG群组（p〈0. 01)相比，注射n-6 TG乳剂群组的梗死体积 显著增多。
[0193] 因为a -生育酚是TG乳剂的成分（以低浓度存在以防止FA氧化反应）。使用TTC 着色以比较a-生育酚治疗和生理盐水治疗的新生鼠的大脑H/I损害程度。和生理盐水 治疗的老鼠相比，注射a-生育酚的老鼠的大脑的梗死体积没有显著的差异（没有示出数 据）。
[0194] 人们随后确定如果只在H/I之后注射（没有在H/I之前注射）n-3 TG是否有效。 参见附图3C。相似地，和n-3 TG关联更小的损伤主要是皮质下的（没有示出数据）。和H/ I后立即用生理盐水治疗的对照组相比，H/I后n-3 TG治疗组总梗死面积降低了大约50%。
[0195] 是DHA而非EPA在H/I后具有神经保护作用
[0196] 为了确定EPA相对DHA可能存在的差异，使用两个剂量（0. lg TG/kg对0. 375g TG/ kg)采用Tri-DHA相对Tri-EPA的H/I后期治疗方案研究H/I脑损伤程度。人们没有观察 到在O.lg TG/kg和0.375g TG/kg Tri-DHA治疗族群之间的脑梗死体积的统计差异。但是， 和生理盐水对照组相比，通过使用0. lg和〇.375g TG/kg Tri-DHA治疗，总梗死面积分别减 少了 48%和55%的平均值。参见附图4。和生理盐水治疗相比，通过两个剂量中任何一个 注射Tri-EPA，人们没有观察到神经保护作用。
[0197] 为了更好地粗略估计人类中风后神经保护作用的实际时间线，人们进行了延迟治 疗方案试图研究Tri-DHA乳剂的治疗时间窗（therapeutic window)。注意与生理盐水组 相比，延迟4个小时用Tri-DHA治疗没有保护效果。但是，和生理盐水治疗的动物相比，H/ I后0小时施用Tri-DHA，然后中风后延迟给药1个小时和2个小时显示相似的减少脑梗死 体积（~50%)。参见附图5。这种显著保护作用主要出现在和上述发现相似的皮质下区 域。
[0198] 长期神经保护作用
[0199] 对成年鼠的冠状脑切片进行尼氏着色（附图6)以检查H/I的影响和H/I损害后 第8个星期进行Tri-DHA治疗对大脑和神经细胞损失的长期影响。和左边对照组（对侧 半球）相比，右侧半球的损伤区域显示出明显的神经细胞损失。如附图6所示，脑组织损 失在生理盐水处理的老鼠（n = 5)的右侧半球增加了 1.67倍，分别为25. 0±2. 4%相对 15. 0±2. 5%，（p = 0. 02)。因而，在H/I24小时后的损伤和Tri-DHA的神经保护作用，在初 次中风损害后差不多2个月后在组织结构上得以证明。
[0200] 示例6和7引用的参考文献
[0201] 1. Oliveira FL，Rumsey SC, Schlotzer E，H