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[0210] 示例8 :心脏缺氧-缺血中的欧米茄-3甘油三酯DHA乳剂
[0211] 材料和方法
[0212] 动物护理
[0213] 所有研究根据哥伦比亚大学制度性动物保护和使用委员会（IACUC)批准的协议 并且依照由美国国立卫生研究院出版（NIH，出版号85-23, 1996)的实验室动物保护指南执 行。C57BL6老鼠（重量在25-30g之间并且为12-14星期大）从杰克逊实验室获得用作我们 的研究。在研究之前的一个星期之前老鼠关在动物护理设备中。所有老鼠正常喂食（Teklad 全球意识，哈伦实验室）。
[0214] 试剂
[0215]使用的第一抗体为 Bcl-2, Beclin-1, PPAR- y，p-AKT,总-AKT, p-GSK-3 0， 总-GSK-30 (美国，细胞信号传导（Celling Signaling));以及 0-actin(美 国BD Biosciences Pharmingen公司）。使用的第二抗体为抗兔IRdye800，抗鼠 IRdye700 (1:50, 000稀释）。从美国里德奥奇公司购买SB216763 (3 y M)和罗格列酮 (Rosiglitazone) (6mg/kg 体重）。从 Calbiochem 公司购买磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K)/AKT 抑制剂LY-294002 (10 y M)。这项研究所使用的抑制剂和兴奋剂是基于文献出版物。1以n-3 鱼油为基础的乳剂（l〇g of TG/100mL)是商业制备的静脉注射的磷脂-稳定乳剂，并且如 前述2'3包含高浓度的n-3 FA。n-3TG乳剂富含EPA(高达28%)和DHA(高达30%)。
[0216]活体左侧冠状动脉前降支（Left Anterior Descending Coronary Artery, LAD) 闭塞
[0217] 活体缺血-再灌注损伤的活体小鼠模型：在手术之前，老鼠吸入异氟醚麻醉（4% 诱导然后1-2. 5%保养）。麻醉之后，从老鼠口中插入聚乙烯-60 (PE-60)管，并且该管和老 鼠呼吸机相连（MiniVent Type 845, Hugo-Sachs Elektronik)以提供呼吸容量为 240 yL， 速率为每分钟110次，并且补充氧气。体温维持在37°C。实施正中胸骨切开术，将最接近 的左冠状动脉（LAD)可视化并且用7-0缝合丝线以及锥形油针（BV-1，爱惜康公司）结扎。 缺血后30分钟，剪断所述聚丙烯丝线随后恢复LAD血流。然后立即进行腹膜内（IP)注射 n-3 TG乳剂（1.5g/kg体重）并且第二次注射在再灌注60分钟后进行。对照组老鼠按照相 同的时间进行IP注射生理盐水。关闭胸壁，随后对老鼠施用丁丙诺啡（buprenorphine)并 且在温度受控的区域恢复。
[0218] 超声波心动图
[0219] 使用可视超音速Vevo 2100超声波活组织镜检查系统进行活体经胸壁超声心动 图测量。这种高频率（40MHz)超声诊断仪具有~30-40微米的纵向分辨率以及>100Hz的时 间分辨率。获得心肌缺血之前的基线超声心动图以及再灌注48小时后获得时缺血后图像。 老鼠用异氟烷（1. 5-2. OL/min)在100%氧气中轻度麻醉并且在活体内使用MS-400 38-MHz 显微扫描传感器得到左心室（LV)的经胸壁超声心动图用来获得高分辨率二维模型图像。 如早期出版的 4'5,图像用于测量LV舒张末期内径（LVEDD)，LV收缩末期内径（LVESD)，LV射 血分数（EF)以及LV缩短分数（FS)。
[0220] 测量梗死面积
[0221] 确定心肌梗死面积：再灌注48小时后，老鼠麻醉，插管并且用小鼠呼吸机换气。导 管（PE-10管）放置在颈总动脉以允许注射伊文思蓝（Evans blue dye)。进行正中胸骨切 开术并且LAD在相同位置再次像之前结扎。伊文思蓝（1.25ml 7.0%溶液）经由颈动脉导 管注射到心脏以描摹缺血区域中的非缺血区域。心脏随后迅速切除并且固定在1.5%琼脂 糖中。凝胶固化后，使用切片机将心脏垂直于纵轴切成1-_切片。所述1-_切片放置于 6孔细胞培养皿的单个孔中并且于37°C下用1% TTC进行4分钟的对比染色以区分不能存 活的心肌。每个1mm厚的心肌切片进行成像并且称重。使用和电脑相连的Q-Capture数码 照相机捕获图像。用带有NIH Image 1.63软件的计算机辅助测面法分析图像以测量梗死 面积以及全部危险区域。4'5
[0222] 活体外缺血和再灌注（I/R)
[0223] 在老鼠心脏中进行和改进试验以便使用。4' 5体重25-30g，12-14星期大的C57BL6 老鼠通过注射克他命/甲苯噻嗪混合物（ketamine/xylazine cokctail)[分别是80mg/kg 和10mg/kg]加以麻醉。通过朗根多夫灌流（Langendroff technique, LT)，采用灌注重碳酸 氢盐缓冲液，使用等容灌流系统将快速从主动脉切割的心脏在非再循环模式中进行逆行灌 注。所述灌注重碳酸氢盐缓冲液（单位是mM)包含如下成分：118NaCl，4. 7KC1，2. 5CaCl2, 1 .2MgCl2, 25NaHC03, 5葡萄糖，0. 4棕榈酸酯，0. 4BSA以及70mU/l胰岛素。氧合作用舱维持 灌注 p〇2>600mmHg。
[0224] 使用位于左心室并且和压力传感器（加利福尼亚，帕萨迪纳市，古尔德实验室）相 连的乳胶气球持续监测左心室形成的压力（LVDP)。在2-通道ADI记录器上记录心脏功能 测量值。试验计划包括30分钟常氧灌注然后30分钟全0流量缺血以及60分钟再灌注的 平衡基线阶段。流速为2. 5ml/min。灌注装置的温度严格控制以在所有条件下将心脏的温 度维持在37±0.1°C。将灌注重碳酸氢盐缓冲液加入对照组心脏。我们将封装于甘油三酯 (TG)的n-3脂肪酸的乳剂加入标准缓冲液；我们最终使用的剂量是300mg/100ml。
[0225] 化验乳酸脱氢酶（LDH)
[0226] 通过测量从体外I/R系统流出物和体内LAD系统的血样释放的乳酸脱氢酶（LDH) 评估心肌损伤，使用可从市场上购买的酶法试剂盒（美国，緬因州，Pointe Scientific有 限责任公司）进行评估。
[0227]蛋白质印迹分析（Western blot analysis)
[0228] 使用DC蛋白质定量套组（美国伯乐）确定组织和细胞蛋白质浓度。等量蛋白 质通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酸酰胺凝聚电泳（SDS-PAGE) (4-12%梯度的凝胶）而分 离并且装载于硝酸纤维膜（Invitrogen)上。在使用奥德赛遮盖液（Odyssey blocking buffer, Li-Cor Biosciences公司）将非特异性结合遮盖之后，根据制造说明书使用标革巴 第一抗体（1:1000稀释）将细胞膜在4°c过夜培养。紧接着，细胞膜在室温下用红外线标记 的第二抗体培养1个小时。使用奥德赛双色红外荧光扫描成像系统（内布拉斯加，林肯州， Li-Cor Biosciences公司）将络合物成像。使用奥德赛应用软件，版本1. 2 (Li-Cor)分析 图像以获得积分强度。
[0229] 数据分析
[0230] 数据以平均值土标准偏差（SD)表示。为了评估数值之间的差异，使用学生t方 法（Student' s t test)。p〈0. 05的数值被认为是统计上有意义的。
[0231] 在LAD模型中n-3 TG给药降低梗死面积并且增强心脏功能
[0232] 为了测试心肌缺血损伤的急性n-3 TG给药的效果，老鼠接受30分钟由LAD闭塞 诱导的缺血；随后回复冠脉血血流并且评估了再灌注过程中心肌衰弱功能的恢复。再灌注 开始和60分钟后出现缺血之后立即腹腔内注射n-3TG乳剂。48小时再灌注的最后，心脏切 片用TTC着色以量化两个群组的I/R损害的程度。附图1A显示，和n-3 TG治疗组相比，接 受生理盐水治疗的老鼠心脏的梗死面积的量。n-3 TG治疗组的老鼠（相对生理盐水治疗老 鼠）的心肌梗死面积显著减少（p〈〇.05)。处于危险中的总面积在两个组是相似的。血浆 LDH释放，作为心肌损伤的重要标记，在n-3 TG治疗的老鼠中显著减少（附图1B)。这些数 据表明再灌注过程中n-3 TG的急性治疗可显著地降低老鼠的心肌梗死的损伤。
[0233] 超声波心动描记术评估显示对照组和n-3 TG治疗组之间缩短分数（％ FS)的明显 差异。人们在n-3 TG治疗组相对生理盐水治疗对照组观察到FS的显著恢复（p〈0. 01)(附 图1C)。这些数据和梗死面积变化以及LDH水平降低揭示急性n-3 TG治疗防止老鼠遭受心 肌缺血再灌注损伤并且能够改善心脏功能。
[0234] 活体外模型中n-3 TG使得心肌免受I/R损伤
[0235] 为了进一步研究I/R后n-3 TG乳剂的急性干预效果，我们也使用了活体外灌注心 脏（I/R模型）。我们的试验显示，和对照组心脏相比，活体外模型中的再灌注过程施用 n-3 TG乳剂在I/R后显著地提高了 LVDP恢复（附图2A)。使用KREB'S缓冲剂+n-3 TG对心脏 进行再灌注维持了正常心率并且LVDP几乎恢复到和缺血之前100%相似。
[0236] 在再灌注过程中，收集心脏灌注液以探测作为心肌损伤标记的LDH释放。LDH释 放在n-3 TG治疗和对照心脏之间有显著差异，表明急性n-3 TG治疗起了保护作用（附图 2B) 〇
[0237] n-3 TG调控和I/R损伤联系的重要信号通道
[0238] 为了确定n-3 TG通过调控和I/R损伤联系的重要信号通道的变化而保护心脏，通 过蛋白免疫印迹法（Western blot analysis)在心肌组织探测p-AKT，p-GSK_30和Bcl-2。 n-3 TG乳剂显著增加了 AKT和GSK3P的磷酸化作用（附图3)以及Bcl-2蛋白质表达（附 图4)，表明n-3 TG可能通过活化PI3K-AKT-GSK3 信号通道和抗凋亡蛋白Bcl-2减少凋 亡。由于Bcl-2和Beclin-16'7相互作用并且影响自体吞，如附图4所示，Beclin-1的表达 在缺血/再灌注后增加了；n-3 TG治疗心脏显示Beclin-1蛋白表达有了显著的降低，如我 们以上描述的，Bcl-2蛋白表达伴随产生。在I/R损伤中，为了建立n-3 TG和PI3K/AKT以 及GSK3 0通道之间的联系，心脏用GSK-3 0抑制剂SB216763(3 yM)或磷脂酰肌醇-3激酶 (PI3K)/AKT抑制剂LY-294002 (10 y M)处理；它们中的每一个在基线期间开始加入并且在 缺血和再灌注自始至终持续的添加。这项研究使用的抑制剂的剂量基于文献出版物i。LDH 释放被n-3 TG降低并且n-3 TG提供的保护作用消除了 PI3K/AKT抑制剂，LY-294002 (附 图6)。和I/R对照心脏相比，SB-21676外加n-3 TG乳剂的治疗显著抑制了 LDH释放（附 图6)。
[0239] 下一步，研究缺氧诱导因子l(HIF-l)，其是在缺氧中降低的氧利用率相应的适应 性响应的重要媒介物。HIF-1 a蛋白表达（附图5)在缺血后迅速增加。在再灌注过程中， n-3 TG给药显著地抑制了 HIF-1 a蛋白表达。在我们的实验室中，以往研究表明n-3脂肪 酸，和饱和脂肪酸相比，能够降低巨噬细胞和动脉内皮脂肪酶以及炎症标志物，这些效果和 PPAR-y相关 8。因此，在I/R条件下PPAR-y和n-3 TG急性治疗的潜在联系得以检测。蛋 白质印迹分析显示，和对照组心脏相比，n-3 TG治疗的PPAR-y心脏蛋白表达显著降低（附 图5)。
[0240] 为了建立PPAR-y和n-3 TG效果之间的联系，老鼠在I/R损伤前于离体的再灌注 心脏中用PPAR-y常见的兴奋剂罗格列酮处理（6mg/kg体重，腹腔内部注射）。在再灌注 过程中，这些心脏用灌注重碳酸盐缓冲液添加或不添加n-3 TG乳剂灌注。和罗格列酮处理 心脏相比，LDH释放在罗格列酮外加n-3 TG处理心脏显著更高（附图6)。这些数据表明在 I/R过程中，PPAR-y的减少和由n-3 TG提供的心肌保护作用相关。
[0241] 总之，这些结果表明PI3K/AKT，GSK-3 和PPAR- y都是调控n-3 TG心肌保护作 用的关键通道。
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