是对欧米茄-6脂肪酸的消耗增加了，在西方人群中尤其如此。
[0051] Cao等人，"二十二碳六烯酸乙酯的慢性给药降低缺氧沙鼠的死亡率和脑水肿 (Chronic administration of ethyl docosahexaenoate decreases mortality and cerebral edema in ischemic gerbils)"，生命科学（Life Sci.)，2005 年 11 月 19 日； 74-81宣称膳食二十二碳六烯酸（DHA)摄取量能够降低细胞膜的花生四烯酸（AA)的水平， 花生四烯酸（AA)在脑缺氧时释放并且和脑损害的发病原理有牵连。Cao研究了慢性二十二 碳六烯酸乙酯给药对死亡率和由沙鼠短暂性脑缺血诱导的脑水肿的影响。
[0052] GB 2388026,全部内容通过引用并入本文，意指使用n-3多元不饱和脂肪酸EPA和 /或DHA在口服药剂的制备中，该口服药剂防止在患有供给脑的动脉粥样硬化的患者中的 脑损害。
[0053] StrokinM,神经科学（Neuroscience)，2006 年 6 月 30 日；140 (2) : 547-53,全部内 容通过引用并入本文，研究了脑磷脂中二十二碳六烯酸（22:6n-3)对神经元存活的作用。
[0054] TO 2004/028470 (PCT/US2003/030484)，全部内容通过引用并入本文，意在公开阻 碍和临床型炎症相关疾病的发生和发展的方法和组分。
[0055] 下述美国申请如全部在本文提出的那样由此通过引用并入本文：临时申请专利号 60/735862, 2005年11月14日提交；临时申请专利号60/799677, 2006年5月12日提交； 临时申请专利号11/558568, 2006年11月10日提交；PCT美国专利号06/60777, 2006年11 月10号提交；申请号13/336290, 2011年12月23号提交；临时申请号60/845518, 2006年 9月19号提交；PCT美国专利号07/20364, 2007年9月19号提交；申请号16/441795, 2009 年12月8号提交，现为美国专利号9410181 ;申请号13/783779,2013年3月4号提交；申 请号13/953718, 2013年7月29号提交；以及申请号14/102146, 2003年12月10号提交。
[0056] 也可参见Qi，K. (2002) "欧米茄-3甘油三酯修饰脂质乳剂的血液清除率和组 织革巴向通道（〇mega_3triglycerides modify blood clearance and tissue targeting pathways of lipid emulsions)"，生物化学（Biochemistry)，41:3119_3127,全部内容通 过引用并入本文，意指公认为在许多生理和病理条件中有调控作用的富含欧米茄-3的甘 油三酯。
[0057] 现在人们已经确认足够时间的脑缺氧-缺血会耗尽神经细胞的高能量储存并由 此在再灌注的几个小时到几天之后诱导一系列事件，最终引致大量的坏死和凋亡的死亡。 这些事件包括产生活性氧簇和对细胞的氧化损害、释放炎性介质、诱导延长的炎症反应以 及不断进行的持续几个星期到几个月的细胞凋亡。这个可应用到幼年、成年和老年人的器 官的缺血损伤。
[0058] 作为示例，人们相信缺氧/缺血后的神经元缺失至少部分地由谷氨酸酯的加速释 放和兴奋性神经毒性导致。N-甲基-D-冬氨酸（NMDA)受体过量的谷氨酸盐活化作用会诱 导前细胞凋亡通道并且抑制反细胞凋亡信号通道。欧米茄-3脂肪酸能够修饰多个信号通 道以影响转录调控。不受理论约束，因为本发明的发明人进行的前期研究表明整个脑的脂 肪酸情况在欧米茄-3甘油三酯乳剂的急性给药后没有得到改善，人们相信欧米茄_3脂肪 酸通过以下方式保护神经元：调控信号通道来对抗因高度亢奋NMDA受体所造成的效果；防 止生成自由基以及随后的氧化损害；维持线粒体功能并由此防止/减少后缺血炎症和炎症 介质的释放。
[0059] 最近研究（参考 Qi K, Seo T，A1-Haideri M，Worgall TS, Vogel T 等人，（2〇〇2)欧 米茄-3甘油三酯修饰脂质乳剂的血液清除率和组织靶向通道。生物化学41:3119-3127)也 表明鱼油欧米茄甘油三酯的血液清除率和组织摄取的通道和欧米茄-6豆油长链三聚甘油 (LCT)非常不同。例如，欧米茄-3超长链三聚甘油（VLCT)乳剂从血液的移除和LCT乳剂相 比似乎更少依赖血管内的脂解作用。虽然大量的两种乳剂以完整的甘油三酯的形式输送到 组织，这个通道似乎对欧米茄-3甘油三酯微粒更加重要。欧米茄-3甘油三酯微粒，VLCT比 LCT更少依赖于和"典型"脂蛋白受体相关的清除通道。由欧米茄-3甘油三酯得到的脂肪 酸在参与甘油三酯和胆固醇合成的依赖固醇调控因子（SRE)基因的基因表达中似乎比LCT 充当更强的抑制剂。
[0060] 本发明提供了限制或防止由缺氧-缺血导致的细胞凋亡和细胞/组织损害的方 法。此处所用的"限制"包括降低和/或防止。治疗缺血的效果之一就是细胞死亡降低、炎 症减少、梗死面积减少、炎性因子的生成减少、活性氧簇的生成减少以及维持线粒体的完整 性。本发明的方法包括在缺氧-缺血损害后，施用本发明的以欧米茄-3脂质为基础的乳 剂。在缺氧-缺血损害可被预测的那些情况下，本发明也提供了限制或防止细胞凋亡和细 胞/组织损害的方法，所述方法包括在缺氧-缺血损害前，施用本发明的以欧米茄-3脂质 为基础的乳剂。
[0061] 当脑受到缺氧-缺血损害时，本发明限制了神经细胞死亡和/或限制了神经性损 害。因为缺氧-缺血损害后的缺血，随后的细胞死亡的基本原理在大多数肉体器官中是相 似的，本发明也提供了在缺氧-缺血损害后，限制诸如心脏、大肠和小肠、肾和肺的其他器 官的细胞死亡。例如，由于急性肠系膜动脉缺血、慢性肠系膜动脉缺血导致的结肠缺血事件 或由肠系膜静脉血栓形成导致的缺血之后，本发明提供了限制肠道细胞死亡的方法。防止 细胞死亡的类似方法会用于心肌梗死（参见附图7)。
[0062] 前期研究表明诸如欧米茄-6亚油酸的欧米茄-6脂肪酸当在缺血事件前给药时， 在神经保护作用和心肌保护方面的效果较少。这些研究涉及英脱承」匹特? (Intralipid) 的给药，英脱利匹特?是包含55 %如欧米茄-6亚油酸的脂肪酸以及低含量EPA和 DHA(~2%)的以豆油为基础的乳剂。而且，直接注射游离脂肪酸，和甘油三酯和甘油二酯 相比，会产生严重的副作用，例如脑病。
[0063] 因此，本发明的一些方法包括施用以欧米茄-3脂质为基础的乳剂，该乳剂包括至 少10%，优选地至少20% (高达100% )按重量计的欧米茄-3油。优选地，所述欧米茄-3 油包括至少10%、优选地至少20% (高达100%)的欧米茄-3甘油三/二酯。所述欧米 茄-3甘油三/二酯中的脂肪酸优选地包括至少40 % (高达100 % )的EPA和/或DHA。本 发明乳剂中的欧米茄-3油的欧米茄_6油少于10%、优选地少于5%。
[0064] 以甘油三酯DHA欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂
[0065] 其他实施例涉及以甘油三酯DHA欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂（n-3 Tri-DHA乳剂）以及它们在治疗H/I和包括器官移植在内的再灌注损伤的治疗用途。示 例7所描述的结果显示在H/I后施用n-3 Tri-DHA乳剂（表1)对脑梗死和再灌注损伤 有神经保护作用。这些结果在 Williams (参见 Williams JJ，Mayurasakorn K，Vannucci SJ，Mastr〇pietr〇 C，Bazan NG等人。（2013)富含N-3脂肪酸的甘油三酯乳剂在新生鼠脑缺 氧-缺血损伤后具有神经保护作用。公共科学图书馆8(2) :e56233. doi:10. 1371/journal. pone. 0056233)中有所描述并且在此概括。使用了包括以欧米茄-3 (n-3)甘油三酯鱼油为 基础的和欧米茄-6 (n-6)甘油三酯在内的四种不同类型的脂质乳剂。
[0066] 脑缺氧-缺血
[0067] 术语"本发明的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂"此处通常包括已经描述的n-3 Tri-DHA乳剂。示例7所描述的结果表明在H/I后施用以甘油三酯DHA欧米茄-3脂质为基 础的水包油乳剂（n-3Tri-DHA乳剂）（表1)对脑梗死和再灌注损伤具有神经保护作用。这 些结果在 Williams JJ, Mayurasakorn K, Vannucci SJ, Mastropietro C, Bazan NG 等人?。 (2013)富含N-3脂肪酸的甘油三酯乳剂在新生鼠脑缺氧-缺血损伤后具有神经保护作用。 PLoS ONE 8 (2) : e56233. doi : 10. 1371/journal. pone. 0056233 中有所描述并且在此概括。 使用了包括以欧米茄-3 (n-3)甘油三酯鱼油为基础的和以欧米茄-6 (n-6)甘油三酯豆油为 基础的乳剂在内的四种不同类型的脂质乳剂，所述以欧米茄-3(n-3)甘油三酯鱼油为基础 的和以欧米茄-6 (n-6)甘油三酯豆油为基础的乳剂是商用静脉注射的磷脂稳定乳剂。在示 例6和7以及附图7-16中，欧米茄-3Tri-DHA乳剂指的是"n-3 TG"乳剂并且它们包括按 g/100mL乳剂的重量比计算的10%欧米茄-3鱼油（n-3)，其中欧米茄-3油按欧米茄-3油 总重量计算为>90%的甘油三酯（TG)，并且其中甘油三酯的约30%以重量百分比计的酰基 为DHA以及多达约28%为EPA。这些n-3 TG乳剂也被称为n-3TG90-DHA30乳剂。其他包 含纯（99% )DHA或纯（99% )EPA的乳剂也如前所述接受检验。
[0068] 不包括DHA或EPA (表1)的n-6TG乳剂也接受检验。这些乳剂具有按g/100mL乳 剂的重量比计算的20%的欧米茄-6油（n-6)、0% DHA、0% EPA以及来自亚油酸的按欧米 茄-3油总重量计算约55%的甘油三酯。所述n-6 TG乳剂从富集n-6 FA的大豆油生产，当 中约55%的总FA由亚油酸构成。
[0069] 在H/I之前给药时和在H/I之后立即给药时，用n-3 TG90-DHA30乳剂的治疗显著 地降低了总体梗死体积。
[0070] 通过腹腔内部注射n-3 TG90-DHA30,在注射1. 5小时后，血液TG水平相比基线提 升到高于三倍；然后由于血流中的n-3 TG90-DHA30代谢导致在3-5小时（附图1A)，血液TG 的水平降落到基线。在H/I后，确定在用n-3 TG治疗相对用n-36TG治疗以及相对生理盐 水对照（附图1B)而言，血糖水平没有不同。并且和生理盐水对照组相比，没有观察到n-3 TG在治疗老鼠的毛细血管出血次数中存有差异；在H/I后，n-3 TG90-DHA30没有改变脑血 流量。
[0071] 如脑皮质层下的区域所证明的那样（附图3A)，是n-3 TG90-DHA30而非n-6 TG乳 剂防止脑遭受H/I损伤，其中在n-3 TG治疗老鼠中梗死体积极大地降低，但在n-6 TG乳剂 注射中，梗死体积显着增加。在H/I之后立即用n-3 TG90-DHA30治疗的总梗死面积几乎减 少了 50%。附图3B。
[0072] 在H/I之后是n-3 TriDHA而非n-3 TriEPA具有神经保护作用。和生理盐水对照 组相比，用99%纯11-3作1-0拟的0.18了6/1^和0.3758了6/1^治疗的总梗死面积分别降低 到为48%和55%的平均值。附图4A-4B。但是，和生理盐水处理相比，没有观察到用99% 纯n-3 Tri-EPA治疗的神经保护作用。给药时间也很重要。和对照组相比，在H/I后延迟 4小时施用n-3 TG90-DHA30时，没有看到保护效应。附图5。但是，当在H/I后0小时立即 施用n-3 TG90-DHA30,然后在中风后1小时，2小时再次施用n-3TG90-DHA30,和对照组相 比，观察到相似的脑梗死体积的减少。
[0073] 成年鼠的冠状脑部分用尼氏着色处理（附图6)以检验H/I的效果和TG90-DHA30 治疗作为在H/I损害8星期后的长期结果的大脑和神经细胞损失的效果。和左侧对照 组（对侧半球）相比，右侧半球收损伤面积表现出明显的神经细胞损失。附图6显示和 TG90-DHA30治疗的老鼠（n = 6)相比，脑组织损失在生理盐水处理的老鼠（n = 5)的右侧 半球增加了1.67倍，分别为25.0+/-2.4%对15.0+/-2.5%，& = 0.02)。因此，人们在11/ I后24小时观察到的损伤后以及注射TG90-DHA30的神经保护作用可在最初中风损害后差 不多2个月后在组织结构上得以证明。
[0074] 进行除了示例6和7之外的额外试验以研究施用治疗脑缺氧-缺血的n-3 TG [n-3 TG90-DHA30]乳剂的效果，其效果在附图9-15显示出来。如示例6般采用和处理动物。TTC 着色显示在包括幼年鼠，成年鼠和新生鼠在内的三组不同啮齿动物模型中，腹腔内部注射 (附图9)后脑梗死面积降低。每次注射中每个老鼠施用15mg DHA，或大约500mg DHA/Kg。
[0075] 附图10显示n-3 TG90-DHA30在缺氧/缺血后减弱了脑损伤。使用示例7中的方 案，显示出注射n-3 TG90-DHA30在缺氧/缺血后可显著地防止脑不同区域遭受中风损伤。 每次注射时，给每个老鼠施用大约15mg DHA，或大约500mg DHA/Kg。其他未发表的数据显示 n_3 TG90-DHA30也能减少缺氧/缺血24小时后3-硝基诺氨酸蛋白质（3-nitrotyrosine protein)氧化作用以及4-羟基壬稀酸脂质（4-hydroxynonenal lipid)过氧化作用。
[0076] 附图11显示在缺氧/缺血后腹腔内注射n-3 TG90-DHA30会减少梗死体积，该梗 死体积和保持线粒体膜的完整性相关，这通过通常出现在缺氧/缺血后未治疗的动物中的 大脑Ca2+诱发的线粒体通透性转换体（mPTP)开放的减少佐证。每次注射时，给每个老鼠 施用大约15mg DHA，或大约500mg DHA/Kg。
[0077] 在下一个试验中，施用纯DHA或纯EPA欧米茄-3甘油三酯乳剂以测试记忆和神 经功能。在老鼠被施以缺氧/缺血而引致中风后的8个星期，对老鼠进行导航记忆评估， 该导航记忆作为神经菜单征。接着对老鼠施以包括100% DHA (纯DHA)的n-3甘油三酯或 包括100% EPA(纯EPA)的n-3甘油三酯的治疗。在最初损伤的8个星期后，水迷宫试验 (water-maze)测试周期中的第3天记录导航记忆，而在测试中移走平台。附图12A显示每 个象限耗费的时间。附图12B显示老鼠在每个象限中游动的距离：a，p〈0. 05相对于未做任 何处理；b，p〈0. 05相对于生理盐水。结果显示导航记忆和神经保护作用在用具有纯（99% ) DHA的n-3 TG治疗两次（缺氧-缺血之后立即和1小时之后）的老鼠中得以维持并且实际 上显著增强。意外的是，人们发现虽然EPA似乎没有有毒影响，用具有纯DHA的n-3 TG治 疗比用具有EPA的n-3 TG治疗的神经功能结果显著更好。在缺氧-缺血损伤之后立即和1 个小时后，进行测试之前的8个星期，给老鼠施用375mg n-3 TG 99% DHA或99% EPA/Kg。
[0078] 附图13显示n-3 TG和n-3 DG (甘油二酯）乳剂都能减少脑梗死面积。
[0079] 附图14图示分离脑线粒体的DHA含量。这些数据显示在由缺氧-缺血引起的中 风后注射n-3 TG90-DHA30的4个小时后，脑线粒体的DHA含量增加了。人们推测这种增加 可能促成DHA的有益影响。要注意的是脑线粒体的EPA含量没有增加（没有示出数据）。 每次注射时，给每个老鼠施用大约15mg DHA，或大约500mg DHA/Kg。
[0080] 附图15显示在缺氧/缺血后的第24小时，在经神经保护素D1 (NPD1) (20ng)后期 治疗过的老鼠中，老鼠的脑梗死面积降低，当中神经保护素D1 (NPD1)是DHA的代谢产物，并 且神经保护素Dl(NPDl)(20ng)后期治疗与和用生理盐水赋形剂治疗的效果截然相反。另 外，DHA的这种产物也能够在分离的、暴露在高浓度氧或老鼠的缺血损伤之后的线粒体中， 维持接近脑线粒体的渗透性。注意虽然NPD1确实有有益效果，其效果不如用含有纯（99% ) DHA的欧米茄-3甘油三酯乳剂的治疗有效。NPD1剂量是每个老鼠20纳克。
[0081] 心脏缺氧/缺血
[0082] 人们也研究了心脏缺氧/缺血后给动物施用n-3 TG90-DHA30欧米茄-3甘油三酯 乳剂的效果（示例9)。总括而言，附图7显示缺氧/缺血后急性腹腔内部注射n-3 TG乳 剂（表1 ;n-3 TG90-DHA30)降低了老鼠心脏的梗死面积；作为心脏细胞损害标记的LDH释 放减少，如超声波心动图更加正常所显示的，也维持了心脏功能。Bcl-2 (B-细胞淋巴瘤2)， 通过BCL2基因在人体内编码，是调控细胞死亡（细胞凋亡）调控蛋白质的Bcl-2家系的创 建成员并且它尤其被认为是重要的抗凋亡蛋白质，因而可被分类为致癌基因。附图9显示 在未经治疗动物的心肌梗死后Bcl-2升高了，但在人们在用n-3 TG治疗的动物中的含氧量 正常条件下观察到的Bcl-2水平增加得更快（高达约3. 5倍）。
[0083] 本发明的包含n-3 Tri-DHA的乳剂和治疗H/I的方法的实施例
[0084] 根据显示脑和心脏缺氧-缺血以及再灌注损伤的有效治疗的这些观察，特定实施 例涉及以n-3 Tri-DHA脂质为基础的水包油乳剂，其中：(a)所述乳剂包括按g/100mL乳剂 的重量比计算的至少7%到大约35%欧米茄-3油和少于10%的欧米茄-6油；(b)所述欧米 茄-3油包括按欧米茄-3油总重量计算的至少20%到100%甘油三酯，和至少20%wt. -% 至IJ100%的欧米茄-3甘油三酯的酰基是由DHA组成；（c)所述欧米茄-3油包括少于10% 的欧米茄-6脂肪酸；以及（d)乳剂中的脂质微滴的平均直径少于大约5微米。
[0085] 在特定的实施例中，所述欧米茄-3油组分包括按g/100mL乳剂的重量比计算的 10%、20%、30%或35%乳剂；本发明所述的n-3 Tri-DHA油中的所述甘油三酯组按欧米 茄-3油总重量计算为20-50 %、50-75 %、75-90 %、90-95 %和95 % -100 % ;并且所述欧米 茄-3 甘油三酯的 DHA 含量是从 20-50 %、50-75 %、75-90 %、90-95 % 和 95 % -100 % wt. % 的TG的酰基。重要的是应该注意不必为了治疗缺氧/缺血而在这些欧米茄-3乳剂中排除 EPA或甘油三酯。对于具有纯DHA的TG来说，EPA会被排除。对于n-3TG-DHA乳剂，需要具 有至少20%甘油三酯的欧米茄-3油以治疗缺氧/缺血和再灌注损伤，而当中至少20%的 甘油三酯为DHA。
[0086] 其他实施例包括分别治疗H/I损伤和再灌注损伤的方法，当中损伤包括任何脑或 心脏H/I的损伤，所述脑或心脏H/I的损伤包括中风和心肌梗死；也包括在进行移植之前 或移植之后处理在器官或组织里的H/I以将细胞死亡和细胞损害降低到最小的方法。在一 些实施例中，所述方法包括（a)鉴选经历过缺氧-缺血的主体，以及（b)给所述主体施用 药物组合物以降低由缺氧-缺血引起的再灌注损伤，所述药物组合物包括本发明所描述的 n-3Tri-DHA油的有效治疗量。在一些实施例中，所述脑缺氧-缺血导致包括中风的缺氧-缺 血症状，并且所述的n-3 Tri-DHA乳剂在缺氧-缺血后尽快给药，例如20分钟内，或在H/ I后少于1个小时、少于2小时、少于3小时和少于4小时以及在一些实施例中少于6个小 时。在一些实施例中，所述缺氧-缺血发生在心脏并且会导致心肌梗死。相同的，心脏缺 氧-缺血诊断后尽快治疗为最佳的，以减少再灌注损伤。在一些实施例中，施用所述的n-3 Tri-DHA乳剂以便在组织或器官进行器官移植后或包括选自于由脑、心脏、肾、脊髓、大肠或 小肠、胰腺和肺所构成组的器官的器官中缺氧-缺血之前降低细胞损害或细胞死亡。
[0087] 在一些实施例中，有效治疗量为从大约为每次0. 2g/kg给药到大约每次4g/kg给 药，但如果在危机时刻，则可施用更高剂量，因为所述乳剂为非毒性的。在一些情况下，本发 明的包括n-3 DG和n-3TG乳剂的欧米茄-3乳剂可在H/I后的一段时间内连续施用。
[0088] 其他的实施例包括一种方法，所述方法包括：(a)鉴选有脑缺氧-缺血风险的主 体，以及（b)给所述主体施用药物组合物，所述药物组合物包括所述n-3 Tri-DHA乳剂的有 效治疗量，从而降低主体发展成再灌注损伤的风险，所述再灌注损伤由缺氧-缺血导致。具 有发展脑H/I和心脏H/I风险