评估生物样品质量的工具和方法
【专利说明】评估生物样品质量的工具和方法 发明领域
[0001] 本发明涉及诊断方法领域。具体地，本申请涉及评估生物样品质量的方法，包括步 骤：在样品中确定表1，r，2, 2 ^，3, 3 ^，4, 5, 5 ^，6, 7,和/或8的至少一种生物标记 的量，和将该至少一种生物标记的量与参照相比较，由此评估样品的质量。本发明还涉及用 于实施上述方法的工具，例如装置和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 对于与代谢物谱分析相关的任何生物医药研究，例如潜在的生物标记鉴定和验 证，储存在生物库中的生物材料的价值由于分析前的干扰因素而减小，这些干扰因素干扰 样品代谢组（metabolome),并可能导致非均衡（unbalanced)的研究设计、增加的变异性、 不规则效应（erratic effects)、和无再现性的结果。评估生物材料的质量，对于确保用于 代谢物谱分析或其它分析方法或诊断方法的生物材料的质量和适宜性，是关键的具体地， 相关干扰因素有血液、血浆或血清样品的加工和储存时间和温度的增加、离心程序的影响、 溶血（hemolysis)、血细胞污染（例如，由于离心后血沉棕黄层（buffy layer)或血凝块的 扩散引起）、冷冻程序、预定用于血浆制备的血液样品的微凝血（例如由于血液和抗凝剂的 延迟的或不充分的混合）、和其它分析前步骤。
[0003] 存在各种用于生物库的质量保证和质量控制的标准，例如，ISO 9001，ISO指 南 34, ISO 17〇25 等等（参见，例如，Carter 2011，Biopreservation and Biobanking 9 (2): 157-163 ;Elliott 2008, Int J Epidemiology 37:234-244)。为了评估生物材料的 质量，目前，测定生化标准参数，例如样品中核酸含量和完整性、凝结活性的存在、或细胞组 成、细胞完整性和细胞数量。然而，对于代谢组分析所需要的更确定的质量评估而言，此类 标准参数的评估是不适宜的。
[0004] 可以确保用于蛋白质组分析的样品的质量的蛋白质生物标记，已有报告（参 见例如W02012/170669)。而且，已有报告，温育对血浆和血清样品的代谢组的组成有 影响（Liu et al.2010,Anal Biochem 406:105-115 ;Fliniaux et al.2011，Journal of Biomolecular NMR 51 (4) :457-465 ;Boyanton 2002,Clinical Chemistry 48(12):2242-2247 ;Bernini et al. 2011，Journal of Biomolecular NMR 49:231-243)。
[0005] 然而，仍然没有可以用于评估生物材料的代谢组质量的标准，这样的标准是高度 期望的。
[0006] 本发明的技术问题可以看作是提供可满足上述需求的工具和方法。该技术问题通 过权利要求中表征的和本文下面描述的实施方案得以解决。
[0007] 发明概述
[0008] 因此，本发明涉及用于评估生物样品质量的方法，包括步骤：
[0009] (a)在所述样品中确定表1，1'，2, 2'，3, 3'，4, 5, 5'，6, 7,和/或8中的至少 一种生物标记的量；和
[0010] (b)将该至少一种生物标记的量与参照相比较，由此评估样品的质量。
[0011] 优选地，本发明涉及用于评估生物样品质量的方法，包括步骤：
[0012] (a)在所述样品中确定表1，2, 3, 4, 5, 6, 7和/或8中的至少一种生物标记的量；和
[0013] (b)将该至少一种生物标记的量与参照相比较，由此评估样品的质量。
[0014] 根据本发明所提及的方法涵盖基本上由上述步骤组成的方法或包括另外步骤的 方法。然而，应理解的是，在优选实施方式中，方法是离体进行的（即不在人或动物身体上 实施的）方法。方法优选可以通过自动化来辅助。
[0015] 在优选实施方案中，本发明方法包含一个或多个以下步骤：
[0016] i)使所述生物样品接触特异地与至少一种本发明生物标记相互作用的试剂，和 确定在所述生物标记和所述特异地与所述生物标记相互作用的试剂之间形成的复合物的 量；
[0017] ii)使所述生物样品接触特异地与所述至少一种本发明生物标记反应的酶，和确 定通过所述酶从所述生物标记形成的产物的量；
[0018] iii)使所述生物样品接触改变至少一种生物标记的化学结构的试剂，优选地以形 成所述生物标记物的非天然衍生物，和检测所述衍生物；
[0019] iv)当评估为质量欠缺时，丢弃所述样品；和
[0020] iv)当评估为质量欠缺时，排除对所述样品的进一步分析。
[0021] 术语"评估"在本文中指，区分样品的质量就代谢分析而言是否欠缺（不足）。在 本文中，样品质量欠缺指，样品的组成不允许对代谢组的组成实现恰当的分析，而具有足够 的质量的样品允许对代谢组的组成实现恰当的分析。样品质量欠缺可能由于代谢组成在代 谢物量和代谢物化学性质方面的改变而导致不正确的分析。优选地，质量欠缺可以由于代 谢物降解和/或所述代谢物的化学改变而引起。更优选地，样品可以因分析前干扰因素的 负面影响而质量欠缺，所述干扰因素优选是长时间的加工、溶血、微凝血、细胞污染、不恰当 的储存条件、和/或不恰当的冷冻，优选缓慢冷冻。
[0022] 如本领域技术人员将理解，对于100%的受调查的样品而言，该评估，尽管优选是， 但通常可能并非都是正确的。然而，所述术语要求统计学上显著部分的样品可以被正确评 估。关于部分是否是统计学上显著的，可以由本领域技术人员使用各种熟知的统计评价工 具（例如置信区间确定、p-值确定、Student氏t检验（Student^ s t-test)、曼-怀二氏 检验（Mann-Whitney test)等）容易地确定。具体内容可见于Dowdy和Wearden，研究统 计学（Statistics for Research)，John Wiley&Sons，纽约 1983 中。优选的置信区间为至 少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%。p-值优选为0. 2、0. 1、 或 0? 05〇
[0023] 本文中使用的术语"生物标记"指用作本说明书中提及的质量减损或状况的指示 物的分子种类。所述分子种类可以是在受试者的样品中发现的代谢物本身。而且，该生物 标记也可以是衍生自所述代谢物的分子种类。在这样的情况下，实际的代谢物将在样品中 或在测定过程中被化学修饰，并且作为所述修饰的结果，一种化学上不同的分子种类（即 分析物）将成为被测定的分子种类。在这种情况下应理解，该分析物可以代表实际的代谢 物，具有作为相应质量减损的指示物的相同潜力。
[0024] 而且，根据本发明的生物标记无需对应于一种分子种类。而是，该生物标记可以包 括化合物的立体异构体或对映异构体。此外，生物标记还可以是生物学上的一类异构分子 的异构体的总和。所述异构体在一些情况下应显示相同的分析特征，并且因此是不能通过 多种分析方法（包括在下面描述的所附实施例中应用的那些方法）区分的。然而，这些异 构体可以共享至少相同的总和式参数（sum formula parameters)，并且因此，例如在脂质 的情况下，在脂肪酸和/或鞘氨醇碱基（sphingo base)部分中具有相同的链长和相同的双 键数。
[0025] 极性生物标记可以优选地通过本说明书其它部分述及的以及以下实施例中描述 的技术获得。脂质生物标记可以根据本发明获得，优选地如本说明书其它部分描述的，且尤 其是通过在蛋白沉淀后样品分离为极性水相和有机脂质相（例如，如以下实施例中所述， 通过混合乙醇和二氯甲烷）而作为脂质级分获得。这些生物标记在本文中可以标记为"月旨 质级分"。备选地或额外地，可以使用固相提取（SPE)，从样品中富集生物标记。
[0026] 在本发明方法中，测定表1，1'，2,2'，3,3'，4,5,5'，6,7,和/或8所示生 物标记物中的至少一种代谢物。更优选地，测定表la, lb, lc, Id, la'，I。，lcf，2a, 2b, 2 c, 2d, 2a' , 2b'，2c'，2d'，3a, 3c, 3a'，3c'，4a, 4b, 4c, 4d, 5a, 5b, 5c, 5d, 5'，6a, 6b, 6c, 6d, 7 a，7c，8a，8b，8c，和/或8d所示生物标记物中的至少一种代谢物。甚至更优选地，测定表 1，2, 3, 4, 5, 6, 7和/或8所示生物标记物中的至少一种代谢物。最优选地，测定表la，lb， lc，Id, 2a，2b，2c，2d，3a，3c，4a，4b，4c，4d，5a，5b，5c，5d，6a，6b，6c，6d，7a，7c，8a，8b，8c，和 /或8d所示生物标记物中的至少一种代谢物。
[0027] 优选地，在本发明方法中，测定一组生物标记以加强评估的特异性和/或灵敏度。 优选地，该组包含所述表中显示的所述生物标记中的至少2,至少3,至少4,至少5,至少 10种或多达全部所述生物标记。优选地，在本发明方法中，按表号，测定表中的至少一种生 物标记，即，表乂或乂'（其中乂是1，2,3,4,5,6,7,8)中的至少一种生物标记。更优选地，在 本发明方法中，测定表X中的至少一种生物标记，即，来自表1，2, 3, 4, 5, 6, 7和/或8之任 一中的至少一种生物标记。
[0028] 本文中使用的代谢物是指，特定代谢物的至少一个分子到多达所述特定代谢物的 许多分子。还应理解，一组代谢物是指多种化学上不同的分子，其中对于各代谢物，可存在 至少一个分子到许多分子。根据本发明的代谢物包括所有类型的有机或无机化合物，包括 包含在生物材料（例如生物体）中的那些。优选地，根据本发明的代谢物为小分子化合物。 更优选，在考虑多种代谢物的情况下，所述多种代谢物代表一个代谢组，即在特定时间和特 定条件下生物体、器官、组织、体液或细胞中所包含的代谢物的集合。
[0029] 除了本说明书中记载的特定生物标记，优选地，也可在本发明的方法中测定 其他生物标记和/或指示物。这样的生物标记可以包括肽或多肽生物标记，例如在 W02012/170669，Liu 2010上述引文，或Fliniaux 2011，上述引文中提及的那些。
[0030] 术语"样品"在本文中指，包含生物材料和尤其是代谢生物标记（包括本文中述及 的那些）的样品。优选地，本发明样品是来自体液，优选地血液、血浆、血清、唾液或尿液的 样品，或来源于（例如通过活检）细胞、组织或器官的样品。更优选，样品是血液、血浆或血 清样品，最优选是血浆样品。上述样品可源自本文别处详述的受试者。获得前述不同类型 生物样品的技术为本领域公知的。例如，血液样品可通过采血获得，而组织或器官样品可以 例如通过活组织检查获得。
[0031] 前述样品优选在它们用于本发明方法之前被预处理。如在下文更详细的描述，所 述的预处理可以包括释放或分离化合物或除去过量的材料或废弃物所需要的处理。而且， 预处理可以旨在消毒样品和/或除去污染物例如不想要的细胞、细菌或病毒。合适的技术 包括离心、提取、分级分离、超滤、蛋白质沉淀之后过滤和纯化和/或富集化合物。而且，可 以进行其它预处理从而以合适进行化合物分析的形式或浓度提供化合物。例如，如果在本 发明的方法中使用气相色谱-质谱联用，则需要在进行所述的气相色谱法之前将化合物进 行衍生。另一类预处理可以是在合适的储存条件下储存样品。此处所述储存条件包括储存 温度、压力、湿度、时间、以及用防腐剂处理所储存的样品。适宜的和必要的预处理也取决于 用于实施本发明方法的手段，且为本领域技术人员所熟知的。如前文所述的预处理的样品 也包含在本发明所用的术语"样品"中。
[0032] 本发明所述及的样品可以优选地来源自受试者。本文中使用的术语受试者涉及动 物，优选涉及哺乳动物。更优选地，受试者是啮齿类动物，最优选是小鼠或大鼠、或灵长类， 且最优选地是人。优选地，受试者疑似患有或不患有疾病或医学状况，或疑似有危险或没有 危险