操作组包括以下程序：
[0141] ?开始血液凝结
[0142] ?在0°C长时间温育
[0143] ?在室温长时间温育
[0144] ?溶血
[0145] ?白细胞污染
[0146] 鲁冷冻方案
[0147] 招募二十名健康自愿者（13名女性、7名男性），使用20号safety-fly血液收集系 统通过静脉穿刺抽取64ml血液，放入3个9ml的K 3EDTA monovette管、接着lml放入1个中 性monovette管（样品被丢弃）、接着放入1个9ml中性monovette管、接着3个9ml K3EDTA monovette管。通过颠倒，温和地混合monovette，以防止溶血。打开K 3EDTA monovette并 就各受试者分别合并。
[0148] 在如下不同组中处理每个受试者的血液：
[0149] ?开始血液凝结
[0150] 室温5min后，将9_ml中性monovette中的血液倾析到一个9-ml_K 3EDTA monovette中，在冷冻离心机中1500x g离心15分钟，制备血衆。将血衆在液氮中冷冻，并 在分析前储存在-80 °C。
[0151] ?在0°C长时间温育
[0152] 2x5ml血液合并物分别在0°C温育4h和6h。该时间段后，在冷冻离心机中1500x g离心15分钟，制备血浆。在分析前将血浆储存在-80°C。
[0153] ?在室温长时间温育
[0154] 5ml血液合并物在室温温育lh。该时间段后，在冷冻离心机中1500x g离心15分 钟，制备血浆。在分析前将血浆储存在-80 °C。
[0155] ?溶血
[0156] 使2x6ml血液合并物分别通过具有25号针头（1级溶血）和27号针头（2级溶 血）的注射剂。在冷冻离心机中1500x g离心15分钟，制备血浆。在分析前将血浆储存 在-8(TC〇
[0157] ?白细胞污染/冷冻方案/对照
[0158] 在冷冻离心机中1500x g离心剩余的血液合并物15分钟。抽取较上面的血浆上 清液，在离心管中混合。冷冻该血浆样品的等分试样，并在分析前储存在-80°C，以充当对 照。该血浆样品的其它等分试验在-20°C冷冻，并在这一天结束时转移并储存在-80°C直至 分析前（"缓慢冷冻" 一一见表7)。将较下面的血浆上清液与来自离心管的血沉棕黄层的 物质混合，导致两个级别的白细胞污染。
[0159] 本实验的血浆样品按照实施例4所述以随机化的分析顺序设计进行分析。代谢物 谱分析提供半定量分析平台，导致相对于规定的参照组的相对代谢物水平（"比值"）。为 了支持该概念，也为了允许比对不同分析批（"实验"），在整个过程中平行地运行两个不同 的参照样品类型。首先，从所有样品的等分试验产生项目合并物，在每个分析顺序中以4个 重复物测量。对于所有半定量分析的代谢物，数据相对于在每个分析顺序中合并物参照样 品的中值标化，以给出合并物标化的比值（每个代谢物，针对每个样品实施）。这可以抵消 仪器之间和之内的变异。第二，在本实验中使用12个重复样品分析了 MxPool?，合并物标化 的比值进一步相对于这些MxPool?样品的中值标化，即，来自本研究的比值，与相对于相同 MxPool?的其它等分试验标化的来自其它项目的数据，在相同水平上并因此是可比较的。来 自靶方法（二十烷酸类，儿茶酚胺类）的总量化数据与其绝对定量数据一起保留。
[0160] 数据分析：
[0161] 在统计学分析前数据进行loglO转化以接近正态分布。通过混和线性模型 (AN0VA)，以受试者作为随机截距和性别作为固定效应，计算代谢物比值改变。表2-5中的 比值是相对于该对照组表示的。
[0162] 实施例3:实验设计以分析_20°C长期储存在人血浆上的代谢影响
[0163] 设计本实验以分析_20°C长期储存对人血浆代谢组的影响，从而鉴定用于对血浆 生物库样本实现质量控制的生物标记。H)TA血液合并物等分试验分别在-20°C或液氮中冷 冻。181天和365天后，通过实施例4描述的代谢物谱分析，对储存在每个温度的各4个等分 试验样品，进行分析（在实施例3中没有分析鞘脂）。以随机化的分析顺序设计，分析血浆 样品。从所有样品的等分试样产生项目合并物，在每个分析顺序中以4个重复物进行测量。 将原始峰数据针对每一分析顺序的项目合并物的中值进行标化，以说明方法变异性（所谓 的"比值")。比值进行loglO转化以接近数据的正态分布。通过一元线性模型（ANOVA)，将 固定效应"温度"设定为"_196°C "的参照，统计学分析-20°C储存181天和365天相对于在 液氮中储存相同时间后代谢物的改变。显著性水平设定为5%的阿尔法误差。代谢物是指 示生物库样本中与增加的血浆储存时间或温度相关的质量问题的生物标记（表6)。
[0164] 实施例4用于MS分析的样品制备和MS分析
[0165] 准备人血浆样品，并如下述进行LC-MS/MS和GC-MS或SPE-LC-MS/MS (激素）分析。 从血浆中沉淀以分离蛋白质。在添加水以及乙醇和二氯甲烷的混和物后，剩余的样品分级 分离为含水的极性相和有机的亲脂相。
[0166] 对于脂质提取物的转甲醇分解（transmethanolysis)，往蒸发后的提取物中加入 140 y 1氯仿、37 y 1盐酸（37%重量的HC1水溶液）、320 y 1甲醇以及20 y 1甲苯。密封容 器并在100°C振摇加热2小时。随后蒸干溶液。使残留物完全干燥。
[0167] 在密封容器中与甲氧胺盐酸盐反应（在吡啶中20mg/ml，1001，l. 5h，60°C )，从而 进行羰基基团的甲氧氨化。作为时间标准品，加入20 yl奇数直链脂肪酸溶液（在3/7(v/ v)吡啶/甲苯中7至25个碳原子的脂肪酸各0. 3mg/mL以及27、29和31个碳原子的脂肪 酸各0. 6mg/mL的溶液）。最后，仍然在该密封容器中，用100 y L N-甲基-N-(三甲基硅烷 基）-2, 2, 2-三氟乙酰胺（MSTFA)在60°C衍生化30分钟。注入GC前的最终体积是220 y 1。
[0168] 对于极性相，衍生化以如下方式进行：在密封容器中与甲氧胺盐酸盐反应（在吡 啶中20mg/ml，501，1. 5h，60°C )，以进行羰基基团的甲氧氨化。作为时间标准品，加入10 y 1 奇数直链脂肪酸溶液（在3/7 (v/v)吡啶/甲苯中的溶液，其中7至25个碳原子的脂肪酸 各0. 3mg/mL，27、29和31个碳原子的脂肪酸各0. 6mg/mL)。最后，仍然在该密封容器中，用 50 y L N-甲基-N-(三甲基硅烷基）-2, 2, 2-三氟乙酰胺（MSTFA)在60°C衍生化30分钟。 注入GC前的最终体积是110 y 1。
[0169] GC-MS系统由与Agilent 5973 MSD偶联的Agilent 6890 GC组成。自动进样器是 来自 CTC 的 CompiPal 或 GCPal。
[0170] 对于分析，取决于分析的样品材料以及来自相分离步骤的级份，使用具有包含0% 至35%芳族部分（moieties)的不同聚甲基硅氧烷固定相的常用商业毛细管分离柱（30m x0. 25mm x0. 25 y m)(例如：DB_lms，HP_5ms，DB-XLB，DB_35ms，Agilent Technologies)。无 分流地注入多达1 yL的最终体积，并且烘箱温度程序始于70°C并终于340°C，根据样品材 料以及来自相分离步骤的级份使用不同的加热速率，以实现充分的色谱分离以及每一个分 析峰内的扫描次数。此外，分析使用RTL(保持时间锁定，Agilent Technologies)，常用的 GC-MS标准条件，例如标称1至1. 7ml/min的恒定流速，氦作为流动相气体，用70eve通过电 子轰击进行离子化，用2. 5至3次扫描/秒的扫描速率及标准调谐条件在m/z 15至600的 范围中扫描。
[0171] HPLC-MS 系统由与 API 4000 质谱仪（Applied Biosystem/MDS SCIEX，Toronto,加 拿大）偶联的Agilent 1100 LC系统（Agilent Technologies，Waldbronn，德国）组成。HPLC 分析在具有C18固定相的市售反相分离柱上进行（例如：GR0M 0DS 7 pH，Thermo Betasil C18)。注入多达10 y L最终样品体积的经蒸发和重构的极性和亲脂相，并且用甲醇/水/ 甲酸或乙腈/水/甲酸梯度以200 y L/min的流速进行梯度洗脱来实现分离。
[0172] 质谱法通过电喷雾离子化进行，其中以正模式用于非极性级份，以负或正模式用 于极性级份，采用多反应监测-(MRM)-模式和100-1000 amu的全扫描。
[0173] 血浆样品中类固醇和儿茶酚胺类的分析：
[0174] 通过在线SPE-LC-MS(固相萃取-LC-MS)测定类固醇及其代谢物。如Yamada等 A (Yamada H, Yamahara A, Yasuda S, Abe M, Oguri K, Fukushima S, Ikeda-ffada S:Dansyl chloride derivatization of methamphetamine:a methode with advantages for screening and analysis of methamphetamine in urine.Journal of Analytical Toxicology，26 (1) : 17-22 (2002))描述的，通过在线SPE-LC-MS，测定儿茶酚胺类及其代谢 物。
[0175] 血浆样品中二十烷酸类的分析：
[0176] 通过离线和在线SPE-LC-MS/MS (固相萃取-LC-MS/MS)，自血浆测定二十烷酸类和 相关代谢物。通过稳定同位素标记的标准，进行绝对定量。
[0177] 实施例5:实验设计以分析增加的血液凝结时间的代谢影响
[0178] 设计本实验以分析增加的血液凝结时间对人血清代谢组的影响，从而鉴定用于对 血清生物库样本实现质量控制的生物标记。允许145个血液样品在室温凝结l_2h。允许另 一组46个血液样品在室温凝结24h。离心凝血后的样品，移出血清上清液并冷冻。血清样 品储存在_80°C直到用于实施例4所述的代谢物谱分析（实施例5中没有分析鞘脂）。以 随机化的分析顺序设计，分析本实验的血清样品。从所有样品的等分试样产生合并物，在每 个分析顺序中以4个重复物进行测量。对于所有半定量分析的代谢物，数据相对于在每个 分析顺序中合并物参照样品的中值标化，以给出合并物标化的比值（每个代谢物，针对每 个样品实施）。这抵消了仪器之间和内部的变异。
[0179] 数据分析：
[0180] 在统计学分析前数据进行loglO转化以接近正态分布。通过一元线性模型 (AN0VA)，以处理组和性别作为固定效应，计算代谢物比值改变。表8中的数据表示为血液 的24h血液凝结期相对于直接血液加工为血清的比值和p值。
[0181]
[0182]
[01OOJ L_
[0185]
[0186]
[0187]
[0188]
[0189]
[0190] 表1 ' ：指示血浆样品中与增加的血浆样品加工时间相关的质量问题的其它生物 标记。给出了在所示温度（21°C)和时间（5h，16h)加工的样品与对照样品的相对比值以及 相应的P值。
[0191]
[0192] 表la:指示血浆样品中与增加的血浆样品加工时间相关的质量问题的优选生物 标记：基于可分析性（assayability)选择。
[0193]
[0194] 表la'：指示血浆样品中与增加的血浆样品加工时间相关的质量问题的其它优选 生物标记：基于可分析性选择。
[0195]
[0196] 表lb:指示血浆样品中与增加的血浆样品加工时间相关的质量问题的优选生物 标记：基于性能（