一种三七和淫羊藿提取物的混合制剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明提供一下三七和淫羊藿提取物的混合制剂在制备延缓心脏衰老的药物上 的应用，属于药物开发技术领域。
【背景技术】
[0002] 当今社会，老年人心血管疾病的发病率和死亡率日益增加，严重威胁着老年人的 健康。研究表明：随着年龄的增加，老年心脏呈现出左心室壁肥厚、纤维化增加，进而导致舒 张功能及射血功能障碍等，进一步加剧心血管疾病的发生。临床研究表明：72-91岁的老年 人左心室壁厚度增加，舒张期充盈度降低，主动脉僵硬度增加。因此延缓心脏衰老是当今迫 切解决的问题。
[0003] 线粒体是细胞内产生能量的场所，同时也是细胞产生活性氧（Reactive oxygen species，R0S)的场所。"自由基与线粒体衰老理论"是研究者们普遍认可衰老理论。线 粒体在病理条件下，电子传递出现障碍，导致线粒体内ROS增加，进一步损伤线粒体膜以及 mtDNA等形成恶性循环，从而导致线粒体衰老。心脏是耗能最多的器官之一，因此心脏中 含有大量的线粒体。新近研究表明：线粒体结构与功能损伤是导致心脏衰老的重要原因之 一。研究表明：老龄心肌表现出线粒体内膜通透性增加，电子漏、呼吸功能减退以及mtDNA 突变。
[0004] 沉默信息调节因子 2 (Silent information regulator 2, Sir2)是 NAD+依赖的组 蛋白去乙酰化酶（HDAC)家族成员之一，其能调控酵母、蠕虫和果蝇的生命周期，具有组蛋 白去乙酰化酶活性，哺乳动物沉默信息调节因子2蛋白（silent information regulator 2protein，Sirtuin)家族基因与Sir2基因高度同源。新近研究表明：Sirtuin家族成员 中SIRT1，SIRT3与线粒体结构和功能相关。SIRTl去乙酰化细胞内多种因子：p53, Ku70蛋 白（Ku70)等，调控线粒体的发生，进而调节细胞衰老等生物过程。PGC-Ia (Peroxisoma proliferatoractivated receptor-coactivator Ia，过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 辅 酶活因子I a )在线粒体生物发生中发挥很重要的作用。研究表明：白藜芦醇通过诱导细胞 中SIRTl，PGC-la的激活，促进线粒体生物合成从而延缓细胞衰老。SIRT3在心脏、肌肉等 组织中高表达。小分子的SIRT3定位于线粒体内膜。研究表明在盐敏感大鼠诱发的心脏衰 老模型中线粒体脱乙酰酶SIRT3蛋白减少，第一次表明了心脏衰老中线粒体蛋白的乙酰化 与SIRT3有关。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种三七和淫羊藿提取物的混合制剂在制备延缓心脏衰 老的药物上的应用。
[0006] 所述的三七提取物为三七总皂苷（TPNS)，所述的淫羊藿的提取物为淫羊藿总黄酮 (TFE)〇
[0007] 三七总皂苷与淫羊藿总黄酮的重量比为0. 2-5 :1。
[0008] 进一步优选为三七总皂苷与淫羊藿总黄酮的重量比为1 :1。
[0009] 三七总皂苷（TPNS)与淫羊藿总黄酮（TFE)的联合具有对衰老H9c2心肌细胞活力 明显增加；能显著减少β -半乳糖苷酶染色的阳性率，降低MDA含量；对衰老的H9c2心肌细 胞内ROS的荧光强度显著降低；对衰老的H9c2心肌细胞内线粒体膜电位显著增强；对衰老 的H9c2心肌细胞中的SIRT1，PGC-I a，SIRT3蛋白表达量显著增加。
【附图说明】
[0010] 图I TPNS联合TFE对衰老H9c2心肌细胞内β -半乳糖苷酶活性的影响注：
[0011] Con :正常组；D-gal :D-半乳糖组；TPNS :5 μ g/mL三七总皂苷单剂量组；TFE : 5 μ g/mL淫羊藿总黄酮单剂量组；TPNS+TFE :5 μ g/mL三七总皂苷联合5 μ g/mL淫羊藿总黄 酮组。
[0012] 图2 TPNS联合TFE对衰老H9c2心肌细胞内ROS的影响，其中，2-1为ROS荧光强 度代表图，2-2为平均荧光强度统计图。
[0013] 注：Con :正常组；D-gal :D-半乳糖组；TPNS :5 μ g/mL三七总皂苷单剂量组；TFE : 5 μ g/mL淫羊藿总黄酮单剂量组；TPNS+TFE :5 μ g/mL三七总皂苷联合5 μ g/mL淫羊藿总黄 酮组，aP < 〇· 05, vs 正常组；*P < 0· 05, vs D-半乳糖组；&P < 0· 05, vs 5 μ g/mL TPNS ;#P < 0. 05, vs 5 μ g/mL TFE。
[0014] 图3 TPNS联合TFE对衰老H9c2心肌细胞内线粒体膜电位的影响。
[0015] 注：Con :正常组；D-gal :D-半乳糖组；TPNS :5 μ g/mL三七总皂苷单剂量组；TFE : 5 μ g/mL淫羊藿总黄酮单剂量组；TPNS+TFE :5 μ g/mL三七总皂苷联合5 μ g/mL淫羊藿总黄 酮组。
[0016] 图4 TPNS联合TFE对衰老H9c2心肌细胞内SIRT1，PGC-Ia，SIRT3蛋白表达 量的影响注：4-1蛋白免疫印迹的代表图4-2:Sirtl (沉默信息调节因子1)蛋白的统计 结果4-3:PGC-la (过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅酶活因子la)蛋白的统计结果 4-4:Sirt3(沉默信息调节因子3)蛋白的统计结果1?<0. 05, vs正常组；*P<0. 05, vs D-半乳糖组；&P < 0· 05, vs 5 μ g/mL TPNS ;#P < 0· 05, vs 5 μ g/mL TFE。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1
[0018] 本发明中，细胞株H9c2心肌细胞购置于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞 库。TPNS购于成都指标化纯生物技术有限公司，纯度> 95 %。TFE购于成都仁城生物科技有 限公司，质量分数为80 %。高糖D-半乳糖（Sigma公司）。高糖DMEM (GIBC0公司，884684)。 胰蛋白酶（GIBC0公司，EC2901)。胎牛血清（GIBC0公司，10099141)，活性氧检测试剂盒（普 利莱基因技术有限公司，C1300)，四甲基偶氮唑盐（Sigma公司，03285-1KT-F)。细胞衰老 特异性β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒（上海杰美基因医药科技有限公司，GMS10012. 1); BCA蛋白检测试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司，Ρ1511)，线粒体膜电位检测试剂盒 (碧云天生物技术研究所，C2005)。活性氧检测试剂盒（碧云天生物技术研究所，S0033); SIRT3 抗体（Millipore, 2199719)。SIRTl 抗体（Millipore, 2465249) ;0-actin(谷歌生 物，GB13001)。PGC-I a (Santa Cruz, sc-13067) 〇
[0019] 具体方法：
[0020] 细胞培养：H9c2细胞用含10%血清的DMEM培养基培养，将其放置于37°C，5% CO2培养箱中培养，再取对数生长期细胞进行实验。
[0021] MTT法检测细胞活力：
[0022] H9c2细胞悬液以5X103个/mL接种于96孔板，每孔100yL，设置8组：⑴正 常组；（2)D-半乳糖组（50mmol/L) ; (3)TPNS单药组（终浓度分别为5、25 μ g/mL) ; (4)TFE 单药组（终浓度分别为5、25 μ g/mL) ; (5) PNS (5 μ g/mL)联合TFE (5 μ g/mL)用药组；（6) PNS (5 μ g/mL)联合 TFE (25 μ g/mL)用药组；（7) PNS (25 μ g/mL)联合 TFE (5 μ g/mL)用药组； (8) PNS (25 μ g/mL)联合TFE (25 μ g/mL)用药组。每个组设置6个复孔。药物作用24h后弃 去上清液，每孔加入终浓度为0. 5mg/L MTT的培养基100 μ L，培养4h后，离心弃去上清液， 每孔加入150 μ L DMS0,震荡IOmin至结晶完全溶解，立即放置在波长于490nm的酶标仪中 检测其吸光度A。
[0023] β -半乳糖苷酶检测细胞衰老程度：
[0024] H9c2细胞悬液接以I X IO5个/mL接种于24孔板中，每孔ImL,分别加入 TPNS (5 μ g/mL)单药；TFE (5 μ g/mL)单药以及 TPNS (5 μ g/mL)联合 TFE (5 μ g/mL)用药组， 每孔设置6个复孔，作用24h后，弃去上清液，每孔加入500 μ L的清理液清理细胞表面，弃 去清理液，每孔中加入500 μ L的固定液，室温孵育5分钟后，弃去固定液，每孔加入500 μ L 的酸性液清洗细胞表面，弃去酸性液，每孔加入400 μ L提前预热的染色工作液，在37°C恒 温箱孵育3到16小时，在光学显微镜下观察细胞染成蓝色的情况