稳定的fmdv衣壳的制作方法
【专利说明】稳定的FMDV衣壳
[0001] 本发明涉及兽医学和病毒学的领域。具体而言，本发明涉及口蹄疫病毒（FMDV) VP2蛋白突变体，包含FMDV VP2蛋白突变体的FMDV衣壳，分离的核酸分子，宿主细胞，活重 组载体微生物，和针对FMD的疫苗。此外，本发明涉及用于这些实施方案和使用这些实施方 案的几种方法。
[0002] 口蹄疫（FMD)是影响偶蹄类哺乳动物；偶蹄目的一种急性、全身性和高度感染性 的疾病。许多野生生物物种下一步，主要相关目标是家畜诸如牛、水牛、猪、绵羊和山羊。典 型症状是舌和蹄上的水疱；因此得到该疾病的名称。这不仅引起许多不适和继发性感染，而 且引起发烧和偶尔死亡率。此外，该疾病引起显著的经济损失，因为受影响的动物将停止移 动和进食。FMD是一种应申报的疾病，许多国家将拒绝进口来自FMD阳性地区的动物；这由 出口认证的国际系统执行（Paton 等人· 2009，Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci.，vol. 364，ρ· 2657)。
[0003] FMD由口蹄疫病毒（FMDV)引起，所述口蹄疫病毒（FMDV)是小核糖核酸病毒科的病 毒，并且是口疮病毒属的类型种。病毒粒子包含约8 kb的单链正链RNA基因组，其包含于 无包膜衣壳中。衣壳的直径为约30 nm，且具有二十面体对称。衣壳由四种结构病毒蛋白 (VP1、VP2、VP3和VP4)中每一种的60个拷贝的高度规则排列组成。这些组织于含有VPl-4中每一个的具有5S的沉降系数的原聚体亚单位中；这些原聚体中的五个形成12S的五 聚体，且完整的衣壳由12个五聚体组成。这可以是约70S的非感染性空衣壳，或具有病毒 RNA内容物的约146S的病毒粒子衣壳，其可以是感染性的（Fry等人，2005，Curr. Top. Microbiol. I mm. , vol. 288, p. 71) 〇
[0004] 作为二十面体结构，FMDV衣壳具有三个天然类型的对称轴：5重轴（5-fold axis)，其中原聚体满足组装成五聚体；以及两个轴，其中五聚体亚单位满足：对称性的2重 轴，其中相邻VP2-VP2蛋白相互作用，和3重轴，其中VP2-VP3蛋白相互作用；参见图1。
[0005] 在天然复制中，FMDV病毒蛋白被表达为命名为Pl的长多蛋白前体，其包含 VP4-2-3-1。这也是为什么FMDV VP有时通过它们在Pl上的顺序来命名的原因，由此：VP1 是1D，VP2是1B，VP3是IC且VP4被命名为1A。Pl的翻译后切割成较小部分通过非结构 FMDV 编码的蛋白 2 A-C 和 3 A-D 进行。（Chapter: Picornaviridae, : Fields Virology, 第4版，Lippincott Williams & Wilkins, ISBN-10: 0781718325)。
[0006] 为了减少FMD的发病率或严重度以及FMDV的传播，典型措施是接种、选择性剔除 (selective culling)和运动限制。然而，一些国家允许只在爆发条件下接种，因为出口认 证系统通过动物是否是FMDV血清学阳性来淘汰（condemn)动物。因此正在研究允许区分 接种和野生型感染的标记疫苗。
[0007] 传统的FMD疫苗是灭活的完整病毒制备物的佐剂化乳剂，其诱导保护水平的病毒 中和抗体。然而，因为FMDV颗粒的高感染性，病毒的操作和此类疫苗的产生需要在高水平 生物安全条件下进行，且需要有效的质量控制，特别是对病毒灭活。
[0008] FMDV是高度可变的病原体，且目前具有七种主要的血清型：0、A、C、SAT (南非地 区）-l、SAT-2和SAT-3和Asia 1。在这些血清型内，存在许多抗原性变体、亚型和准种。提 供信息的是 Carrillo 等人（2005，J. of Gen. Virol·, vol. 79，ρ· 6487)，其已经比对 了来自所有血清型的超过100种FMDV分离株的翻译的基因组序列。
[0009] 因为主要血清型之间存在较少交叉保护，通常FMD疫苗包含FMD疫苗需要针对其 保护的每种血清型的单独组分，通常作为组合疫苗。
[0010] 关于流行性，血清型A和0几乎全世界存在，而血清型C从2004年以来没有任何 爆发。三种SAT血清型在非洲和中东的几个区域中发生，且血清型Asia 1在亚洲和中东发 生。
[0011] 七种血清型在生物物理特性（主要是它们的稳定性）方面也不同。这作为FMDV 是相关的，除了具有高度感染性，也是相当不稳定的，且容易被热、酸度、剪切等灭活。尽管 如此，所有FMD疫苗需要在严格冷链物流下运送和储存。这在FMD流行的世界的（亚）热 带和发展中地区中是特殊障碍。在这方面，血清型A和Asia 1的病毒粒子比其他血清型的 病毒粒子相对更稳定，且具有6个月或更长的更可行的储存期。然而，血清型0疫苗具有非 常有限的生物半衰期，通常只有几个月。甚至更差的是三种SAT血清型的状况，显著低稳定 性仅得到针对其具有低保护能力的疫苗，甚至当施用多次时。
[0012] 因此，持续需要开发和改进安全、稳定和有效的FMD疫苗。
[0013] 通过重组DNA表达技术制备的FMD疫苗也已经研究了许多年。例如，通过在各种 系统中表达FMDV亚单位或表位，诸如无细胞表达，或在原核或真核细胞（包括植物细胞） 中的基于细胞的表达。
[0014] 另一种选择是使用空FMDV衣壳；这些比完整病毒更安全生产，并且被认为是有效 的免疫原（Rweyemamu,等人，1979，Arch. Virol., vol. 59，p. 69)。此类空衣壳可以在 以下中有效地产生：重组表达系统，诸如基于大肠杆菌（Lewis等人，1991，J. of Virol., vol. 65，ρ· 6572; Lee 等人，2009，J. Biomed. Sci.，vol. 16，ρ· 69)或病毒表达 系统，例如，使用重组牛痘病毒（Abrams等人，1995，J. of Gen. Virol., vol. 76，ρ. 3089);重组杆状病毒，使用昆虫细胞（Cao等人，2009，Vet. Microbiol·，vol. 137，ρ· I; Charleston等人，TO 2011/048353; Subramanian等人，2012，Antivir. Res·, vol. 96，p. 288)，或桑蚕（Li 等人，2012，PLoS One. 2012; 7(8): e43849);或活重组载体， 诸如重组腺病毒（Lu 等人，2008，vaccine, vol. 26，Suppl. 6，p. G48) 〇
[0015] 不幸地，经常发现空衣壳甚至比病毒粒子衣壳更加不稳定；显然，病毒RNA基因组 本身为FMDV衣壳结构提供了一些稳定作用。
[0016] 几个组已经研究了 FMDV衣壳的稳定性特征，所述FMDV衣壳在高于生理温度和低 于生理pH迅速解离成五聚体。对于疫苗使用，这是不利的，因为12S五聚体比完整衣壳的免 疫原性小得多。参见：Doel 等人（1981，Arch, of Virol·, vol. 70，ρ. 21)，和 Hegde 等 人（2009，： Editorial, Vaccine, vol. 27，ρ· 2199)。Twomey等人（1995，Virology, vol. 206，ρ. 69)研究了 FMDV A血清型的天然变体，其不那么酸敏感，这是由于VP2蛋白 的位置131和133的氨基酸取代导致的。
[0017] 为了改善FMDV衣壳的热和/或酸稳定性，几个组已经将突变引入一种或多种病毒 结构蛋白，然后使用此类VP突变体以产生FMDV病毒粒子衣壳，且测试这些的生物物理特 性；这是所谓的衣壳工程改造。
[0018] 通常，成功不同；在一定程度上，酸敏感性可以通过对VP3的位置140 - 145中 的组氨酸残基突变来降低：Martin-Acebes 等人，（2011，J. of Virol., vol. 85，p. 2733)，Liu 等人（CN 101270155)和 Ellard 等人（1999，J. of Gen. Virol·，vol. 80， ρ· 1911)。Martin-Acebes等人（同上）取代：VPl N17D (意指：VP1中的位置17的天冬 酰胺被天冬氨酸取代）。
[0019] 以类似的方式，FMDV衣壳热稳定性可以通过突变VP2和VP3蛋白的许多区域中的 氨基酸而得到一定改善：Mateo 等人（2008，J. of Virol.，vol. 82，P. 12232)，King等 人（W0 2002/000251)和 Fowler 等人（W0 2011/032348)。对于综述：]\&^611(2011，？『〇七· Eng·，Des. &Sel·，vol. 24，p. MhMateo 等人（同上）应用取代 VP2A65H，和组合 的取代：VP3 D69E / VP2 T188A。Fowler 等人（同上）在 VP2 中取代：L78S、E79A、K80R、 T88A、E131K 或 A193S ;且在 VP3 中取代：H85P 或 E196A。
[0020] King等人（同上）的方法与本工作的不同之处在于，他们试图通过引入除了非共 价键以外的共价键稳定FMDV衣壳。通过用VP2氨基酸取代为半胱氨酸，他们在对称的2重 轴处的两个相邻VP2蛋白之间引入非天然二硫键。但是，该方法只适用于稳定空衣壳，而不 能用于稳定病毒粒子衣壳。这是因为，在该方法中，所得衣壳是永久固定的，且病毒粒子衣 壳在感染宿主细胞之后不再可以脱衣壳。
[0021] King等人（同上）取代的氨基酸位于VP2蛋白的位置93(其作为其序列标识符编 号38的氨基酸编号179描述于WO 2002/000251)。该氨基酸位置在VP2蛋白的区域中，在 其天然结构中，所述区域折叠成α螺旋：VP2蛋白a A螺旋，覆盖（对于0血清型）VP2氨基 酸 88-98 (参见：Acharya 等人，1989，Nature, vol. 337，P. 709)。还关于另一种小核 糖核酸病毒人肠道病毒的脱包衣机制研究该区域（Wang等人，2012，Nature Str. & Mol. Biol., vol. 19，p. 424)，然而，该机制不同于FMDV的机制。Wang等人没有进行或暗示该区 域中的任何突变。
[0022] 尽管现有技术中进行了所有努力，但当前没有普遍适用且免疫有效的基于工程改 造的FMDV衣壳的FMD疫苗可用。
[0023] 本发明的一个目的是提供替代的FMD疫苗，其适用于所有FMDV血清型，且可以基 于FMDV空衣壳，或FMDV病毒粒子衣壳。一个进一步目的是提供改进的FMD疫苗。
[0024] 当本发明人尝试应用King等人（同上）描述的技术时，他们失望地无法应用该方 法以生成除了 A型以外的血清型的空FMDV衣壳。例如，在来自血清型0的FMDV的VP2蛋 白的αΑ螺旋中的位置93或该螺旋中的其他位置进行半胱氨酸取代。尝试产生空衣壳，然 而，完全没有形成衣壳，或衣壳将严重聚集，使它们无法用于疫苗目的。
[0025] 令人惊讶地发现，通过提供在VP2蛋白的a A螺旋的区域中包含特定氨基酸取代 的FMDV VP2蛋白突变体，而不需要引入共价键，可以满足该目的，且因此可以克服现有技术 的缺点。
[0026] 此类FMDV VP2蛋白突变体现在可以引入FMDV衣壳，其然后获得显著改善的生物 物理稳定性。所得稳定的FMDV衣壳现在可以用于产生基于病毒粒子衣壳或空衣壳的有利 FMD疫苗。
[0027] 尽管不知道确切的作用机制，且不限于任何理论或模型，本发明人推测，该区域中 的此类取代的有利效果是，这为FMDV衣壳提供了分子水平的疏水和/或静电稳定作用。据 推测，这通过增强FMDV衣壳的2重对称轴的区域中两个相邻VP2蛋白之间的分子间相互作 用而发生。这增强相邻五聚体之间的相互作用，这导致FMDV衣壳作为整体的显著改进的稳 定性。
[0028] FMDV衣壳的改进的稳定性导致相比于具有未修饰的亲本VP2蛋白的FMDV衣壳的 许多优点：可以产生更高量的含有VP2蛋白突变体的衣壳，它们可以在对冷链物流具有较 低严格要求的情况下运输，且它们提供改善的免疫应答。
[0029] 这都是意料之外的，因为先前没有描述VP2蛋白的该特定区域的非共价键突变， 或者可以预期其导致对FMDV衣壳稳定性和由此产生的FMD疫苗的此类显著改善。
[0030] 因此，在一个方面，本发明涉及口蹄疫病毒（FMDV) VP2蛋白突变体，其特征在于 VP2蛋白突变体包含位于VP2蛋白的a A螺旋中的至少一个氨基酸取代为选自Q、N、V、I、 L、M、F、Y、W和H的氨基酸。
[0031] 本发明的" 口蹄疫病毒"是具有分类种FMDV的成员的表征特征的病毒。这还包括 以任何方式由其细分，例如为亚种、准种、毒株、分离株、基因型、血清型、血清变体、变体或 亚型等的FMDV。对于技术人员显而易见的是，尽管微生物目前可以命名为FMDV，这是当新 见解导致重新分类为新的或不同的分类组时可以进行改变的分类学分类。然而，由于这不 改变涉及的微生物或其表征特征，只有其名称或分类，此类重新分类的生物体被认为仍在 本发明的范围之内。
[0032] 本发明的"VP2蛋白"是指FMDV的病毒蛋白编号2,这被称为FMDV衣壳的结构蛋 白。其具有约218个氨基酸，约24 kDa的分子量。如技术人员容易理解，FMDV固有的变异 性意味着，VP2蛋白的大小和氨基酸序列的变化将天然存在。来自大量FMDV分离株的VP2 蛋白的氨基酸序列可公开得自序列数据库诸如GenBank ?或Swiss Prot ?。
[0033] 根据本发明的VP2蛋白突变体可以是生物或合成来源的，并且可以通过分离、纯 化、组装等获得。优选地，VP2蛋白突变体通过使用重组表达技术，通过表达编码VP2蛋白 突变体的核苷酸序列而获得。
[0034] 用于本发明的VP2蛋白可以获得自FMDV，例如通过从FMDV获得编码VP2蛋白的核 酸，或其核苷酸序列。此类FMDV进而可以获得（具有适当的生物安全措施）自各种来源， 例如，作为原始野外分离株，或保藏机构，诸如ATCC或CNCM，或各个实验室和（参考）机构， 诸如 Pirbright Institute (Pirbright, Woking, UK)，这是FAO和 WHO 口蹄疫世界参考实 验室（FMD WRL)。
[0035] 用于本发明的FMDV是4、0、(：、341'-1、341'-2、341'-3或六81&1血清型中的一种或多 种FMDV ;优选地，用于本发明的FMDV是在特定时间在野外循环的一种或多种FMDV。
[0036] 更优选的是来自0、SAT-l、SAT-2或SAT-3血清型的一种或多种FMDV，因为这些血 清型缺乏稳定性的问题在野外具有最大影响。
[0037] 或者，优选的FMDV是WRL FMD推荐为高优先疫苗候选的那些；例如，在其最近报 道中，这些是：〇 Manisa、0 PanAsia_2、0 BFS、0 Campos、A 24 Cruzeiro、Asia I Shamir、 A Iran_05、A 22 Iraq、SAT_2 Saudi Arabia 和 SAT-2 Eritrea，或任何这些的等效物（WRL FMD季度报道，2012年10月-12月）。
[0038] 本发明的"突变体"是从自然界或从实验室先前未众所周知或可用的实体。根据本 发明的FMDV VP2蛋白突变体因此不同于本发明之前的现有技术中描述的VP2蛋白。具体 而言，迄今已知的FMDV VP2蛋白氨基酸序列没有资格作为根据本发明的VP2蛋白突变体。 尽管如此，根据本发明的VP2蛋白突变体可以获得自自然界，但优选为人造的。
[0039] 因此，在一个实施方案中，根据本发明的FMDV VP2蛋白突变体包含位于VP2蛋白 的a A螺旋中的至少一个氨基酸取代为选自Q、N、V、I、L、M、F、Y、W和H的氨基酸，条件是 所述取代不会导致具有现有技术中已知的氨基酸序列的VP2蛋白。
[0040] 因此，在一个进一步实施方案中，根据本发明的FMDV VP2蛋白突变体包含位于 VP2蛋白的αΑ螺旋中的至少一个氨基酸取代为选自^￥、1上、1、？、￥、1和!1的氨基酸， 条件是所述取代不会导致具有以下氨基酸序列中的一种或多种（或所有）的VP2蛋白： 一血清型0的FMDV中的90V (例如，如毒株OlBFS和/或01Μ_87中），和/或（and/ or not)血清型C中的90V(例如，CS8cl)，和/或血清型Asia 1中的90V(例如，ASIA1_ Bar2003)，和/或血清型A中的90V (例如，A22_Iraq_95)，和/或血清型SAT-I中的901 (例 如，SATl_bot)，和/或血清型SAT-2中的901 (例如，SAT2_ZM7_83)，和/或血清型SAT-3 中的 901 (例如，SAT3_KNP10_90)。 -91Y〇 一血清型A的FMDV中的93Η (例如，如毒株A22_Iraq_95中），和/或血清型SAT-I中 的 93Q (例如，SATl_bot)。 一血清型0的FMDV中的94L (例如，如毒株OlBFS和/或01M_87中），和/或血清型 C中的94L(例如，CS8cl)，和/或血清型Asia 1中的94L (例如，ASIAl_Bar2003)，和/ 或血清型A中的94L (例如，A22_Iraq_95)，和/或血清型SAT-I中的94L (例如，SAT1_ bot)，和/或血清型SAT-2中的94L (例如