Tafa4化合物及其用于治疗疼痛的用图

Tafa4化合物及其用于治疗疼痛的用图
【专利说明】TAFA4化合物及其用于治疗疼痛的用途 发明领域
[0001] 本发明涉及用于预防、减轻或治疗受试者中疼痛的新化合物。本文中还描述了药 物组合物、其制备和用途以及用于使用这类化合物和组合物预防、减轻或治疗疼痛的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 疼痛是一种与当前或潜在的组织损伤有关的令人不快的感觉体验。因此，疼痛 是多种损伤和疾病最常见的症状。存在疼痛的不同分类，例如伤害感受性（Nociceptive) 疼痛，与组织损伤和免疫细胞的浸润有关的炎性疼痛，病理性疼痛，其为由对神经系统的 损害（即神经病疼痛）或其异常功能（功能异常疼痛，如在纤维肌痛、肠易激综合征、紧 张型头痛（tension type headache)等中）所致的疾病状态。疼痛通常是短时间的，仅 持续至有害刺激消除或基础性损伤或病理已治愈，但一些疼痛状况，如类风湿性关节炎、 周围神经病、癌症和特发性（idiopathic)疼痛（在创伤或病理已治愈后持续或在没有 任何明显原因的情况下发生的疼痛），可能持续数年。长时间的疼痛称为慢性的，而快速 消退的疼痛称为急性的。传统上讲，急性和慢性疼痛之间的区分依赖于从发作起的绝对 时间间隔；最常使用的两种标志是从疼痛发作起3个月和6个月（Turk，Okifuj i，Pain terms and taxonomies of pain ；In:Bonicaj Loeserj Chapman, Turk, Butler, Bonicai s management of pain. Hagerstwon:Lippincott Williams&Wilkins，2001)，不过一些理论家 和研究者已将急性到慢性疼痛的转变设为个月（Spanswick，Main，Pain management:an interdisciplinary approach. Edinburgh: Churchi 11 Livingstone, 2000) 〇 其他人认 为持续少于30天的疼痛为急性，超过6个月持续时间的疼痛为慢性，而持续I至6个 月的疼痛为亚急性的（Thienhaus，Cole，Classification of Pain.于：Weiner，Pain management:a practical guide for clinicians. Boca RatoniCRC Press, 2002) 〇 对慢 性疼痛的一种流行的其他定义是"超出预期痊愈时间段的疼痛"，其不涉及绝对固定的持续 时间（Turk，Okifuji，2001，Pain terms and taxonomies. In Loeser，Butler，Chapman，等 Bonicai s management of pain，Lippincott ffilliams&ffilkins. ISBN 0-683-30462-3)〇 慢性疼痛可分类为癌症疼痛或良性（Thienhaus，Cole，2002, Classification of pain. In Weiner,pain management: A practical guide for clinicians, American Academy of pain Management，ISBN 0-8493-0926-3)。
[0004] 疼痛感觉由感觉神经元传递给脑，感觉神经元还称为伤害性感受器（伤害性感受 器）。伤害性感受器被视为多模式的（polymodal)，因为它们可以应答有害或强烈刺激的多 种形式，如热、机械性和化学刺激。伤害性感受器的感觉传入纤维在许多方面是异质的。例 如，感觉神经根据其直径和髓鞘形成程度分为Act、_β、_ δ和C-纤维。然后，来自末梢的 感觉输入通过涉及脊髓内的兴奋性和抑制性中间神经元的复杂环路被处理和传达给更高 级脑区域（Basbaum等，2009 ;Todd，2010)。兴奋和抑制之间的平衡对于维持正常感觉功能 是至关重要的，且这些环路的功能异常导致疼痛如炎性和神经病疼痛的形成。
[0005] 疼痛的治疗包括使用阻断神经元传递和影响感觉以及疼痛的局部麻醉剂，和减轻 疼痛且另外可能干扰炎症的化学介导物的活性的止痛剂。急性疼痛通常用药物如止痛剂和 麻醉剂管理。然而对慢性疼痛的管理是困难得多的。
[0006] 止痛剂的有效性依赖于它们怎样能阻断由疼痛受体送递至脑的神经信息。它们还 对体温有影响，升温（称为发热）或降温。止痛药物以多种方式作用于周围和中枢神经系 统；其包括扑热息痛（paracetamol)(对乙酰氨基酸，也称为醋氨酸（acetaminophen)或简 称为APAP)，非类固醇类抗炎药物（NSAID)如水杨酸盐（salicylate)，和阿片样药物如吗啡 和鸦片。
[0007] 扑热息痛/醋氨酚的确切作用机制尚未确定的，但似乎是在中枢而非周围作用 (在脑而非神经末梢）。阿司匹林和其他非类固醇类抗炎药物（NSAID)抑制环氧合酶，导致 前列腺素产生的减少。这降低疼痛以及炎症（与扑热息痛和类鸦片相反）。扑热息痛具有很 少的副作用且被认为是安全的，尽管超过推荐剂量的摄取可能导致肝损伤（这可能是严重 和致命的）和偶尔的肾损伤。NSAID易于引起消化性溃疡、肾衰竭、过敏反应和偶尔的听觉 丧失，而且其能通过影响血小板功能增加出血风险。阿司匹林在患有病毒性疾病的低于16 岁儿童中的使用与Reye氏综合征关联，该病史一种罕见但严重的肝病症。吗啡（原型阿片 样物质）和多种其他物质（例如可待因、轻考酮（oxycodone)、氢可酮（hydrocodone)、双氢 吗啡、哌替啶（pethidine))均对大脑阿片受体系统施加类似的影响。所有阿片样物质的给 药可能受阿片毒性（意识混乱、呼吸抑制、肌抽跃（myoclonic jerk)和针尖瞳孔（pinpoint pupils))、癫痫（曲马多（tramadol))限制，但在积累耐受的患者中没有剂量最高限度。
[0008] 止痛剂选择也由疼痛的类型决定：对于神经病疼痛，传统的止痛剂不那么有效， 而且经常受益于通常不认为是止痛剂的药物类别，如三环抗抑郁剂和抗惊厥药。已显 示三环抗抑郁剂，特别是阿密曲替林（amitriptyline)以似乎是中枢的方式改善对疼 痛的治疗。奈福泮（Nefopam)在欧洲用于与阿片样物质一起进行疼痛减轻。卡马西平 (carbamazepine)、加巴喷丁（gabapentin)和普瑞巴林（pregabalin)的确切机制同样是不 清楚的，但这些抗惊厥药用于治疗神经病疼痛具有不同程度的成功。抗惊厥药最普遍用于 神经病疼痛，因为其作用机制倾向于抑制疼痛感觉。
[0009] 然而，某些组合止痛剂产品可能引起显著的不良事件，包括偶然的服药 过量，最经常是由起因于这些组合的多种（且经常是非作用性）组分的混乱所致 (Murnion, Combination analgesics in adults. Australian Prescriber(33):113 - 5. http://www. australianprescriber. com/magazine/33/4/113/5)〇
[0010] 不当的疼痛治疗在外科病房、特护病房、事故和急诊科室中，在一般实践、在所有 形式的慢性疼痛（包括癌症疼痛）的管理中、和在生命护理结束时广泛存在。这种忽视扩 大到所有年龄，从新生婴儿到虚弱老人。迄今为止，尤其是在考虑神经病、炎性和/或慢性 疼痛时（此时不管是选择哪种已知的止痛剂分子治疗仍是不完全的），患者仍高度要求有 改进的疼痛治疗。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明的目的是提供用于治疗疼痛的新的和有效的组合物和方法。具体地，本发 明提出了用于预防或治疗疼痛和/的新组合物和方法，其通过调控神经元兴奋性。
[0013] 本发明的一个目的更具体地涉及TAFA4蛋白或其激动剂，用作治疗或预防受试者 中疼痛的活性成分。
[0014] 本发明还涉及一种预防或治疗受试者中疼痛的方法，所述方法包括对有此需要的 受试者施用有效量的TAFA4蛋白或其激动剂，单独地或与一种或多种对疼痛有效的另外的 活性化合物组合使用。
[0015] 本发明的另一个目的涉及一种试剂盒，其包含i)TAFA4蛋白或其激动剂，或包含 这类蛋白或激动剂的组合物，和ii)至少一种对疼痛有效的另外的不同活性化合物。
[0016] 在一个具体的实施方案中，所述TAFA4蛋白包含SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列 或与SEQ ID NO: 1或2具有至少90 %同一性的序列。所述激动剂优选包含TAFA4蛋白的肽 片段，其调控伤害性感受器或中间神经元，优选为C-纤维伤害性感受器（优选C-LTMR)或 脊髓中间神经元（优选脊髓层IIi中间神经元）的兴奋性。典型地，所述激动剂是包含具 有SEQ ID NO: 1或2的至少10个连续氨基酸残基，优选至少20, 25, 27或30个连续氨基酸 残基的片段的肽，更优选所述激动剂包含SEQ ID N0:3或4的氨基酸序列。
[0017] 在此方面，本发明的又一个目的涉及TAFA4蛋白的多肽或肽激动剂。优选地，所述 多肽激动剂包含TAFA4蛋白的片段且调控伤害性感受器或中间神经元，优选为C-纤维伤害 性感受器（优选C-LTMR)或脊髓中间神经元（优选脊髓层IIi中间神经元）的兴奋性。
[0018] 本发明适用于预防或治疗任何疼痛。具体地，其可用于治疗或预防神经病疼痛、炎 性疼痛、伤害性感受器介导的疼痛、急性疼痛、亚急性疼痛、慢性疼痛、躯体疼痛、内脏疼痛、 触诱发痛（allodynia)、痛觉过敏、或与神经损伤有关的疼痛。本发明尤其适用于治疗炎性 和/或神经病疼痛。
[0019] 所述TAFA4蛋白或激动剂可通过任何路径施用或应用，如局部、口服、经肛门、肌 内、静脉内、腹膜内、皮肤、皮下、真皮、经皮或鞘内路径。
[0020] 本发明的再一个目的涉及包含如本文中描述的TAFA4蛋白或其激动剂和优选地 包含药学可接受的载体的组合物。
[0021] 本发明的TAFA4化合物可单独或与进一步与一种或几种另外的活性化合物或治 疗组合使用。用于本发明的化合物可同时、分别或序贯地配制或施用。
[0022] 本发明的又一个目的涉及具有缺陷性TAFA4基因，更优选靶向失活的TAFA4基因 的转基因啮齿动物。这类啮齿动物优选展现增强的机械性和化学超敏性和增强的神经元超 兴奋性。
[0023] 本发明可用于治疗任何哺乳动物受试者，特别是人中的疼痛。
[0024] 附图简述
[0025] 图 I :TAFA4 特异性标记 C-LTMR。
[0026] ⑷野生型成年小鼠的 L4(n = 3 ;7· 5% ±1. 3% )和 T12(n = 3 ;19· 2% ±0. 5% ) DRG中TAFA4阳性神经元的百分比。
[0027] (B)DRG Tafa4表达数据的示意图。图中圆的大小大致与由不同分子标志物所表示 的细胞群体的大小成比例。
[0028] (C-H) Tafa4探针在成年小鼠腰（C-F)和胸（G，H) DRG切片中的原位杂交，接着是 TrkA(C)、cRet(D)、MrgprD(E)、IB4(荧光素缀合的 G. simplicifolia IB4-凝集素）（F)、 TH(G)和EGFP(H)的免疫染色或原位杂交。（比例尺=100 μ m)。
[0029] 图2 :GFP+神经元显示C-无髓鞘的伤害性感受器的许多特性。
[0030] ㈧TAFA4sfp/+(GFP+)神经元的细胞膜电容（Cm)和输入电阻（Rinput)的点状图。
[0031] (B，C) TAFA4sfp/+神经元中分离的NavL 8_、T-型Ca 2+_、IKa-和h-电流⑶和相应 频率直方图（C)。显示了测试的神经元的数目。
[0032] (D)由短2ms-去极化步骤（左边图）或长持续时间去极化和超极化步骤（右边 图）引起的TAFAf pZ+神经元中的代表性动作电位和放电（firing)应答。注意到膜超极化 上Ih介导的sag和由T型Ca 2+电流触发的延迟反弹的电位。点线指示OmV水平。
[0033] (E)应答多种感觉刺激（如指示的）的GFP+- (TAFAPfpI和GFP神经元的百分比。 右边图：在TAFA4gfp/+神经元中应答浴应用的低渗（200m0smol/l)溶液和AITC(IOOyM)引 发的钙信号的代表性例子。
[0034] (F)通过标准的8μπι机械刺激物在4种不同的TAFA4sfp/+神经元中引发的MA电 流的代表性迹线。机械性探针的速度在机械性刺激的前向运动期间是800 μπι/s。保持电 位：-100mV。右边图：快速适应（RA)、缓慢适应（SA)、超缓慢适应（uSA)和混合的MA电流的 频率分布。数据在33个TAFA4 sfp/+神经元中收集且用标准的8 μ m机械刺激物刺激。
[0035] (G)TAFA4sfp/+神经元的速度相关的发放特性。注意到当机械性刺激物以缓慢开始 速率施加时（η = 7)发放增强。
[0036] 图3 :组织损伤诱导的超敏性在TAFA4无义小鼠中增加。
[0037] ㈧在CFA注射之前和之后，使用动态Von Frey装置，TAFA4无义小鼠 （η = 12) 和WT同窝出生小鼠 （η = 11)的机械阈值。
[0038] (B-E)在角叉胶注射之前（第0天）和之后，使用4种具有递增口径 (0· 07, 0· 4, 0· 6和I. 4g)的细丝（filament)，TAFA4无义小鼠 （η = 12)和WT同窝出生小 鼠 （η = 7)的机械敏感性的时间过程。在D+7,打分是在鞘内注射2 μ g人重组TAFA4之前 和之后15分钟时。
[0039] (F-H)使用3种具有递增口径（0· 07, 0· 6和L 4g，η = 15)的细丝，TAFA4无义小 鼠 （η = 12)和WT同窝出生小鼠 （η = 13)的坐骨神经收缩（CCI)之后的机械敏感性的时 间过程。测量在CCI之前（第0天）和之后每5天测定。在D+30,打分是在鞘内注射2 yg 人重组TAFA4之前和之后15分钟时（TAFA4无义小鼠 （n = 5)，WT (η = 7))。
[0040] (I, J)在2%福尔马林注射后畏缩、咬和藤（flinching, biting and licking)行 为中花费的时间过程和总时间（以2个阶段：第一 O-IOmin和第二10-60min) (WT η = 11 和TAFA4无义小鼠 η = 12)。
[0041] (K)鞘内注射2 μ g人重组TAFA4在TAFA4无义小鼠中恢复了福尔马林引发的超敏 性至WT水平（媒介物η = 8, hTAFA4n = 8)。
[0042] 数据显示为均值土SEE *ρ〈0· 05, #ρ〈0· 01，*#ρ〈(λ 001，单向ANOVA然后是非配 对t检验。
[0043] 图4 :TAFA4无义小鼠中的层IIi神经元兴奋性。
[0044] (Al)显示来自WT (上方）或TAFA4无义（下方）脊髓切片的神经元对2s去极化 (+25)或超极化（_25pA)电流脉冲的应答的代表性记录。
[0045] (A2)由递增强度的电流脉冲（5至50pA)引发的AP的平均数目的定量。 (ANC0VA，p〈0. 01)。
[0046] (A3)在WT和TAFA4无义小鼠的层IIi神经元中由2s去极化电流脉冲（+25pA)引 发的不同时间放电的平均放电速率。
[0047] (A4)在2s超极化电流脉冲（-50和_25pA)之后反弹动作电位的平均数目。（t检 验，ρ〈0· 05)。
[0048] (BI)来自WT和TAFA4无义神经元的对从-40至-IOOmV的向后和向前电压缓变的 代表性电流应答。每条迹线代表5个连续应答的平均。（B2)在WT和TAFA4无义动物的层 IIi神经元中在升压缓变结束时测量的向外电流的峰定量（t检验，p〈0. 05)。
[0049] (Cl)在 WT 条件，和在 2OnM 重组 TAFA4、TEA (2. 5mM)和 4AP (ImM)的存在下 TAFA4 无义层IIi神经元对向后和向前电压缓变的应答。
[0050] (C2)TAFA4_层IIi神经元中在电压缓变的上升边缘结束时测量的向外电流的定 量。注意在TAFA4应用后向外电流的增加（p〈0.05)和通过4AP对该电流的阻断。
[0051] (Dl，D2)在TAFA4无义动物的层IIi神经元中在TAFA5和TAFA2 (各20nM)的表面 灌流浴（bath super fusion)之后向外电流的代表性迹线和定量。
[0052] (El)在WT中和重组TAFA4表面灌流之后低阈值向外电流的发生。
[0053] (E2)层GAD65/67阴性（左）和阳性（右）神经元的例子。图像是单共焦平面。 白色箭头指示GAD阳性体细胞的标记。
[0054] 图5 :TAFA4GFP小鼠的生成和呈现。
[0055] (A)用于触发Tafa4基因座中的同源重组以生成TAFA4敲入小鼠的基于BAC的 TAFA4GFP策略的示意图。
[0056] (B-C)使用Tafa4探针在来自WT⑶和TAFA4无义小鼠（C) (η = 5)的成年胸DRG 切片上的原位杂交。
[0057] (D)WT DRG(n = 3, 6209+/-385 在 Τ12 中和 7616+/-173 在 L4 中）和 TAFA4 无义小 鼠 （η = 3, 5933+/-324在T12中和7805+/-439在L4中）中神经元计数的总数。
[0058] (E，F)WT 和 TAFA4 无义成年小鼠 （η = 3)的 T12(B)和 L4(C)DRG 中 Ret, TH, TrkA，TrkB，TrkC和TAFA4阳性神经元的百分比。
[0059] (G，H)GFP在新生TAFA4gfp/+ (G)和全封固成年DRG⑶的横向切片上的免疫染色。
[0060] (I，I '）在来自成年TAFA4gfp/+小鼠（I)和TAFA4无义小鼠 （I '）（n>3)的腰椎脊髓 切片上GFP和PKC γ的免疫染色和IB4染色。
[0061] (J，J'）在TAFA4sfp/+ (J)或TAFA4无义成年小鼠 ?'）（η>3)的背部皮肤切片上GFP 和SlOO的免疫染色。
[0062] 比例尺=100 μ m. P>0. 1单向ANOVA然后是非配对t检验。误差棒代表SEM。
[0063] 图6 :TAFA4无义小鼠就运动活动、焦虑、发痒（itch)、急性和损伤诱导的热超敏性 而言表现正常。
[0064] TAFA4无义小鼠相比于WT同窝出生小鼠在以下测试中展现未改变的表型：使用开 场