，而优选地有 利避免有害的副作用。在一个优选的实施方案中，所述TAFA4化合物将有效管理神经病疼 痛或炎性疼痛。根据本发明的化合物还可以用于预防或治疗受试者中的慢性疼痛，所述受 试者患有一般止痛剂（如吗啡）可能长时间段施用（任选地以延迟形式）的病理如癌症、 烧伤等。依照本发明的化合物还可以与降低每日剂量的吗啡一起使用以改进患者的临床图 谱（例如通过限制拟吗啡样物质的副作用，如肠病症）。
[0107] 在一个优选的实施方案中，本发明的化合物是包含SEQ ID NO: 1的序列或与SEQ ID NO: 1具有至少90 %同一性的序列的TAFA4蛋白，或TAFA4激动剂，其优选包含SEQ ID N0:1的片段，更优选其至少30aa的片段（如SEQ ID N0:2的序列中指示的），其调控脊髓 中间神经元层IIi上存在的至少一种受体（特别是低密度蛋白LRPl受体或钾通道、或钙通 道或另一种生理学相关的受体）的活性。在一个具体的实施方案中，本发明的TAFA4化合 物有利地调控另外的受体（不同于第一受体）的活性。
[0108] 夸试者
[0109] 在本发明的背景中，患者或受试者是动物，优选为脊椎动物，典型为哺乳动物。在 一个优选的实施方案中，所述哺乳动物是人，不管其年龄或性别如何。哺乳动物可以进一步 是动物，特别是驯养或饲养动物，特别是马、犬、猫等。在一个具体的实施方案中，所述受试 者患有神经病疼痛或炎性疼痛，特别是慢性炎性疼痛。在另一个具体的实施方案中，受试者 罹患有与以任何方式启动的疼痛有关的任何疾病或状况。
[0110] 组合物
[0111] 本发明还涉及药物组合物，其包含如本文中描述的TAFA4化合物作为活性成分， 和优选地药学可接受的载体。
[0112] "药物组合物"指本发明的化合物（活性成分）与本领域中一般接受的用于投递生 物活性化合物至有此需要的受试者的介质的制剂。这类载体包括所有药学可接受的载体、 稀释剂、介质或由此支持物。该载体可以选自例如甲基-beta-环糊精、丙烯酸的聚合物（如 carbopol)、聚乙二醇和聚丙二醇的混合物、单乙醇胺和羟甲基纤维素。可以采用常规的药 学实践来向受试者提供适宜的制剂或组合物，例如以单位剂量形式。
[0113] 该组合物通常是局部止痛/抗痛觉过敏组合物。
[0114] 本发明的化合物和组合物适用于预防、减轻或治疗受试者中的疼痛，如上文描述 的。
[0115] 本发明的组合物还可以包含至少一种另外的活性化合物。该化合物可有利地选自 SAID、NSAID或阿片样药物。
[0116] 在另一个实施方案中，本发明的化合物或组合物还可以例如与意图治疗同时发生 的疾患的药剂（例如抗肿瘤药剂）一起施用。
[0117] 用于本发明的化合物可以同时、分开或序贯施用。
[0118] 产牛本发_化合物的方法
[0119] 本发明还涉及产生TAFA化合物的方法。
[0120] 本发明的TAFA4化合物（例如蛋白或肽激动剂）可通过任何常规已知的蛋白表 达方法和纯化方法产生。例如：（i)用于合成肽的方法；（ii)用于将其纯化并从活体或培 养的细胞分离的方法；或（iii)用于使用遗传重组技术产生其的方法等等（例如，记载于 例如 Molecular Cloning (Sambrook, J. , Fritsch, E. F. , Maniatis, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989)和 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel, F. M. ,John Wiley and Sons, Inc. (1989)中的标准技术）。用于本发明的优选的蛋白或激动 剂因此是分离或纯化的。如通常使用的，"分离的"指示例如蛋白或激动剂至少从其天然或 产生环境的一些组分（如细胞培养基或活生物体）分开。更优选地，蛋白或激动剂被用作 分离的或纯的材料，纯度水平高于50 %、高于60 %、高于70 %、高于80 %、高于90 %、或甚至 更优选地高于95%。然后，分离或纯化的蛋白或激动剂可与另外的成分如赋形剂或别的活 性试剂组合或混合，如下面部分中描述的。
[0121] 治疗/规稈/方案
[0122] 本文中还教导用于预防或治疗受试者中疼痛的方法。该方法的一个目的是使用如 上文定义的TAFA4化合物或组合物调控神经元兴奋性。用于预防、减轻或治疗有此需要的 受试者中伤害性感受器介导的疼痛（具体为C-LTMR介导的疼痛）的一个具体的方法包括 对受试者施用有效量的如本文中描述的TAFA4化合物或组合物。
[0123] 用于预防、减轻或治疗有此需要的受试者中的疼痛的进一步的具体方法包括对所 述受试者施用治疗有效量的如本文中描述的TAFA4化合物或组合物的步骤，其可以与至少 一种另外的活性化合物，如【背景技术】中提到的任意一种分子例如阿司匹林、布洛芬、扑热息 痛、阿片样物质等组合。
[0124] 优选地，治疗方法指治疗神经病疼痛或神经病，包括在这类神经病的症状中的任 何改善或外表迹象的任何延迟或减轻，例如其频率、烦难或不适、疼痛中的降低，或者甚至 神经病的总体消失。在具体的实施方案中，本发明的TAFA4化合物或组合物可用于在形成 疾病的首先迹象之前预防神经病疼痛或预防神经病，从而保护受试者免于受试者可能暴露 的这类神经病疼痛或神经病。
[0125] 可以根据疼痛的不同形式（即急性或慢性神经病疼痛）改变施用本发明的化合物 或组合物进行这类治疗的持续时间、剂量和频率。治疗可以是单独使用的或与其他活性成 分同时或分开或序贯组合。
[0126] 根据本发明的化合物或组合物可以多种方式或路径施用。本发明的化合物或组合 物可通过肌内、静脉内、腹膜内、皮肤、皮下、真皮、经皮、鞘内、眼部（例如角膜）或直肠途 径，或通过在炎性部位上的局部施用来施用，优选通过肌内或静脉内注射。
[0127] 典型的方案包括在一天或数天（长达一年，且包括一周至约6个月，或者其可以 是长期的）的时段内单次或重复施用有效量的TAFA4化合物。理解体内施用的本发明的 药物化合物或组合物的剂量将依赖于接受者（受试者）的年龄、健康、性别和重量、同时进 行的治疗的种类（如果有的话）、治疗频率和期望的药物效果的性质。本文中提供的有效 驾龄的范围不意图为限制性的且代表优选的剂量范围。然而，最优选的剂量将根据个体受 试者而定，如相关领域技术人员所理解和能确定的（参见例如Berkowet等编，The Merck Manual，16th edition, Merck and Co. , Rahway, N. J. , 1992 ；Goodmanetna. , eds. , Goodman and Cilmani s The pharmacological Basis of Therapeutics, 10th edition, Pergamon Press, Inc. , Elmsfordj N. Y. , (2001)) 〇
[0128] 每次治疗所需的总剂量可由多个剂量或在单个剂量中施用，优选地早至早期疼 痛症状0出现时，或者是预防性的，例如在手术之前或期间需要时。药物化合物可以单 独地或连同至少一种针对该病理或针对该病理的其他症状的其他药物一起施用。根据本 发明的化合物或组合物的有效量为约1 μ g至l〇〇mg/kg体重，优选以4-24小时的时间间 隔施用几天、或几周、或几月、或长达1年和/或其中的任何范围或值的时间段，如0.001 -0· 01，0· 01-0. 1，0· 05-100, 0· 05-10, 0· 05-5, 0· 05-1，0· 1-100, 0· 1-1. 0, 0· 1-5, 1. 0-10， 5-10, 10-20, 20-50，和 50_100mg/kg，例如 0· 05 至 100mg/kg，优选 0· 05 至 5mg/kg，例如 0· 05, 0· 1，0· 2, 0· 3, 0· 4, 0· 5, 1，2, 3, 4 或 5mg/kg，以 1-4, 4-10, 10-16, 16-24 小时为时间间 隔，达1-14, 14-28,或30-44天或1-24周或其中的任何范围或值的时间段。典型的施用时 间安排包含1 μ g至l〇〇mg/kg/天。
[0129] 本发明的化合物和/或组合物的施用的接受者可以是如本文中限定的任意受试 者，优选人。
[0130] 制剂/浓度
[0131] 根据本发明的化合物或组合物可以多种形式施用。如此，它们可以配制为软膏剂、 凝胶、糊剂、液体溶液、悬浮液、片剂、明胶胶囊、胶囊、栓剂（特别是用于与胃肠综合征有关 的疼痛）、散剂、鼻滴剂或气雾剂的形式，优选为软膏剂的形式。本发明的化合物通常以软膏 剂、凝胶、油、片剂、栓剂、散剂、明胶胶囊、胶囊等的形式施用，任何地通过确保延长和/或 延迟释放的剂量形式或装置。对于该类型制剂，有利地使用试剂如纤维素、碳酸盐或淀粉。 对于注射，所述化合物一般包装在液体悬浮剂的形式中，其可例如经由注射器注射或灌注。 在该方面，所述化合物一般溶解于盐水，生理学，等渗或缓冲的溶液等中，其与药物用途相 容且是本领域技术人员已知的。如此，组合物可含有一种或多种选自以下的试剂或赋形剂： 分散剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂等。可用于液体和/或可注射制剂中的试剂或赋形剂尤其 是甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚山梨醇酯80、甘露醇、明胶、乳糖、植物油、 阿拉伯树胶（acacia)等。理解本领域技术人员根据患者、观察到的疼痛、要治疗的区域、涉 及到的一种或多种活性化合物、施用模式等可以调整施用的流速和/或剂量。
[0132] 对于局部应用，优选将要治疗的受试者在目标区域暴露于有效量的根据本发明的 药物化合物或组合物，所述目标区域例如皮肤表面、粘膜等，其临近于要治疗的周围神经 J L 〇
[0133] 典型地，根据之前提到的标准，使用是预防性还是治疗性的和采用的局部媒介物 的性质，所述化合物以可在约50 μ g至约5mg/kg体重之间变化的本发明化合物的剂量施 用。优选的施用是肌内或静脉内或腹膜内注射。此外，通过注射施用可包含几次（2、3或4 次）施用每日，如果需要的话。另外，对于长期治疗，延迟或延长的系统可能是有利的，从而 确保受试者有效和持久的疼痛治疗。
[0134] 本发明还涉及试剂盒，其包含（i)如先前描述的TAFA4化合物或组合物，和（ii) 对疼痛有效的至少一种另外的不同活性化合物，和任选地（iii)使用该试剂盒的书面用法 说明。
[0135] 依照一个特定的实施方案，本发明还涉及适用于通过本文所述方法治疗的试剂 盒。这些试剂盒包含（i)如先前描述的TAFA4化合物或组合物，通常以本文中指示的剂量， 和（ii)含有止痛化合物，优选鸦片类化合物的第二组合物，其剂量相比于经典处方的剂量 一般降低，用于以根据本发明的有效量进行同时、分开或序贯施用。
[0136] 附图和实施例例示了本发明而不限制其范围。 实施例
[0137] I.实验规程
[0138] 所有动物（小鼠）均在标准居住条件下维持（22°C，40%湿度，12h光周期和自由 可获食物和水）。特别进行努力以最小化下面实验中使用的小鼠的数目以及应激和受苦。 所有方案均符合欧盟对于动物实验的建议。
[0139] I. 1.具有靶向性失活的TAFA4基因的tafa4_GFP KI小鼠的生成
[0140] 为了生成tafa4_GFP KI小鼠，我们使用了在胚胎干细胞中的基于细菌人工染色体 (BAC)的同源重组。最终靶向性载体在pBAC(RP23-427L8)中小鼠 tafa4基因座的209kb 基因组克隆的基础上构建，获自129SVJ "BACPAC"Resources Center(BPRC)文库（图2A)。 在使用质粒载体pL452和pCS2/venus sv40已组装的中间革El向性构建体的帮助下工程化 RP23-427L8BAC载体中的细菌重组。tafa4基因外显子1的109bp被"YFP(Venus，后文 GFP)-聚 A loxP-EM7-PGK-Neo_loxP"盒替换。以使用 Taq phusion 聚合酶（Finnzymes)得 到的27Ibp和265bp PCR产物分离同源性臂。在细菌中BAC的同源重组后，使用AscI位点线 性化最终靶向性构建体并转染到129/SV来源的胚胎干细胞CK35中。通过使用位于构建体 3'端的探针的Southern印迹和通过新霉素探针鉴定同源重组克隆。在Immunology Center 转基因设施处将两个靶定克隆注射到C57B16/J来源的胚泡中。将所得嵌合体与C57B16/J 雌性交配以产生重组等位基因的种系传递。
[0141] 将下列寡核苷酸用于基因分型PCR :
[0142] GFP 436:GAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTG,
[0143] 1585:CTGTGGAGGAAATGGTTTCAACT,
[0144] 1587:CTGCAAAGAGAAGCCAAAGCTAC。
[0145] 使杂合雄性和雌性交配以生成手册的行为测试中描述的群体。为了提高GFP对 于细胞和分子实验的可视化，我们还生成了 TAFA4GFP-NE0-系。通过使TAFA4sfp/+小鼠与 cre-deleter小鼠系杂交除去Neo盒。Neo盒的不存在由PCR确认。除了行为分析和来自 具有附接的背根的脊髓薄片的全细胞膜片钳记录外，将Cre重组的TAFA4GFP小鼠用于所有 实验。
[0146] I. 2.组织切片和原位杂交/免疫荧光
[0147] 为了获得成体组织，将小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪（ketamine/xylazine)的混合物 深度麻醉，然后用低聚甲醛4%于PBS(PAF)的冰冷溶液经心脏灌注。在解剖后，将其在相 同固定剂中在4°C后固定（postfix)至少24h。PO收集到冰冷的PBS IX中，轻柔清洗，并 在4% PAF中固定24h。对于皮肤免疫荧光，从麻醉的小鼠切取躯干皮肤并在15% (v/v) 酸苦味酸-2%甲醛中在4°C直接固定24h。然后，将组织转移到30% (w/v)蔗糖溶液中 用于冷冻保护，接着冷冻并储藏于_80°C。使用标准低温恒温器（Leica)将样品切片（12 至40 μ m)。按照标准方案实施原位杂交和免疫荧光（Moqrich等，2004)。使用基因特异性 PCR引物和来自胚胎或成年小鼠 DRG的cDNA模板合成RNA探针（Tafa4, TH, Vglut3, TrkB，M rgprD，SCG10)。更具体地，使用地高辛和/或荧光素/生物素标记的探针的组合实施原位杂 交。将探针在55°C过夜杂交，并将载玻片与辣根过氧化物酶抗地高辛/荧光素/生物素抗 体（Roche)温育。使用焚光素/cy3/cy5TSA plus试剂盒（Perkin Elmer)实现最终检测。 对于双荧光原位实验，将第一抗体使用H2O2处理失活。
[0148] 将以下寡核苷酸用于巢式PCR的探针合成：
[0149] tafa4-Fl:TGCTCAGAAGTTCATAGCCAAA,
[0150] tafa4-Rl:TAAAGGAACATTTGCAAGCTCA,
[0151] tafa4-F2:ATATGTGCAGTGTGG,
[0152] tafa4-R2+T7:TAATACGACTCACTATAGGGCAGCCAAGTTCAAAC,
[0153] TH-Fl:AAGCCAAAATCCACCACTTAGA,
[0154] TH-Rl:CCGTGGAGAGTTTTTCAATTTC,
[0155] TH-R2+T7:
[0156] TAATACGACTCACTATAGGGAGAGATGCAAGTCCAATGTCCT,
[0157] Vglut3-Fl:TAGCTCAGTTTCCAGGAATGGT,
[0158] Vglut3-Rl:GGAGATCTAACAACATCTGATAACAC,
[0159] Vglut3-F2:CCCCCTAGAGTATCAGGAATTT,
[0160] Vglut3-R2+T7:
[0161] TAATACGACTCACTATAGGGTGGGAAGTTTTAAAAATCTATGATTAG, TrkB-Fl:
[0162] CTGAGAGGGCCAGTCACTTC,
[0163] TrkB-Rl:CATGGCAGGTCAACAAGCTA,
[0164] TrkB-F2:CAGTGGGTCTCAGCACAGAA,
[0165] TrkB-R2+T7:
[0166] TAATACGACTCACTATAGGGCTAGGACCAGGATGGCTCTG,
[0167] MrgprD-Fl:GGGCATCAACTGGTTCTTACTC,
[0168] MrgprD-Rl:AGGGATTGTCTTGACTGTCG,
[0169] MrgprD-F2:AACGGGATGTGAGGCTACTTTA,
[0170] MrgprD-R2+T7:
[0171] TAATACGACTCACTATAGGGATTTATGCCTTGACTTCCCTGA,
[0172] SCGlO-Fl:GCAATGGCCTACAAGGAAAA,
[0173] SCGlO-Rl:GGCAGGAAGCAGATTACGAG,
[0174] SCG10-F2:AGCAGTTGGCAGAGAAGAGG,
[0175] SCG10R2+T7:
[0176] TAATACGACTCACTATAGGGGGCAGGAAGCAGATTACGAGo
[0177] 对于免疫荧光，将一抗在PBS-IO %驴或山羊血清（Sigma) -3 %牛白蛋白 (Sigma)-O. 4% Triton X-100中稀释并在4°C过夜温育。一抗浓度和参照为：家兔抗TrkA 1:1000 (Interchim)，山羊抗 TrkC 1:1000 (R&D Systems)，山羊抗 Ret 1:500 (R&D Systems)， 家兔抗 CGRP l:2000(Chemicon)，鸡抗绿色荧光蛋白（GFP) l:1000(Aves Labs)，家兔 抗 PKC γ 1:1000 (Santa Cruz Biotechnology)，抗 S1001:400 (Dako)，和山羊抗小清蛋白 (parvalbumin) 1:1000 (Swant)。将相应的驴或山羊抗家兔、抗鸡和抗山羊Alexa 488、555 或647(Invitrogen或Molecular probe抗体）用于次级检测。以1:100使用异凝集素 IB4 缀合物对 Alexa FluorR 568 (Isolectin