为累积时间。对第一阶段（0-10 min)和第二阶段（10-60 min)记录展现这些疼痛 行为花费的时间。
[0224] II. 4. B.使用致瘙痒剂48/80的发痒测试
[0225] 致瘙痒剂 48/80 (Sigma-Aldrich, C2313)在 PBS IX 中以 2 μ g/ μ 1 制备。将 100 μ g(50 μ 1)注射到小鼠颈。计算发痒累积时间达40分钟。
[0226] IL 4. CCFA 注射
[0227] 使用Hamilton注射器将10 μ 1的完全弗氏佐剂（CFA)注射到麻醉小鼠的左后爪 中，以产生炎症和在伤害感受性感知中的改变。在注射后24小时，评价注射爪中急性炎症 的迹象，如水肿和发红。在注射前（第0天）以及CFA注射后1、3和7天（仅对于机械性） 测量对热和机械刺激的应答。未注射的右后爪充当对照。
[0228] II. 4. D.角叉胶注射
[0229] 使用Hamilton注射器将20 μ I PBSlX中1 % λ -角叉胶 Sigma-Aldrich, 22049-5G-F)注射到小鼠左后爪中。
[0230] 对于角叉胶模型，在注射之前和之后使用具有4种不同弯曲力（0. 07, 0. 4, 0. 6和 1.4g)的Von Frey发丝评价机械性触诱发痛和痛觉过敏。对于每种细丝，应用两次五种刺 激，时间间隔为3至5秒。未注射的右后爪充当对照。
[0231] II. 4. E.单侧周围单一神经病
[0232] 对于坐骨神经长期收缩（CCI)模型，在用氯胺酮（40mg/kg ip)和甲苯噻 嗪（5mg/kg ip)麻醉的小鼠中诱导单侧周围单一神经病（Unilateral peripheral mononeuropathy)，将3个络肠线（4_0)绑带松散地（有约Imm间隔）绑在总坐骨神经 (common sciatic nerve)周围（Bennett 和 Xie, 1988) 〇
[0233] 将神经收缩至几乎不能区分的程度，从而使得经由神经外膜血管系统的循环不被 中断（Descoeur等，2011)。对于长期收缩模型，在手术之前和手术后每隔5天使用具有3 种不同弯曲力（0.07,0. 6和1.4g)的Von Frey发丝评价机械性触诱发痛和痛觉过敏。对 于每种细丝，应用两次五种刺激，时间间隔为3至5秒。
[0234] II.4. F.鞘内注射重组TAFA4
[0235] 体积为 10 μ 1 的 TAFA4 (200 μ g/ml，人重组 TAFA4, R&D systems)或媒介物（PBS) 的鞘内（i.t.)注射在福尔马林测试前15min完成。通过腰带将小鼠放在一只手中，并将连 接于20 μ I Hamilton注射器的25号针插入腰椎骨L5和L6之间的蛛网膜下间隙中，直至 引发甩尾。
[0236] III.结果
[0237] III. I. TAFA4是C-LTMR的特异性标志物
[0238] 有意思的是，发明人发现Tafa4转录物在成年DRG和三叉神经神经元中高度富集。 使用原位杂交，发明人证明Tafa4转录物分别在总的腰（L4)和胸（T12)成年DRG神经元的 约8%和19%中表达（图1A)。双荧光标记实验显示Tafa4从TrkA +神经元完全排除，并鉴定 出Ret+神经元的子集（图IC和ID)。TAFA4 +神经元不结合IB4且完全不同于mrgprd +神经 元（图IE和1F)。相比之下，TAFA4主要与TH和VGLUT3共表达（图1G)。使用VLUT3-EGFP DRG切片（Seal等，2009)，发明人发现92+/-4%的TAFA4 +神经元共表达EGFP且94+/-6% 的EGFP+神经元共表达TAFA4 (图1H)，从而鉴定了 TAFA4是C-LTMR的特异性标志物。与TH 和VGLUT3形成对比的是，TAFA4几乎局限在DRG和三叉神经神经元，在中枢神经系统神经 元（即在松果体缰中和脑干及下丘脑的核中的神经元分散群体中）低表达。
[0239] III. 2.表达TAFA4的神经元展现机械-伤害性感受器的特性
[0240] 为了研究TAFA4在C-LTMR中的作用，发明人生成了敲入小鼠模型，其允许遗传性 标记表达TAFA4的神经元并以靶向性方式（即不影响未知基因）消除TAFA4蛋白（图5A)。 发明人首次确认TAFA4转录物在TAFA4 SFP/SF%ie合小鼠（本文中的TAFA4无义小鼠）中完全 消除（图5B和5C)。GFP+神经元中心投射到层II的最内层并专有地周围性促使皮肤的多 毛部分受神经支配（projected to the innermost layer of lamina II centrally and exclusively innervated the hairy part of the skin peripherally)(图 5G-5J) 〇
[0241] 使用膜片钳记录和钙成像，发明人发现GFP+神经元展现C-无髓鞘伤害性感受器 的许多特性，包括小细胞电容、高输入电阻、短持续时间动作电位没有在复极化阶段中的突 出峰、和TTX抗性NavL 8、低阈值T型Ca2+ (ICaT)、A型K+电流（IK A)和超极化激活的h (Ih) 电流的显著的伴随表达（图2A-2C)。ICaT介导的反弹电位也在复极化时典型观察到（图 2D)。1心的激活在分别应答正或负电流步骤的动作电位（AP)或反弹电位的发生中导致延迟 (图2D和6)。这些不同电流的同质性存在以独特的方式塑造了细胞放电（cell firing)， 由于、对负电流步骤有去极化"sag"应答且应答去极化电流步骤在AP放电中有'缺口 '。 这些激活特性可用作将表达TAFA4的神经元分类的特定标准。
[0242] GFP+神经元不应答许多假定的伤害感受性试剂（包括辣椒素、薄荷醇、孕烯醇酮硫 酸盐和5HT)或快速降温（图2E)。相反，GFP +神经元展现出对TRPAl激动剂、异硫氰酸丙 烯酯（AITC)和对低渗溶液（图2E)的不同应答，表明在C-LTMR中的一些功能异质性。
[0243] 使用离体皮肤神经制备物已确定了 C-LTMR的经典特征，包括缓慢传导速度、应 答轻微机械力的突起队伍（trains of spikes)和对持续机械刺激的缓慢适应（Bessou 等，1971 ;Li 等，2011 ;Seal 等，2009 ;Woodbury 等，2001)。对 GFP+神经元的细胞体应用 机械力揭示了在测试神经元的95%中存在机械性激活的（MA)阳离子电流（图2F和2G)。 尽管偶尔可能遇到快速适应的MA电流（15% )，但缓慢和超缓慢适应的MA电流在GFP+神经 元中为主要的（分别为21. 3和57. 9% )(图2F)。所有这些电流是阳离子和非选择性的， 具有范围从-2至+4mV的逆转电位。与M电流的缓慢适应特性一致，缓慢速度变化刺激能 触发AP (图2G)，指示机械感觉性GFP+神经元应答缓慢运动刺激。
[0244] 结论为，所有上述表达数据与钙成像和电生理学记录组合，显示TAFA4+神经元展 现出C-无髓鞘机械-伤害性感受器的生理学特性。
[0245] III. 3. TAFA4无义小鼠形成严重的损伤诱导的机械和化学超敏性
[0246] 为了洞察TAFA4在C-LTMR中的功能作用，发明人对TAFA4无义小鼠进行在急性、 炎性和神经病疼痛条件下的大批体觉测试。TAFA4无义小鼠就体重、开场（图6A)和转杆 (图6B)概况（profiles)而言似乎正常，证明TAFA4无义小鼠在运动活性或焦虑中无异常。 发明人发现在热板中（图6C)、趋温性梯度测定中（图6D)或Hargreaves测（图6E)试以 及冷板、两温度选择和动态冷和热板测试中WT和TAFA4无义小鼠之间无差异。然后，发明 人测试了 TAFA4无义小鼠在急性、炎性和神经病疼痛条件下感知机械刺激的能力。
[0247] 在完全弗氏佐剂（CFA)模型中，使用自动化Von Frey装置测量机械敏感性（图 3A)。两种基因型均显示在CFA注射后24小时对于处理爪的撤回阈值的显著降低。当在 CFA后3天测试时，TAFA4无义小鼠相比于WT小鼠展现显著降低的撤回阈值。
[0248] 在炎症后7天两种基因型实现完全恢复。为了进一步探索TAFA4在机械敏感性中 的作用，发明人使用Von Frey细丝应答角叉胶（图3B-3E)。与CFA模型一致，TAFA4无义 小鼠在处理后3天和7天时显示应答所有测试细丝的延长的疼痛超敏性。非常有意思的 是，使用包括最细口径〇. 07和0. 4g的所有细丝，TAFA4无义小鼠在早至角叉胶处理后1和 3小时就显示出增强的机械超敏性，表明TAFA4在触觉触诱发痛中的重要作用（图3B-3E)。
[0249] 最后，为了评价TAFA4在神经病疼痛中的作用，发明人使用了坐骨神经长期收缩 (CCI)模型（图3F-3H)。TAFA4无义小鼠对于所有测试的细丝展现出延长的机械超敏性表 型，从而证明了 TAFA4在神经病疼痛中的作用。
[0250] III. 4.人重组TAFA4在TAFA4无义小鼠中完全拯救了机械和福尔马林诱导的疼痛 超敏性
[0251] 在角叉胶后7天或CCI后30天鞘内施用2 μ g的人重组TAFA4均将在TAFA4无义 小鼠中观察到的超敏性表型逆转至WT水平（图3B-3H，第7天+TAFA4和第30天+TAFA4)。
[0252] 为了测试TAFA4无义小鼠中增强的机械超敏性是否是形式（modality)特异性的， 发明人实施了福尔马林测试（图31和3J)。足底（Intraplantar)注射10 μ 1的2%福尔 马林在两种基因型中触发了有力的第一疼痛应答。TAFA4无义小鼠在第二阶段展现急剧升 高的应答，表明在这些小鼠中增强的中枢敏化。重要的是，在福尔马林注射前15分钟鞘内 施用TAFA4使得TAFA4无义小鼠中的福尔马林诱导的超敏性逆转至WT水平（图3Κ)。
[0253] 总之，上述结果证明需要TAFA4来维持损伤诱导的机械和化学疼痛超敏性的正常 阈值。
[0254] III. 5. TAFA4无义小鼠中的层IIi神经元展现增加的兴奋性
[0255] 为了进一步探索由TAFA4丧失诱导的中枢敏化表型，发明人实施了在来自WT (η = 19)和TAFA4无义小鼠 （η = 25)的背根附接的脊髓薄片中的层IIi神经元的全细胞记录。 然而，注射具有递增幅度（0_50ρΑ)的去极化电流脉冲在TAFA4无义神经元中比在WT中引 发更多的动作电位（图4Α1和4Α2, ANCOVA，ρ〈0. 001)。该效应在去极化电流脉冲开始时甚 至更为突出，因为在适应与WT神经元的那些可比的放电速率之前，TAFA4无义神经元在电 流脉冲开始时显示增加的放电频率（图4Α3)。此外，注射超极化电流脉冲（-50或-25ρΑ) 在TAFA4无义神经元中比在WT中引发更高的反弹AP (图4Α1和4Α4,分别为ρ = 0. 049和 P = 0. 001)。总之，这些数据显示TAFA4无义小鼠中层IIi神经元的增加的兴奋性。
[0256] 在TAFA4无义小鼠中观察到的差异显示对缓慢失活低阈值电流的不同调节。为 了表征这些电流，发明人使用对称电压缓变方案（-40至-120并返回至-40mV)测量了 以-40mV在层IIi神经元中引发的向外电流。虽然在WT神经元中在爬升电压缓变结束时 能观察到具有缓慢脱敏的向外电流，但该电流在TAFA4无义神经元中几乎不存在（图4B1 和4B2, ρ = 0. 001)。由于鞘内施用的重组TAFA4减少了有损伤的TAFA4无义小鼠中的过大 疼痛行为，发明人检查了对来自TAFA4无义小鼠的层IIi神经元上添加重组人TAFA4的作 用。发明人发现外源应用TAFA4(20-30mn，20nM)诱导了向外电流的表达，类似于在对照条 件下（即无 TAFA4)在来自WT动物的神经元中观察到的（图4C1和4C2，n= 19，ρ〈0·001)。 该电流未受外部TEA (2. 5mM, η = 3)影响，但被4ΑΡ (ImM)完全阻断，如此证明牵涉A型电流 药理学即钾离子通道。这些作用是TAFA4特异性的，因为添加重组TAFA5(n = 5,图4D1和 4D2)或TAFA2(n = 6,图4D2)不能从TAFA4无义神经元引发这种低阈值向外电流。
[0257] 在TAFA4添加后，通过两条高斯曲线的混合最佳拟合层IIi神经元中向外电流强 度的分布，从而揭示两种不同群体的存在：三分之一的神经元展现显著的向外电流而剩余 神经元微弱地或不受TAFA4浴应用影响（图4E1)。对TAFA4应答神经元的表型表征显示 TAFA4在GAD阳性和GAD阴性神经元两者中引发类似的向外电流（图4E2)。
[0258] 该实验数据显示TAFA4压制谷氨酸能（glutamergic)兴奋性（GAD-)和GABA能 (GABAergic)抑制性中间神经元（GAD+)的子集，优选地通过激活低阈值向外电流。具体地， 由于兴奋性传递似乎在脊髓胶状质（substancia gelatinosa)(对应于脊髓层II)中主导 感觉处理，通过TAFA4对GABA能和谷氨酸能神经元的这类双重压制的净结果将由兴奋性传 递中的降低主导，由此降低传递到层I投射神经元的伤害感受性信息的量。如此，根据本发 明的TAFA4化合物通过降低脊髓中间神经元中的兴奋性传递减少伤害感受性信息。
[0259] 在低阈值电流中，Ih和T型钙电流也可以塑造层IIi神经元的激活。为了表征WT 和TAFA4无义小鼠中的Ih样电流，发明人量化了超极化引起的sag，其通过测量应答超极 化电流脉冲的峰和稳定态电位之间的差异（图7B1)。发明人发现由方波电位脉冲（square potential pulse)(见方法）引起的分离的T型电流在WT中经常比TAFA4无义小鼠中弱 (图7C1)。统计学分析揭示了在TAFA4无义层IIi神经元中相比于WT在T型电流密度中 的显著增加（图7C2 ;p = 0· 001)。
[0260] 总之，上述结果指示TAFA4直接或间接调控层IIi神经元中低阈值向外电流的强 度。
[0261] IV.鞘内TAFA4在有神经病疼痛的动物中的Ih痛效果
[0262] IV. 1.神经病疼痛模型SNl
[0263] 使用 SNI 模型（Spared Nerve Injury，由 Decosterd 和 Woolf 开发，2000 ;疼 痛，Vol. 87, p 149 - 158)。SNI模型包含胫骨分支和坐骨神经的腓总神经的横切面：腓肠神 经保持完整。然后后者形成神经病疼痛的迹象，具有实质性的机械性触诱发痛。SNI模型具 有许多优点：
[0264] .神经病疼痛是持续的。这允许在重复TAFA4的注射时把握住惯化现象。
[0265] ?生成的疼痛是有力的。
[0266] .模型是完全可复制的。
[0267] IV. 2.剂量-效果研究
[0268] 为了测定最佳浓度，在《快速》炎性疼痛模型上进行第一测试（1 %角叉胶）。
[0269] 方法:
[0270] 使用18只8周龄的雄性TAFA4 - KO小鼠。
[0271] 将重组人 TAFA4(#5099 - TA, R&D,批次 #PXC0213101)以 3 种不同浓度（12. 5 μ g/ mL, 50 μ g/mL 和 200 μ g/mL)重悬于 0· 9 % NaCl 中。
[0272] 使用上/下调方法的Von Frey细丝测量来测定基线。
[0273] 在后爪中足底注射20 μ 1的角叉胶（1% )。
[0274] 在注射后4h测量应答阈值以检查炎性疼痛的发生。
[0275] 24h后，进行新的测量。
[0276] 然后，实施盲式鞘内注射3种不同浓度的10 μ I TAFA4溶液（η = 6至12. 5 μ g/ mL ;n = 5 至 50 μ g/mL ;n = 6 至 200 μ g/mL)。
[0277] 在注射后30分钟进行对应答阈值的测量。
[0278] 结果:
[0279] 结果显示于图8。在注射角叉胶后4小时观察到机械触诱发痛的发生，且在24h后 维持。注射10 μ 1的每种TAFA4溶液诱导了对Von d' rFrey细丝的阈值应答中的强烈增 加。3种测试的浓度在由角叉胶诱发的疼痛中诱导了统计学显著的降低（*p〈0. 05)。
[0280] 将这些浓度（12. 5 ;50和200 μ g/mL)用于随后测试通过在SNI神经病疼痛模型上 鞘内注射的TAFA4的止痛效果。
[0281] IV. 3. SNI动物中的鞘内注射
[0282] 方法:
[0283] 实验在8周龄WT C57B16小鼠上进行。使用42只小鼠。将重组人TAFA4 (#5099 -TA, R&D,批次 #PXC0213101)以 3 种不同浓度（12. 5 μ g/mL, 50 μ g/mL 和 200 μ g/mL)重悬于 0. 9% NaCl中。将200 μ g/mL BSA溶液用作阴性对照。在通过上/下调方法使用Von Frey 细丝测量了小鼠的基底阈值后，将SNI模块设定到位。将小鼠麻醉，执行胫骨神经和腓骨神 经的绑扎，然后切断这两个神经。保持完整的腓肠神经相当快地形成神经病。手术后3天， 确定神经病的发生。由此观察到身体同侧爪的应答阈值到Von Frey细丝的降低。
[0284] 手术后7天，再次测量应答阈值。然后盲式鞘内注射10 μ 1的3种TAFA4溶液的 每种（n = 10 为 12. 5 μ g/mL ;n = 10 为 50 μ g/mL ;η = 9 为 200 μ g/mL)和 BSA 溶液（η = 10) 〇
[0285] 在注射后30分钟、2小时、4小时、6小时和24h测量应答阈值。
[0286] 结果:
[0287] 结果呈现于图9。在鞘内注射后，注射后快达30分钟时就观察到对于3种TAFA4 溶液应答阈值的显著增加。在另一方面，BSA的注射对于小鼠的应答阈值无影响。2h后，对 于3种浓度止痛效果维持在其最大值处。4h后，接受2 μ g TAFA4注射的小鼠仍展现出高应 答阈值（#:P〈〇. 01 ;*:P〈〇. 05)。在TAFA4或BSA溶液的鞘内注射后，我们还监测了对侧爪 的应答，且未观察到统计学差异（见图10)。
[0288] 这些结果显示3种测试的TAFA4浓度的鞘内注射导致对神经病疼痛的实质性可比 的止痛效果。最强浓度（200 μg/ml，即2yg TAFA4)的效果持续更久。此外，TAFA4不抑制 感觉神经元的神经脉冲活性，如由缺少对侧爪应答中的变化指示的。
[0289] V.皮下TAFA4在有神经病疼痛的动物中的I卜.痛