，NaC15g，MgSO4 · 7Η200· 25g，高温灭菌。
[0029] S 基础液（IL) :NaC158. 5g，K2HPO4IOg, KH2P046g ;补充蒸馏水至 lOOOmL，高温灭菌。
[0030] IM柠檬酸钾（IL):梓檬酸· H2020g，柠檬酸钾· Η20293· 5g，补充蒸馏水至lOOOmL， 高温灭菌。
[0031] Trace (IL) ：Sodium. EDTA1. 86g, FeSO4* 7H2〇〇. 69g, MnCl2 · 4Η200· 2gCuS04 · 5Η200· 29g，ZnSO4 · 7Η200· 025g，补充蒸馏水至 1000 mL,高温灭菌。
[0032] S 液（IL) :，1M 柠檬酸钾 10mL，Tracel0mL，lM CaCl23mL，lM MgS043mL，5mg/mL 胆 固醇lmL，补充S基础液至1L,临用前配制。
[0033] 仪器
实验动物 秀丽隐杆线虫株：秀丽隐杆线虫突变体MT2124,基因型为：let-60(nl046sd, gf)IV，购 买于 The Caenorhabditis Genetics Center(CGC)0
[0034] 细菌株：尿啼陡渗漏突变型大肠杆菌0P50,购买于The Caenorhabditis Genetics Center (CGC)〇
[0035] 具体实验步骤： 线虫的培养：将线虫接在涂有大肠杆菌0P50的固体NGM板上，然后将放在20°C的培养 箱中培养，当线虫长到成虫时进行同步化处理。
[0036] 线虫同步化：用M9缓冲液将平板上的线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管； 4000印111/1^11离心31^11，去除上清 ；加入裂解液（终浓度：3.2%恥(：10和1]\1恥0!1);在涡旋 仪上震荡7min，使线虫的虫体破裂释放卵；4000rpm/min离心3min，去除上清，收集沉淀获 得大量的线虫卵；M9缓冲液冲洗两次，加入1ml M9缓冲液，置于20°C培养箱中孵化48小 时。
[0037] 药物作用：将生脉散醇提物稀释一定的浓度，同步化后的线虫稀释到80条/20 μ 1 左右，在96孔板中，每个孔中加 S液120 μ 1，虫液20 μ 1，20 μ 1的10mg/ml大肠杆菌0Ρ50， 5mg/ml的胆固醇20 μ 1，合适稀释的药液20 μ 1，每个浓度设置五个平行。空白对照组不加 药液，将药液换成S液。20°C恒温培养至线虫成熟，在显微镜下检测线虫的野生型比例。结 果如下表所示 ： 表1生脉散醇提物抑制ras通路过度激活生物活性测定及对秀丽隐杆线虫 突变体MT2124生长的影响
表1的实验结果表明，生脉散水煎剂与生脉散醇提物均能显著抑制ras通路过度激活， 提高线虫的野生型比例。其中，生脉散水煎剂与经无水乙醇提取的生脉散醇提物药效最好， 但是，生脉散水煎剂与生脉散醇提物相比毒性大，会引起线虫大量死亡。其中，使用无水乙 醇提取获得的生脉散醇提物的活性最高，毒性也较低。
[0038] 本发明中生脉散醇提物在保留生脉散水煎剂抑制ras通路过度激活效果的同时， 毒性大大下降，尤其是经无水乙醇提取获得的生脉散醇提物，几乎不会引起线虫死亡。因 此，相比前者，本发明的生脉散醇提物毒性更小，效果更好。
[0039] 实施例三生脉散醇提物对秀丽隐杆线虫MT8189 (lin-15突变失活）的作用 实验材料：秀丽隐杆线虫MT8189,多阴门表型，基因型：lin-15 (n765)X，购自 CGC(Caenorhabditis Genetics Center);大肠杆菌0P50(尿啼陡渗漏突变株）作为秀丽隐 杆线虫的食物，购自 CGC(Caenorhabditis Genetics Center)。
[0040] 具体实验步骤：同实施例二。
[0041] 秀而隐杆线虫中，在lin-15 (n765) X位于ras的上游，正常情况下抑制ras基因的 表达，MT8189线虫株系中该基因失活导致线虫呈多产卵器表型。
[0042] 生脉散醇提物不能抑制lin-15 (n765)X的多阴门表型（突变率仍然为100% )， 根据遗传上位的原则，生脉散醇提物既然可逆转其下游的let60/raS原癌基因过度激活 导致的多阴门表型，那么也抑制MT8189的多阴门表型，但本实验中未观察到预期结果，即 生脉散醇提物不能抑制let60/ras上游基因 lin-15(n765)X的多阴门表型。这可能是由 于1111-15(11765)乂线虫中包含的是野生型1的60/^ &8拷贝，生脉散醇提物仅仅对过表达的 let60/ras起作用，对野生型let60/ras不敏感，即生脉散醇提物仅仅作用于过度激活的 Ras蛋白，对野生型Ras蛋白不敏感，这说明生脉散醇提物仅仅作用于ras原癌基因过度激 活的引起肿瘤细胞，而不作用于正常的细胞。
[0043] 实施例四生脉散醇提物对秀丽隐杆线虫CB1275 (lin-Ι突变失活）的作用 实验材料：秀丽隐杆线虫CB1275基因型：lin-l (el275) IV购自CGC(Caenorhabditis Genetics Center);大肠杆菌0P50 (尿嘧啶渗漏突变株）作为秀丽隐杆线虫的食物，购自 CGC0
[0044] 具体实验步骤：同实施例二。
[0045] lin-Ι是ras下游的一个基因，是可被MPK磷酸化的核转录因子，是阴门发育的负 调节因子，调节let-60下游的阴门发育的信号通路。Iin-I突变失活后，线虫为多阴门表 型。由于Iin-I为核转录因子，调节阴门细胞发育的过程。若药物对该基因失活突变的多 阴门表型具显著的抑制作用，则说明药物可直接抑制阴门前体细胞的发育，阻止其形成多 阴门而呈非特异的细胞毒作用。
[0046] 本实施例的结果是CB1275株系线虫的多阴门表型未受到生脉散醇提物的影响 (突变率仍然为100% )，这表明药物作用于ras信号通路可抑制ras原癌基因过度激活形 成的假阴门，不能抑制Iin-I突变失活形成的假阴门表型，说明生脉散醇提物作用于ras原 癌基因而不作用于lin-Ι，证明药物下调了 ras原癌基因的过度激活而不是直接抑制了细 胞的增殖起作用的，即生脉散醇提物起作用是ras通路机制依赖，而非广泛的细胞毒作用。
[0047] 以上实施例的动物实验表明，本发明的生脉散醇提物可特异性下调ras原癌基因 突变后所致的过表达，而不作用于野生型ras原癌基因。同时，本发明的生脉散醇提物与传 统的生脉散水煎剂相比致死率低且无致畸作用，因此毒性更小，效果更好，可应用在制备由 ras原癌基因过表达导致的肿瘤药物中，有望开发成新一代的抗肿瘤药物。
【主权项】
1. 一种生脉散醇提物，其特征在于该醇提物的制备方法如下：将人参、麦冬和五味子， 加入乙醇溶液浸泡，加热回流后过滤，减压浓缩即得。2. 如权利要求1所述的生脉散醇提物，其特征在于，所述人参、麦冬、五味子的比例为 9:9:6。3. 如权利要求1所述的生脉散醇提物，其特征在于，所述乙醇溶液为无水乙醇。4. 如权利要求1-3所述的生脉散醇提物在抑制ras原癌基因过表达中的应用。5. 如权利要求1-3所述的生脉散醇提物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤是由 ras原癌基因过表达导致的。
【专利摘要】本发明属中药领域，涉及一种生脉散醇提物及其在抑制ras原癌基因过表达中的应用，具体涉及在制备抑制ras原癌基因过表达的抗肿瘤药物中的应用。研究表明约90%胰腺、50%结肠癌、30%-40%肺腺癌及5%-40%的白血病是由于ras原癌基因过表达造成的，Ras蛋白已成为公认的筛选抗相关恶性肿瘤药物的靶标。动物实验表明生脉散醇提物可特异性下调ras原癌基因突变后所致的过表达，而不作用于野生型ras原癌基因。同时，本发明的生脉散醇提物与传统的生脉散水煎剂相比致死率低且无致畸作用，因此毒性更小，效果更好，有望开发成新一代的抗肿瘤药物。
【IPC分类】A61P35/00, A61K36/8968
【公开号】CN105267618
【申请号】CN201410249921
【发明人】李红玉, 李孟惠, 支德娟, 李洋, 李莹辉, 陈晓雨
【申请人】兰州大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年6月7日