态的改变（Wei曲tchangesandgrossmo;rphologyof liver)
[0299] 让高脂肪饲料小鼠组经由饮用方式投予200毫升含有2. 5毫克KMUP-1盐酸盐的 液态药物，如图1显示，不论于预防组或是治疗组，均可减少其因喂食高脂肪饲料而增加体 重的现象。喂食高脂肪饲料小鼠，如图2A所示肝脏表面可发现大量的白色脂肪组织。于预 防组可显著地减少脂肪组织，如图2C所示，与治疗组的肝脏相比较呈现显著现象。
[0300]高脂肪饲料诱发肝脏内SR-B1 的表达（HFD-inducedSR-Blexpressioninliver)
[0301] 如图3A所示，喂饲高脂肪饲料化抑）小鼠，饮用KMUP-1液态药物，可发现能抑制 HFD诱发肝脏清道夫受体B族1型（scavengerreceptorclassBtype1，SR-B1)的表达。 如图3B所示，不论于预防组或是治疗组，均可促进蛋白激酶A/蛋白激酶G(PKA/PKG)的表 达。
[0302]肝脏内油滴的量测（Measurementofoilglobuletsinliver)
[030引如图4A底部所示，10、25、50和100μπι油滴的直径标准。估计各油滴相对应的直 径为6、21、24和25μm，如图4Β显示，直径变化和油滴数目的分布情况。油滴的计数采取从 直径较大到较小的顺序进行观察。
[0304] 肝脏组织的苏木精-伊红染色（H&Estainingofliver)
[0305] 如图5A所示从喂食14周高脂肪饲料小鼠所分离的发炎肝脏组织，与图5B喂食高 脂肪饲料W及KMUP-1预防组小鼠的红栋色肝脏组织相比较，整体肝脏呈现大量的白色脂 肪组织。如图5所示苏木精-伊红化emato巧linandeosin，H&E)染色的肝脏切片细胞， 而不论是W高脂肪饲料喂饲的治疗组（图5B)或预防组（图50,其小鼠肝脏可运用有机 溶剂清洗呈现大空泡的脂肪球（macrovesi州larfatglobules)。喂食高脂肪饲料的肥胖 小鼠，从第8周起投予2. 5毫克浓度KMUP-1到14周共6周治疗组，如图5B白色箭头所示 大空泡的脂肪球，亦可发现玻璃样透明体（Mallory'shyalinebodies)。而图5C所示，W 2. 5毫克/千克浓度投予KMUP-1预处理6周/14周，其脂肪球减少，玻璃样透明体几乎消 失。
[0306]炎症的TNF-a和MMP-9的I肥染色（1肥staining of inflammato巧TNF-a and MMP-9in steatohepatitis)
[0307] 如图6B所示，喂食高脂肪饲料小鼠W 2. 5毫克/千克浓度KMUP-1投予14周的预 防组，或图6C所示6周的治疗组，经免疫组织化学染色（immunohistochemistry，1肥）的肝 脏组织切片，呈现些抑制肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor曰1地曰，TNF-a)的作 用。
[030引肿瘤坏死因子-α的深栋色抗体应答，于预防组或治疗组呈现不一样的遮蔽现 象，其中油滴几乎消失，然而如图7Α所示应答色泽并无大幅度地减少，显示抗发炎作用不 彰。基质金属蛋白酶-9(Mat;rixmetallopeptidase9，ΜΜΡ-9)的深栋色抗体应答，如图7Β 所示于治疗组亦呈现遮蔽现象，油滴于治疗组亦几乎消失。油滴直径变化和数目的分布，于 预防组或治疗组呈现大幅度地减少。于阴性对照组，投予KMUP-1的预防组或治疗组，即使 不再增加抗体，喂食高脂肪饲料小鼠的肝脏组织切片内油滴呈现几乎消失现象。
[0309] Wmc染色的脂肪性肝炎服L/p-服L/ATGL(I肥stainingof服L/p-监L/ATGLin steatohepatitis)
[0310] 喂食高脂肪饲料小鼠的肝脏组织切片，如图7C、图7D所示，对照组的促使激素敏 感性脂肪酶/憐酸化激素敏感性脂肪酶化化/p-HSL)呈现深栋色，显示包含大量的发炎性 蛋白质或酶，如发炎性基质金属蛋白酶-9/肿瘤坏死因子-α，失活的促使激素敏感性脂肪 酶/p-HSL/内脂肪甘油Ξ醋脂肪酶（ATGL)，白色油滴的肥胖过度W及肥胖肝脏生成的活性 氧簇（R0巧产物。预防组或治疗组，其白色油滴减少，是因为KMUP-1活化P-服L产生脂肪 分解，但是并非完全是服L所造成脂解的结果。投予KMUP-1的治疗组或预防组，部分可增 加服L亦可经由活化ATCL同时改变些P-服L现象。如图7E所示，服L同时改变油滴数量 和直径。抗体应答伴随着多数油滴数量的改变，经染色的P-服L在预防组比治疗组更显著， 表明KMUP-1抑制脂肪性肝炎的主要角色P-服L比服L还突出。
[0311] 同样地抗体应答和油滴数量数变化，经染色的AT化，显示KMUP-1诱发脂解抑制脂 肪性肝炎，在预防组与治疗组相比较，ATCL是重要角色。
[031引经免疫组织化学染色脂肪肝炎的2种巨隧细胞（1肥S化iningoftypelortype2macrophages(MlorM2)insteatohepatitis)
[0313] 如图所示WF4/80和CDllc(图8)染料进行经典启动的巨隧细胞（Ml)的免疫组 织化学染色，WCD206和CD209a(图9)染料进行替代启动的巨隧细胞（M2)的免疫组织化 学染色。其中CD209a染色，是极敏感的抗体应答。喂食高脂肪饲料小鼠的肝脏组织，可发 现大量的白色油滴，显示过度肥胖化yperadiposity)导致脂肪性肝炎。该白色油滴受背景 颜色的干扰，而影响对比差异的区分程度。巨隧细胞Ml内的油滴数量及直径显现于图10A、 图10B，中央为KMUP-1的治疗组，右侧为预防组。所有标本经免疫组织化学染色（1肥）的图 像，于相同的光照条件进行光镜观察。对于巨隧细胞Ml或M2型的所有抗体应答，经计算机 计算颜色强度，平均区分为4类型饱和度。如图10A、图10B、图11AW及图11B所示，预防 组的油滴直径变化和治疗组相比较，呈现显著差异。
[0314] 附睾脂肪垫的苏木精-伊红染色（H&Estainingoffatpads)
[0315] 喂食高脂肪饲料诱发小鼠的肥厚/增生白细胞类型附睾脂肪垫（epididymalfat pad)，经苏木精-伊红（服E)染色的切化显示投予2. 5毫克/千克浓度KMUP-1的预防组， 可呈现抑制效果。如图12所示，喂食高脂肪饲料的附睾脂肪垫重量呈现增加，投予KMUP-1 进行14周的治疗组，可减少其重量。如图13显示，KMUP-1每天投予2. 5毫克/公斤浓度 的预防组，其附睾脂肪垫重量W及脂肪细胞直径均呈现显著地减少现象。
[0316] 经免疫组织化学染色附睾脂肪垫的eNOS/服LW及比-lO/TNF-α(1肥staining ofeNOS/服Land]X-10/TNF-ainepididymalfatpads)
[0317] 喂食高脂肪饲料进行为期14周诱发的脂肪组织，经免疫组织化学（MC)染色 如图所示分别为eNOS(图14)、HSL(图15)、白细胞介素-10(IL-10,图16)，肿瘤坏死因 数-αOW-a，图17)。每天投予2. 5毫克/千克浓度KMUP-1的预防组，可抑制eNOS、 TNF-α，而增加服^IL-10分别显示能改变附睾脂肪垫的免疫应答。
[0318]高脂肪饲料诱发肝脏内SR-BUHMGCoAreductase、ROCKII、PPAR丫与ABCA1 的 表达（HFD-inducedHMGCoAreductase,ROCKII,PPAR丫andABCAlexpressioninliver)
[0319] 喂饲高脂肪饲料老鼠8周后，经口强饲KMUP-1和辛伐他汀能影响3-?基-3-甲 基戊二酷辅酶A还原酶（HMGCoAre化ctase)受高脂肪饲料减少的表达。喂饲高脂肪饲料 老鼠与标准饲料组相比较，该还原酶的表达呈现减少现象。经口投予2. 5、5毫克/公斤浓 度的KMUP-1 (图18)和5毫克/千克浓度的辛伐他汀（simvastatin)，如图19所示，均可显 著地可逆肝脏内受到高脂肪饲料而降低3-径基-3-甲基戊二酷辅酶A还原酶的表达。此 外KMUP-1亦能激活喂饲高脂肪饲料小鼠肝脏内PPAR丫（图20)、ABCA1 (图21)的表达，令 其ROCKII失活。
[0320] 胎pG2细胞血清/生理食盐水和甲径戊酸诱导HMGCoAre化ctase的表达（Serum/ vehicleandmevalonate-inducedHMGCoAreductaseexpression)
[0321]W含血清/生理食盐水的培养基培养化pG2细胞，投予KMUP-1 (图22A)、或10-9~ 10-5M辛伐他汀（图22B)培养24小时，与生理食盐水或溶液的对照组相比较，KMUP-1或辛 伐他汀均随着浓度的增加，3-径基-3-甲基戊二酷辅酶A还原酶的表达亦呈现依存性增加。 于化pG2细胞培养基添加60、80、100μM的甲?戊酸（mevalonate)，如图23A所示随着浓度 的增加3-径基-3-甲基戊二酷辅酶A还原酶的表达下降呈现依存性现象。W100μΜ甲径 戊酸，能大幅抑制3-径基-3-甲基戊二酷辅酶A还原酶的表达；W甲径戊酸与10-5Μ浓度 的KMUP-1的组合，如图23B所示能逆转该抑制作用，显示3-径基-3-甲基戊二酷辅酶A还 原酶最终产物回馈（end-pro化ctfee化ack)的调节现象。
[0322] 肝细胞内化oA/ROCKII的失活与eNOS表达的增加巧hoA/ROCKIIinactivation andeNOS-enhancement)
[0323] 在肝细胞的化οA激酶从膜转移到细胞液内的现象，随投予KMUP-1的浓度呈现依 存性地抑制。ROCKII是化oA在肝细胞信号传递的下游蛋白受器（downstreameffector)。 随KMUP-1或10-9-10-5M浓度的辛伐他汀，经由限制化oA的转移，ROCKII蛋白的表达呈现 依赖性地降低作用现象。肝细胞内化oA/ROCKII的失活，同时增加eNOS的表达亦随KMUP-1 浓度呈现依存性。
[0324]增加PPAR丫 /ABCAl/ApoA-I/LXRα的表达（IncreasedPPAR丫 /ABCAl/ApoA-I/ L邸α)
[032引 投予KMUP-1与10-9-10-5M浓度的辛伐他汀，可增加肝细胞内PPAR丫，ABCAl的 表达，显示影响脂质代谢从肝细胞朝向着形成高密度脂蛋白胆固醇（皿L)的方向进行。KMUP-1随其减少小鼠体重增加量，增加PPAR丫的表达2~3倍，于表一显示PPAR丫激活 KMUP-1参与着小鼠体重增加量的减少过程。肝细胞内，与10-9-10-5M浓度的辛伐他汀， 均可随浓度呈现依赖性地增加载脂蛋白A-UapolipoproteinA-I，ApoA-I)与肝X受体 α(liverXrec巧torso，LXRa)的表达。
[0326]cGMP途径与化oA/ROCKII(cGMP-pathwayand化oA/ROCKII)
[0327] 如图24A所示5μg/ml的MioA激酶括抗剂C3胞外酶（C3exoenzyme)W及10μΜ 的ROCK括抗剂Y27632均可令ROCKII的表达失活，而经由10μΜ的cGMP括抗剂化-8-pCPT -cGMPs(8-(p-chlor〇-phenylthio)邑uanosine-3, 5-monophosphorothioate)可令其的表达 增加，若并用10μΜ的KMUP-1则呈现抑制作用，如图24B所示，上述作用设及肝细胞内cGMP 信号传递途径的参与。此外KMUP-1、辛伐他汀、C3胞外酶W及Y27632,均能增加PPAR丫（图 24C)与ABCA1 (图24D)的表达。KMUP-1尚可增加PPAR丫平行于体重增加量的下降，显示 在表一体重增加量的下降方面，PPAR丫具有重要的作用。
[032引GGPP与FPP可导致化oA/ROCKII的激活（I?hoA/R0CKIIactivationinthe presenceofGGPPandFPF0
[0329] 肝细胞内，如图25A、图25B所示，运用香叶基香叶基焦憐酸（geran^geran^ pyrophosphat，GGPFO和焦憐酸法尼醋（Farnesylpyro地os地ate,FPF〇，KMUP-1 可削弱其 中化oA与ROCKII的表达。而如图25C所示，辛伐他汀则不能经由外源性GGPP或FPP，令 ROCKII失活。
[0330]外源性GGPP或FPP可减少PPAR丫与ABCA1的表达巧xogenous GGPP or FPP decreases PPARγand ABCAl)
[033。单独WFPP或GGPP培养HepG2细胞，可抑制PPAR丫与ABCAl的表达。如图26A、 图2她所示，不论于FPP或GGPP的培养基内投予10-9-10-5M浓度的KMUP-1，则反转此现 象，可恢复PPAR丫与ABCA1的表达。但在10μΜ的GGPP培养基内添加内辛伐他汀，如图 26C所示，无法使PPAR丫的形成获得还原。
[0332] [14口 甲哲戊酸的生合成度iosynthesis of[14口mevalonate)
[0333] 10μΜ的KMUP-1不能减少[14C]甲径戊酸的形成。相反地辛伐他汀与溶媒对照组 相比较，可增加[14口甲径戊酸的形成达86.6±4.2%。^51旨111曰-4化1油公司90%^上纯 度的[14口3-径基-3-甲基戊二酷辅酶A还原酶（[14C]HMGCoAreductase)，W20units/ mg的用量用于测定[14C]甲径戊酸的形成。
[0334] 肝脏LDLRs的免疫组织化学染色与PKG/PKA的表达（1肥ofLDLRsand expressionofPKG/PKA)
[0335] 喂食高脂肪饲料诱发的肝脏，其低密度脂蛋白受体化owdensitylipoprotein rec巧tor,LDLRs)的表达，可经由LDLRs免疫组织化学染色法（I肥stainingmethods)进 行评估。不论喂食高脂肪饲料的预防组或是治疗组，投予2毫克/200毫升KMUP-mci的液 态药物，其肝脏的低密度脂蛋白受体均呈现增加现象。经由于高脂肪饲料饲养小鼠肝脏，运 用西方墨点法比较LDLRs与PKA/PKG的表达。肝脏内存在着低密度脂蛋白受体巧00μg/ mL)，投予KMUP-1 (10, 20, 40M)如图27A所示，无法呈现显著影响其PKA蛋白表达的现象。该 高脂血症的病理模型，却可增加PKG的表达。然而200μg/mL氧化低密度脂蛋白（oxidized lowdensitylipoprotein,oxidizedLDl^,oxLDL)诱发减少PKA蛋白的表达，如图 27B所 示，投予KMUP-1 (1，10, 100μΜ)，可呈现反转现象。
[0336]细胞内LDLRs/PKA/服L的巧光染色（FluoroscentstainingofcellularLDLRs/ PKA/服L)
[0337] 投予不同浓度的KMUP-1、辛伐他汀处理24小时，进行肝脏化pG2细胞的巧光 (fluorencent)染色。如图28A显示，其结果是随着KMUP-1浓度10-6U0-5M而10-4M或是 10-5M浓度辛伐他汀（simvastatin)的增加，如图28B显示，低密度脂蛋白受体（LDLR)的绿 色巧光呈现增加现象。该化pG2细胞绿色巧光增加量与未投予KMUP-1处理的对照组进行比 较，KMUP-1随超过10-4M浓度，绿色染色反而呈现不明原因的衰退于化pG2细胞KMUP-1浓 度接近可运用的范围。于化pG2细胞投予KMUP-1 (图29A)或是辛伐他汀（图29B)处理， 则显示PKA与服L的绿色巧光增加其免疫活性亦增加。而KMUP-1无法显著地影响PKG蛋 白的免疫活性。
[033引 PPAR/eNOS在脂肪的分解受KMUP-1所调控，而导致服L和P-服L的增加。
[033引表Ξ[0340]
[0342] 表四
[0343]
[0344] 综上所述，KMUP-1可改善高脂肪食品所造成的血脂异常症（dyslipidemia)。其比 较simvastatin降低脂肪，W及促使激素敏感性脂肪酶化SL)转移脂肪的肝脏内机制。W 高脂肪饲料喂食巧7BL/6J雄性小鼠8周后，每天经口投予1，2. 5, 5mg/kg的KMUP-1，或是 2. 5mg/kg的simvastatin,进行实验。KMUP-1可降低血清与肝脏的甘油Ξ醋、总胆固醇、低 密度脂蛋白，增加皿L/HMGR/R0CKII/PPAR/ABCA1的表达，W及降低小鼠喂食高脂肪饲料8 周后肝脏/体重的增加量。经由饮用方式投予200毫升蒸馈水含有2. 5毫克KMUP-1盐酸 盐的液态药物1-14周或是8-14周，可降低喂食高脂肪饲料小鼠的肝脏/体重重量增加量 与清道夫受体B族1型（SR-B1)、PKA/PKG的表达，W及增加低密度脂蛋白受体（LDLRs) / PKA的免疫活性。W血清或是外源性甲径戊酸培养化pG2肝脏细胞，10-7~10-5M浓度的 KMUP-1，可经由回馈（fee化ack)的调节现象呈现逆转3-径基-3-甲基戊二酷辅酶A还原酶 的表达，W及共存的ABCAl/ApoA-1/LXR/PPAR丫表达，外源性香叶基香叶基焦憐酸（GGP巧 和法尼醋焦憐酸（FP巧诱发化oA/ROCKII的失活。cGMP括抗剂逆转KMUP-1诱发ROCKII 的失活，显示其介入cGMP/eNOS的途径。存在着LDLKMUP-1可增加PKG与LDLRs，补充氧化 态低密度脂蛋白（oxidizedLDLoxLDL)则减少PKA。辛伐他汀足W显著地抑制[14口甲径 戊酸的生合成，KMUP-1则无此作用。反之，KMUP-1经由外源性香叶基香叶基焦憐酸（GGP巧 和法尼醋焦憐酸（FP巧，造成ROCKII的失活。此外KMUP-1，经由增加PPAR丫/LXR/ABCA1/ Apo-I的表达改善高密度脂蛋白，抑制清道夫受体B族1型的表达，同时增加LDLRs/PKA/ PKG/服L的表达，因而经由低密度脂蛋白受体移除低密度脂蛋白，经由活化促使激素敏感性 脂肪酶令甘油Ξ醋水解。当然KMUPs-RX复合化合物于生物体内是W经由改善PPAR/SR-B1/ LDLRs/PKA/PKG/服LW及多数因子呈现消除肥胖作用。
[0345]材料和方法（MaterialsandMethods)
[034引 实验动物（Animals)
[0347]如流程A所示于8周的实验，21~22g重巧7BL/6J雄性小鼠，禁食后W高脂肪饲 料（HFD)饲养8周的高脂血症模式。于该2个月的实验，小鼠于实验前禁食一夜，W高脂肪 饲料化抑）代替标准饲料（standarddiet,STD)，然后随机分为5组，2只对照组和3只治 疗组，每组各6只小鼠。对照组喂饲一般标准饲料或