芬戈莫德的新用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及芬戈莫德的新用途。
【背景技术】
[0002] 糖尿病视网膜病变（DR)是的糖尿病微血管并发症之一，且为导致工作年龄群致 盲的主要原因之一。炎症反应在DR的发生及发展中起到重要作用。DR早期以血视网膜屏 障破坏为主要特征，晚期出现视网膜新生血管。目前，DR的治疗主要为控制全身情况（包 括血糖、血脂及血压），抗VEGF治疗、全视网膜激光及玻离体切割术治疗，但是这些方法均 是针对症状所采取的措施。尚无有效的方法可以从病因上治疗DR。
[0003] 芬戈莫德（FTY720)是冬虫夏草中提取的有效成分多球壳菌素去除手性中心、改 变侧链而合成的新型免疫抑制剂。FTY720在体内经鞘氨醇激酶2磷酸化后，形成活性形式 FTY720-P。FTY720-P是鞘氨醇-1-磷酸（S1P)的结构类似物，可以作用于除S1P2以外的其 他4种S1P受体而发挥作用。
[0004] 现阶段芬戈莫德主要具有如下应用：芬戈莫德为首个防止淋巴细胞从淋巴结中离 开的鞘氨醇1-磷酸盐受体调节剂类药，降低多发性硬化症患者疾病复发的频率，延缓多发 性硬化症患者的病情恶化程度；它还可以保持淋巴结内特定的免疫细胞，防止它们作用于 中枢神经系统并造成损害，并且对淋巴细胞的保持力是可逆的，从而使患者在治疗停止后 体内循环的淋巴细胞恢复到正常水平。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供芬戈莫德的新用途。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0007] 芬戈莫德具有减少DM大鼠视网膜炎性细胞浸润、及细胞因子和粘附因子表达的 用途。
[0008] 芬戈莫德具有抑制NF-κB活化的用途。
[0009] 芬戈莫德对血视网膜屏障具有保护作用，减少血管渗透性并维持紧密连接蛋白的 表达。
[0010] 芬戈莫德在制备用于治疗糖尿病视网膜病变的药物中的用途。
[0011] 本发明的有益效果是：
[0012] 本发明提供了一种芬戈莫德（FTY720)的新用途，可减少DM大鼠视网膜炎性细胞 浸润，及细胞因子和粘附因子表达；另外，FTY720还可以抑制NF-κB的活化；FTY720对血 视网膜屏障具有保护作用，减少血管渗透性并维持紧密连接蛋白的表达；FTY720可有效应 用于糖尿病视网膜病变的药物制备。
【附图说明】
[0013] 图1是本发明实施例中大鼠视网膜HE染色检测视网膜组织病理学改变图；
[0014] 图2是本发明实施例中大鼠视网膜⑶45阳性的白细胞和⑶lib阳性的巨噬细胞 /活化的小胶质细胞浸润图；
[0015] 图3是本发明实施例中大鼠视网膜炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达图；
[0016] 图4是本发明实施例中大鼠视网膜ICAM-1和VCAM-1表达情况。其中，Α为免疫 组织化学染色检测视网膜ICAM-1和VCAM-1，B为视网膜ICAM-1和VCAM-1阳性细胞统计， C为视网膜ICAM-1和VCAM-1的mRNA相对表达量图；
[0017] 图5是本发明实施例中大鼠视网膜NF-κΒ表达量。其中，A为westernblot检测 视网膜NF-κB蛋白表达量，B为视网膜NF-κB的mRNA相对表达量图；
[0018] 图6是本发明实施例中大鼠EB灌注检测视网膜血管渗漏。其中，A为EB灌注视 网膜铺片，B为视网膜EB渗漏定量图；
[0019] 图7是本发明实施例中大鼠视网膜紧密连接蛋白Z0-l、0ccludin和Claudin-5表 达情况。其中，A为免疫组织化学染色检测视网膜Z0-1、Occludin和Claudin-5表达及分 布，B为westernblot检测视网膜Z0-1、Occludin和Claudin-5表达，C为视网膜Z0-1、 Occludin和Claudin-5的mRNA相对表达量图。
【具体实施方式】
[0020] 为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实 施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
[0021] 实施例1
[0022] 1.大鼠糖尿病（diabeticmellitus，DM)模型的建立
[0023] 1. 1实验动物的选取及饲养
[0024] 12-14周龄雄性Wistar大鼠80只，体重250-300g。全部大鼠饲养于标准化动物 中心无特定病原体动物（SPF)级动物房，采用标准颗粒饲料喂养，自由饮水摄食，室温为 (22 ± 2) °C，相对湿度为40 % -60 %。适应性饲养3-5天后用于实验。
[0025] 1. 2DM大鼠模型制作原理
[0026] 抗肿瘤药物链脲佐菌素（streptozotocin,STZ)可以选择性破坏大鼠胰岛β细 胞，引起实验性I型糖尿病。
[0027] 1. 3DM模型的制备及标准
[0028] 造模前称重，一次性尾静脉注射2%STZ，剂量为50mg/kg，48h后检测空腹血糖，连 续3次大于16. 7mmol/L即为造模成功。
[0029] 2芬戈莫德（FTY720)对实验动物的治疗作用及药理研究
[0030] 以上述制备的DM模型作为实验对象验证FTY720对其治疗效果，并考察其药理作 用机制。
[0031] 2.1实验方法
[0032] 2. 1. 1DM大鼠的饲养条件
[0033] 饲养于标准化动物中心无特定病原体动物（SPF)级动物房，采用标准颗粒饲料喂 养，自由饮水摄食，室温为（22 ± 2) °C，相对湿度为40 % -60 %。
[0034] 2. 1. 2给药方式及具体途径
[0035] 造模成功后，FTY720治疗组大鼠每日灌胃给药，剂量为0. 3mg/kg，连续3个月。由 于FTY720可溶于水，故采用双蒸水溶解，并且未设置安慰剂组。
[0036] 2. 1. 3视网膜切片HE染色
[0037] 2. 1. 3. 1 取材
[0038] 造模成功后3个月，处死大鼠并完整取出眼球。
[0039] 2. 1. 3. 2石蜡切片制备
[0040] (1) 10%甲醛溶液+4%冰乙酸固定眼球，使组织、细胞蛋白质变性凝固；过夜，生 理盐水冲洗眼球；
[0041] (2)脱水：将眼球依次浸入75%酒精、85%酒精、95%酒精1、95%酒精11、95%酒 精III、无水酒精I、无水酒精II、无水酒精III;
[0042] (3)透明：眼球依次浸入二甲苯I、II、III;
[0043] (4)浸蜡：将眼球浸入预热的包埋盒中（含部分融化的石蜡），继续加入融化的石 蜡至组织全部浸没；
[0044] (5)冷却：将包埋盒置入4°C冰箱中充分冷却后取出；
[0045] (6)将包埋好的蜡块，用石蜡机连续切片，厚度为5μm，制成石蜡切片。
[0046] 2. 1.3. 3HE染色
[0047] (1)石蜡切片脱蜡至水：顺序依次为，二甲苯浸洗2次共5min，100%、95%、90%、 80%、70%乙醇浸洗31^1^5，自来水洗涤1〇11^11 ;
[0048] (2)苏木精染色5min，自来水洗lmin;
[0049] (3) 1 %盐酸酒精分化30s，自来水洗lmin，PBS返蓝30s，自来水洗lmin;
[0050] (4)伊红染色2min;自来水洗3min;
[0051] (5)梯度酒精脱水，二甲苯透明；
[0052] (6)中性树脂胶封片，光镜下观察并拍照。
[0053] 2. 1. 4视网膜免疫荧光染色
[0054] 2. 1. 4. 1取材及冰冻切片制备
[0055](1)造模成功后3个月处死大鼠，完整取出眼球；
[0056] (2)立即将大鼠眼球于液氮中冷冻10-15秒后，用你0CT包埋；
[0057](3)立即将0CT包埋的大鼠眼球于-80°C超低温冰箱中冷冻，15分钟后取出；
[0058] (4)将冷冻包埋好的组织用冰冻切片机连续切片，厚度为5μm，制成冰冻切片，切 片暂时冷冻于-20°C备用。
[0059] 2. 1. 4. 2免疫荧光染色
[0060] (1)冰冻切片室温复温30min;
[0061] ⑵冰丙酮固定8min后，冰PBS洗3次X5min;
[0062] (3) 3 % 的BSA室温封闭 30min;
[0063] (4)分别滴加一抗CD45、CDllb、CD3 (均3%BSA稀释，稀释比例为1:200)，4°C孵 育过夜，冰PBS洗3次X5min;
[0064] (5)滴加驴抗大鼠荧光二抗（3%BSA稀释，稀释比例为1:400)，室温避光孵育lh， 冰PBS洗 3 次X5min;
[0065](6)采用含DAPI封片剂封片。荧光显微镜下观察、拍照。
[0066]2.1.5视网膜免疫组织化学染色
[0067] 2.L5· 1取材及石蜡切片制备
[0068] 同 2. 1. 3. 1. 1 和 2. 1. 3. 1. 2.
[0069] 2. 1. 5. 2免疫组织化学染色
[0070] (1)石蜡切片置于65°C烤箱烘烤2小时，取出后冷却至室温；
[0071] (2)二甲苯脱腊（二甲苯11〇11^11-二甲苯111〇1^11)，梯度酒精水化（100%乙醇 I5min- 100 % 乙醇II5min- 95 % 乙醇lOmin- 80 % 乙醇lOmin)，自来水洗lmin，蒸馈 水洗lmin;
[0072] (3)切片浸入PH= 6. 4柠檬酸盐缓冲液，微波加热，高火加热lOmin后，低火加热 lOmin，从微波炉取出后冷却至室温，浸入蒸馏水洗5min;
[0073] (4)将切片置于3%H202,水平震荡5min，蒸馏水洗5min
[0074] (5)加入5%BSA封闭液，室温孵育lh，甩掉封闭液，勿洗；
[0075] (6)每块组织滴加 30ul-抗Z〇-l(稀释比 1 :100)、occludin(稀释比 1 :100)、 claudin-5(稀释比 1 :100)、ICAM-1(稀释比 1:100)、VCAM-1(稀释比 1:200)置于湿盒中 4°C孵育过夜，0. 1 %PBS水平震荡洗3次，5min/次；
[0076] (7)滴加30ul生物素标记的二抗（山羊抗兔或山羊抗小鼠）（稀释比1 :200)，室 温下孵育lh，0. 1 %PBS水平震荡洗3次，5min/次；
[0077] (8)滴30ul辣根过氧化物酶-生物素偶联的三抗，室温下孵育2h，0. 1 %PBS水平 震荡洗3次，5min/次；
[0078] (