5)电泳：取样本RNA5ul加于琼脂糖凝胶上样孔内，130rg压电泳lOmin。凝胶 成像仪上观察结果，可见三条带即28s、18s、5s，条带清晰表示RNA完整。
[0167] 2. 1. 9. 4 逆转录合成cDNA
[0168] (1)配制反应体系（见表1):
[0169] 表1逆转录反应体系
[0170]
[0171] (2)反应条件：42°C孵育 30min，85°C加热 5min，4°C冷却。
[0172] (3)逆转录：将各组份按反应体系所示加入0. 2mlRNase_Free微离心管中，放入 PCR仪，按照反应条件设定程序，开始运行。逆转录结束后取出样本储存于-20°C备用。
[0173] 2. 1. 9. 5qRT-PCR
[0174] (1)引物设计：根据引物设计原则，由上海生工生物工程股份有限公司设计并合 成针对大鼠ICAM-1、VCAM-1及NF-κB的特异性引物。（见表2)
[0175] 表2qRT-PCR引物设计
[0176]
[0177] (2)配制PCR反应体系（见表3)
[0178] 表3PCR反应体系
[0179]
[0180] (3)qRT_PCR:将反应体系放入荧光定量PCR仪中，设置好反应如下：预变性 94°C30s，变性 94°C5s，退火 57°C10s，延伸 72°C10s，循环 40 次。
[0181] (4)反应结束后，仪器自动生成CT(thresholdcycles)值及恪解曲线图。以 β-actin为内参。每份模板的每个基因都设置3个重复孔，独立的实验重复至少3次。整 理并分析数据，绘制柱状图。分析数据如下：
[0182] Folds= 2AACt
[0183] -ΔACt= (Ctl-Ct2)-(Ct3-Ct4)
[0184] Ctl:处理样本待测基因的临界循环数
[0185] Ct2 :处理样本持家基因（β-actin)的临界循环数
[0186] Ct3 :对照样本待测基因的临界循环数
[0187] Ct4 :对照样本持家基因（β-actin)的临界循环数
[0188] 2. 1.10统计学方法
[0189] 采用SPSS17. 0软件进行统计学分析。组间统计资料以均数土标准差±s)表 示。采用单因素方差分析或独立样本T检验。以P〈0. 05为差异有统计学意义。
[0190] 2. 2实验结果
[0191] 2. 2. 1各组大鼠体质量及血糖情况
[0192] 各组大鼠在饲养过程中，随月龄增大而体重稳步增长。对照组大鼠随机血糖随年 龄增长持续维持在正常范围，DM组及DM+FTY720组大鼠随机血糖持续大于16. 7mmol/l且 随年龄增长无明显改变。（见表4)
[0193] 表4 4, 8及12周大鼠体重及随机血糖比较（I±s)
[0194]
[0196] 注：*P<0·OOlvscontrol,#P<0·OlvsDM.
[0197] 2. 1. 2视网膜组织病理学检查HE染色结果
[0198] 光学显微镜检查结果显示，对照组视网膜各层结构清晰、形态正常、细胞排列整齐 (图1) ;DM组大鼠视网膜各层变薄，细胞排列紊乱，神经节细胞层及内核层细胞数量减少、 排列不整齐，细胞核肿胀、体积增大，视网膜组织水肿，部分血管明显扩张：DM+FTY720组大 鼠视网膜各层组织水肿减轻，细胞排列渐规则。
[0199] 2. 1. 3视网膜炎性细胞免疫荧光染色
[0200] 采用免疫荧光染色的方法检测视网膜炎性细胞浸润情况，包括总的白细胞 (⑶45)、巨噬/激活的小胶质细胞（⑶lib)和T淋巴细胞（⑶3)。结果显示（图2)，与正常 对照组相比，DM组大鼠视网膜切片有大量⑶45阳性及⑶lib阳性细胞浸润，且主要分布于 神经节细胞层；而FTY720治疗组大鼠视网膜切片⑶45阳性及⑶lib阳性细胞较少。⑶3阳 性细胞含量极少，结果未显示。
[0201] 2. 1. 4视网膜炎性细胞因子表达
[0202] 采用Western blot方法检测视网膜组织中细胞因子的表达，结果显示（图 3):与正常对照组相比，DM组大鼠视网膜中TNF-α (1. 12±0. 13vs. 0. 42±0. 17, P < 0.001)、IL-6(1.03±0.23vs.0.24±0. 1，P < 0.001)及IL-Ιβ表达显著增加 (0·92±0· 08vs.0·31±0· 12，Ρ<0· 001);而FTY720治疗可显著下调TNF-a、IL-6及IL-Ιβ 表达（0·64±0· 18, P <0·05;0·73±0· 12, P <0·05;0·64±0· 11，P <0·05)。
[0203] 2. 1. 5视网膜粘附因子表达
[0204] 采用免疫组织化学染色及qRT-PCR法，分别检测大鼠视网膜组织粘附因子 ICAM-1及VCAM-1的蛋白及mRNA表达量。免疫组织化学染色结果显示（图4A):与正常 对照组相比，DM大鼠视网膜ICAM-1 (18/HPF,P< 0· 001)、VCAM-1 (17/HPF,P< 0· 001) 蛋白表达量显著增加；而FTY720治疗组ICAM-1及VCAM-1蛋白表达显著降低（7/HPF; 6/HPF)。与免疫组织化学染色一致，qRT-PCR检测结果显示（图4B、C):与正常对照组 相比，DM大鼠视网膜ICAM-1 (2. 23±0· 17fold,P< 0· 001)、VCAM-1 (2. 42±0· 33fold，P < (λ001)mRNA表达量显著增加；而FTY720 治疗组ICAM-1(L01±(λ05fold，P<(λ001)、 VCAM-1(1· 24±0· 28fold，P< 0· 001)mRNA表达显著降低。
[0205] 2.L6视网膜NF-κΒ表达
[0206] 采用Westernblot及qRT-PCR的方法分别检测大鼠视网膜NF-κB(p65)的蛋白及 mRNA表达量。Westernblot结果显示（图5A):与正常对照组相比，DM大鼠视网膜NF-κΒ蛋 白表达量显著增加（1. 43±0. 34vs0. 93±0. 20,P< 0. 05);而FTY720治疗可抑制NF-κB 蛋白表达（0.95±0. 31，P< 0.05)。与Westernblot结果一致，qRT-PCR检测结果显示（图 5B):与正常对照组相比，DM大鼠视网膜NF-κΒmRNA表达显著增加1(.92±0.llfold，P < 0· 001);而FTY720 治疗组NF-κBmRNA表达显著减少（L23±(λ09fold,P<(λ001)。
[0207] 2. 1. 7视网膜血管渗透性分析
[0208] ΕΒ血管灌注造影视网膜铺片后，于共聚焦荧光显微镜下观察ΕΒ渗漏情况（图 6Α):正常对照组大鼠视网膜血管无渗漏，DM组大鼠视网膜血管可见明显的ΕΒ渗漏而 FTY720治疗组未见明显渗漏。
[0209]统计分析EB浓度与净A值之间呈高度直线相关（r= 0. 9979,P= 0. 001)，为Y =0. 0702X+0. 0125 ;其中，Y表示净A值，X表示EB浓度。据此，计算出各组样品净A值所 对应的EB质量浓度。正常大鼠视网膜EB平均渗漏量为10. 95± 1. 95ng/mg，DM大鼠EB平 均渗漏量为30. 1±2. 3ng/mg;两者相比，DM大鼠EB平均渗漏量显著高于正常组，差异有统 计学意义（P< 〇. 05)。FTY720治疗组EB平均渗漏量为17. 28 ± 2. 39ng/mg，与DM大鼠相比 EB渗漏量减少42. 57 %，差异有统计学意义（P< 0. 05)。（图6B)。
[0210] 2. 1. 8视网膜紧密连接蛋白表达
[0211] 分别采用免疫组织化学染色及Westernblot方法检测视网膜紧密连接蛋白的 表达。免疫组织化学染色显示（图7A):正常大鼠视网膜紧密连接蛋白Z0-1、Occludin 及Claudin-5大量表达，且主要分布于神经节细胞层、神经纤维层、外丛状层及内核层； DM大鼠视网膜紧密连接蛋白表达明显减少，而FTY720治疗组大鼠视网膜紧密连接表达 则明显增加。Westernblot检测显示（图7B):与正常大鼠相比，DM大鼠视网膜Z0-1、 Occludin及Claudin-5 表达均显著减少（分别为 0.80±0· 16vs.L35±0. 08,P< 0.05 ; 0· 90±0· 18vs. 1· 26±0· 3,P< 0· 05 ;0· 79±0·lvs. 1· 38±0· 04,P< 0· 05) ;FTY720 治 疗可以显著减少这三种紧密连接蛋白的丢失，差异有统计学意义（分别为1. 13±0. 12,Ρ < 0· 05 ;1· 19±0· 09,Ρ< 0· 05 ;1· 07±0· 15,Ρ< 0· 05)。
[0212] 2. 3 结论
[0213] 上述实验发现，FTY720对DR治疗有效。FTY720可减少DM大鼠视网膜炎性细胞浸 润，及细胞因子和粘附因子表达。另外FTY720还可以抑制NF-κB的活化。FTY720对血视 网膜屏障具有保护作用，减少血管渗透性并维持紧密连接蛋白的表达。
[0214] 上述参照【具体实施方式】对该芬戈莫德的新用途进行的详细描述，是说明性的而不 是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的 变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 芬戈莫德具有减少DM大鼠视网膜炎性细胞浸润、及细胞因子和粘附因子表达的用 途。2. 芬戈莫德具有抑制NF-κB活化的用途。3. 芬戈莫德对血视网膜屏障具有保护作用，减少血管渗透性并维持紧密连接蛋白的表 达。4. 芬戈莫德在制备用于治疗糖尿病视网膜病变的药物中的用途。
【专利摘要】本发明提供了一种芬戈莫德的新用途，可减少DM大鼠视网膜炎性细胞浸润，及细胞因子和粘附因子表达；另外，FTY720还可以抑制NF-κB的活化；FTY720对血视网膜屏障具有保护作用，减少血管渗透性并维持紧密连接蛋白的表达；FTY720可有效应用于糖尿病视网膜病变的药物制备。
【IPC分类】A61P27/02, A61P9/10, A61K31/137, A61P3/10
【公开号】CN105395530
【申请号】CN201510848090
【发明人】颜华, 范玲玲, 孟祥达, 刘媛媛, 郑芳
【申请人】天津医科大学总医院
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年11月27日