筛选，得到CHO-APP的稳定株；继续在CHO-APP细胞中转入pSecTag2-BACEl 质粒，然后通过zeocin和G418两种抗生素进行稳定株筛选，得到CH0-APP&BACE1的稳定 株）细胞培养 ：CH0-APP&BACE1用F12培养液（10%FBS)培养于24孔板中，于70%细胞密 度时分别加入各种牛蒡子苷元衍生物（20 μ M)(参见表1)孵育24小时，取出培养液10, 000 离心10分钟，取上清，加入蛋白酶抑制剂（cocktail),然后通过ELISA方法测定上清中Αβ 含量。
[0089] 3)将细胞上清用标准稀释液进行十倍稀释，然后按照试剂盒所提供方法进行检 测。即在室温下将稀释后的上清、Αβ抗体和偶联Αβ另一种抗体的96孔板共同孵育3小 时，然后用试剂盒中提供的漂洗液进行洗板4次，再加入偶联有辣根过氧化物酶的二抗室 温下孵育30分钟，再用漂洗液洗板五次，然后加入显色液于室温孵育30分钟，最后加入反 应中止液。以Bio-Rad酶标仪在450nm处读取0D值。
[0090] 3、实验结果
[0091 ] 结果如表2所示，牛蒡子苷元碳酰胺衍生物ATG-A01~ATG-A05均有抑制Α β形 成的作用，同时这些化合物的理化性质比ATG均有显著地改善。
[0092] 表2、牛蒡子苷元及其衍生物对Α β形成的抑制活性
[0093]
[0094] 试验实施例3 ATG-A02盐酸盐和Β-08的药代动力学研究
[0095] 单次静脉（IV)及口服（Ρ0)给予Sprague Dawley大鼠受试物ATG-A02盐酸盐 50mg/kg，于不同时间点采集血样，LC/MS/MS测定给予受试物后大鼠血浆中受试物的浓度并 计算相关参数。口服后血浆中检测到的主要成分为ATG-A02和ATG。测试结果见表3。以 △丁6402计其口服生物利用度$)为61.7%，以六了6计其口服生物利用度$)为31.3%。
[0096] 表3、大鼠单次口服给予ATG-A02盐酸盐后的ATG-A02和ATG主要药动学参数
[0097]
[0098] AUC(。t)为药时曲线下面积，指血药浓度曲线从0到t与时间轴所包围的面积。
[0099] AUC(。^为药时曲线下面积，指血药浓度曲线对时间轴所包围的全部面积。
[0100] MRI\。" }为平均驻留时间，指药物分子在体内停留时间的平均值。
[0101] t1/2z为终末半衰期，指药物达到分布平衡后的血药浓度减少50%所需的时间。
[0102] T_为达峰时间，指单次服药以后，血药浓度达到峰值的时间。
[0103] C_为药峰浓度，指给药后出现的血药浓度最高值。
[0104] F为生物利用度，指药物经血管外途径给药后吸收进入全身血液循环药物的相对 量。
[0105] 同样地，单次静脉（IV)及口服（P0)给予Sprague Dawley大鼠受试物B_0810mg/ kg，于不同时间点采集血样，LC/MS/MS测定给予受试物后大鼠血浆中受试物的浓度并计算 相关参数。口服后血浆中检测到的主要成分为B-08和ATG。以B-08计其口服生物利用度 为1.7%，以ATG计其口服生物利用度为9. 2%。
[0106] 试验实施例4 ATG-A02盐酸盐逆转老年性痴呆转基因模型小鼠记忆力损伤的作用
[0107] 本发明通过APP/PS1双转基因老年性痴呆模型小鼠评价化合物ATG-A02盐酸盐对 记忆力损伤改善作用。结果表明化合物ATG-A02盐酸盐能够明显逆转老年性痴呆模型小鼠 的记忆力损伤。
[0108] 1、实验原理
[0109] 本实验采用的为APP/PS1双转基因老年性痴呆模型小鼠（B6C3转基因小鼠， APPswe，PSldE9)。这类转基因小鼠能高表达嵌和鼠/人的瑞典突变APP (Mo/HuAPP695swe) 和人源删除第9个外显子的早老素1蛋白（preSenilin，PSl-dE9)。此类转基因小鼠会在 6-7个月的时候出现Α β沉积并且会在7个月的时候出现空间记忆力的损害。
[0110] 我们采用经典的Morris水迷宫实验（Morris Water Maze, MWM)评价老年性痴呆 模型小鼠的记忆力损伤情况。实验分为两部分：训练实验和平台寻找实验。以训练实验中 小鼠寻找到平台时间长短和平台寻找实验中小鼠穿越平台次数为评价小鼠记忆力情况的 指标。
[0111] 2、实验材料与方法
[0112] 1)APP/PS1双转基因老年性痴呆模型小鼠购买于美国的Jackson Laboratory公 司，然后繁殖和鉴定。通过采用对小鼠剪尾，然后PCR鉴定小鼠的APP/PS1的基因序列以鉴 定小鼠基因型。在实验中采用鉴定后没有转入这两个基因的小鼠作为实验中的阴性对照小 鼠。小鼠在标准条件下饲养（SPF级环境，12/12小时明暗循环，足够水和食物，22°C的恒温， 60 %的湿度）。
[0113] 2)老年性痴呆模型小鼠给药：在小鼠6月大小时，20只转基因小鼠被随机分为2 组（转基因溶剂组，转基因 ATG-A02盐酸盐-10mg/kg剂量组），10只非转基因小鼠作为阴 性对照组。化合物ATG-A02盐酸盐直接溶解于生理盐水中，采用灌胃给药100天，然后开始 行为学实验检测（Morris水迷宫实验）。
[0114] 3)小鼠训练实验：小鼠每天进行三次训练，持续六天。在三次训练中我们分别在 三个除平台所在的象限点将小鼠面向池壁置于水中，然后给小鼠90秒钟时间去寻找平台 位置，小鼠在平台上停留20秒钟时间以帮助它记忆平台位置。在此期间，记录小鼠找到平 台的时间即潜伏期。在第六天，在三次训练之后，小鼠进行平台寻找实验。在这次实验中， 潜于水面下的平台被撤除，然后让小鼠在水池中持续90秒钟去寻找平台，记录小鼠穿越平 台次数作为其记忆力的评价指标，次数越多表明其记忆力越好。所有的动物实验操作都严 格遵守《实验动物管理条例》。
[0115] 3、实验结果
[0116] 实验结果发现，转基因小鼠的潜伏期明显长于非转基因小鼠（图1)，而穿越平台 次数明显少于非转基因小鼠（图2)，表明转基因小鼠的记忆力出现明显损伤，表明其老年 性痴呆模型正确；给予化合物ATG-A02盐酸盐（10mg/kg/day，）的转基因小鼠潜伏期明显 短于溶剂处理的转基因小鼠（图1)，而穿越平台次数明显多于溶剂处理的转基因小鼠（图 2)，表明化合物ATG-A02盐酸盐能够明显逆转转基因小鼠出现的记忆力损伤表现；这些结 果表明化合物ATG-A02盐酸盐能够起到很好治疗阿尔茨海默病效果。
【主权项】
1. 一种如下通式（I)所示的牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物，或其药学上可接受的盐在 制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途， X为-(CH2)n-，或亚芳i ;η为1、2或3 ; 札、私和1?3各自独立地为氢；CfC6烷基；(：3-(：8环烷基；未取代或被CfQ烷基、CfC 4烧氧 基、卤素、硝基、氰基和羟基中的取代基取代的芳基；未取代或其中芳基被CfC4烷基、CfQ 烷氧基、卤素、硝基、氰基和羟基中的取代基取代的芳基CfC4烷基；未取代或其中杂芳基被 CfC4烷基、C i-C4烷氧基、卤素、硝基、氰基和羟基中的取代基取代的5-7元杂芳基C ^匕烷 基； 或者 X与R3、以及与R3相连的氮原子一起形成未取代或被选自c「C4烷基、卤素 、-NH 2和羟 基中的取代基取代的4-8元含氮杂环，或者 X与相邻的两个氮原子、私和R i-起形成未取代或被选自C i-C4烷基、卤素 、-NH 2和羟 基中的取代基取代的4-8元含氮杂环。2. 根据权利要求1所述的用途，其中，X为-(CH 2) n-，或亚苯基。 R23. 根据权利要求2所述的用途，其中，X为亚苯基，为与苯环邻位相连的N，N-二 r3 甲氨基。4. 根据权利要求1所述的用途，其中，R i、私和R 3各自独立地为氢、C「C4烷基、或C 3-C6 环烷基。5. 根据权利要求1所述的用途，其中，R2为氢或甲基。6. 根据权利要求1所述的用途，其中，X与R 3、以及与私相连的氮原子一起形成未取代 或被选自CfC4烷基、卤素 、-NH 2和羟基中的取代基取代的含有一个氮原子的4-8元含氮杂 环，或者 X与相邻的两个氮原子、私和R i-起形成未取代或被选自C i-C4烷基、卤素 、-NH 2和羟 基中的取代基取代的含有两个氮原子的4-8元含氮杂环。7. 根据权利要求1所述的用途，其中，X与R3、以及与R3相连的氮原子一起形成哌啶环， 或者 X与相邻的两个氮原子、私和R i-起形成哌嗪环。8. 根据权利要求1所述的用途，其中，所述牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物选自下列化 合物：I.
【专利摘要】本发明涉及如下通式I所示的一类牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。所述牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物能降低β-淀粉样肽(Aβ)的含量，且在体内可代谢为牛蒡子苷元(Arctigenin,ATG)，因而可作为治疗阿尔茨海默病的药物。
【IPC分类】A61P25/28, A61K31/365, C07D307/33, A61K31/496, A61K31/4525, C07D405/12
【公开号】CN105616400
【申请号】CN201410619560
【发明人】胡立宏, 沈旭, 雷敏, 朱志远, 刘军华, 陈静
【申请人】中国科学院上海药物研究所
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年11月5日