一种辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系及其制备方法

一种辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种辅助免疫细胞疗法的靶向纳米碳量子点载体CQDs—PEG—Tf及其制备方法，以及以该载体介导抗肿瘤药物联合免疫细胞在肿瘤靶向治疗中的应用。体外实验结果表明该载体能与肿瘤细胞表面过表达受体特异性结合，且利用该载体介导抗肿瘤药物一定浓度下对免疫细胞具有良好的生物安全性。所述载体负载抗肿瘤药物与免疫细胞联合作用可双重靶向和杀伤肿瘤细胞，在实现双重抗肿瘤效应的同时又能降低抗肿瘤药物对正常细胞的毒副作用。该载体制备方法简单、易于实施，且具有高度靶向性、无毒性、优异的生物相容性以及可生物降解性。本发明可适用于靶向抗肿瘤药物的制备以及辅助免疫细胞对多种癌症疾病的靶向治疗。
【专利说明】
一种辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系，具体涉及一种碳量子点 纳米靶向载体及其制备方法以及靶向抗肿瘤药物的制备和该靶向抗肿瘤药物联合免疫细 胞在肿瘤靶向治疗中的应用。 技术背景
[0002] 当前，体细胞免疫治疗已成为肿瘤患者手术、放疗和化疗后辅助治疗的重要手段 之一，其对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及骨髓净化都具有良好的效果。研究 表明，免疫细胞具有杀灭肿瘤细胞和提高抗肿瘤免疫的双重作用，其可趋化和识别肿瘤细 胞，并对肿瘤细胞、肿瘤干细胞和其它处于非增殖期的肿瘤细胞均具有明显的杀伤作用，同 时还能提尚机体的免疫力。
[0003] 免疫细胞疗法，其治疗效果显著，无明显副作用，与现代手术、化疗和放疗方法联 合应用，可有效清除体内不同部位的微小残留病灶，防止肿瘤转移和复发。然而这种联合应 用方法也并不能全部杀死肿瘤细胞，也存在不足之处。首先，每个人的肿瘤细胞不一定可以 被这些免疫系统所识别，即使识别了很快又被肿瘤细胞所逃避。其次，目前肿瘤化疗方法对 患者身体损伤很大，其化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时也损伤正常的组织器官，具有很大 的毒副作用。最后，大部分抗癌药物是通过损伤细胞核内DNA杀死癌细胞，因此，其作用靶点 位于癌细胞的细胞核中，然而由于细胞核的屏蔽作用，细胞质中的药物分子只有少量能进 入细胞核，这大大降低了药物分子在肿瘤细胞的浓度。另外，肿瘤细胞对化疗药物易产生耐 药性，导致了细胞内药物浓度不断下降，其细胞毒性逐渐减弱甚至丧失。因此，亟需开发新 型的集药物治疗效果好与毒副作用小于一体的药物治疗体系。
[0004] 研究表明纳米微粒能跨越血脑屏障，实现药物的传递，利用其作为药物载体不仅 能保护药物的活性，还能实现缓释、控释和靶向释药的目的。近年来，石墨烯、磁性纳米颗 粒、碳纳米管和富勒烯等纳米材料作为药物载体在生物医学中的应用获得了一定进展，但 这些材料均存在生物相容性、毒副作用、制备复杂等问题而限制其在临床上的应用。最近， 一种新型的碳纳米材料一一碳量子点，由于其具有荧光可示踪、良好的生物相容性、低毒 性、分子量和粒径小、荧光稳定性高、表面易功能化等优点而被广泛应用于细胞标记、生物 成像和靶向治疗等方面的生命科学领域。
[0005] 研究表明，在血液循环中的纳米颗粒易于通过肿瘤新生血管壁的缝隙聚集到肿瘤 附近，即肿瘤血管具有的高渗透高阻溜效应(EPR效应），故纳米载药颗粒本身具有被动靶 向。若在纳米载药颗粒表面修饰上靶向分子，聚集到肿瘤组织附近的纳米载药颗粒可以进 一步通过靶向分子与癌细胞表面的受体的特异性作用，可增强癌细胞对药物的摄取，减小 药物对正常细胞的毒性，即赋予纳米颗粒主动靶向的功能。由于肿瘤的快速成长，需要补充 大量的铁，导致大多数癌细胞表面转铁蛋白受体(TfR)的表达量高于正常细胞。研究表明在 肿瘤细胞上转铁蛋白受体表达量是正常细胞2-7倍，转铁蛋白与其受体的亲和力是正常细 胞的10-100倍。因此，转铁蛋白（Tf)可作为一理想的靶向分子修饰到纳米颗粒表面。转铁蛋 白是一种单链糖基化β-球蛋白，其分子量约80KDa，主要负责脊椎动物体内Fe3+的结合和运 输，是目前研究最多的活性药物靶向载体。目前，大量的研究已证实以Tf作为靶向载体，经 Tf-TfR路径介导的药物输送体系可将药物运送至肿瘤细胞用于癌症的治疗。基于此，利用 转铁蛋白与碳量子点偶联介导抗肿瘤药物，联合免疫细胞的肿瘤趋化作用及肿瘤杀谱广特 性可实现特异性与非特异性的双重杀伤肿瘤细胞的作用。

【发明内容】

[0006] 为了克服上述免疫细胞疗法不能全部识别肿瘤细胞和杀伤肿瘤细胞的不足以及 现有抗肿瘤药物用药剂量高、体内半衰期短、对正常细胞毒副作用大的缺点和对肿瘤细胞 缺乏特异性的不足，本发明的首要目的在于提供一种辅助免疫细胞疗法实现高效双重杀伤 肿瘤细胞的主动祀向性碳量子点纳米载药体系及其制备方法。
[0007] 本发明的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系，所述的靶向纳米载药体系是以 纳米材料碳量子点CQDs为载体，聚乙二醇PEG为交联物，转铁蛋白Tf为靶向分子，通过共价 偶联形成的靶向纳米载体CQDs-PEG-Tf，其中每毫克CQDs-PEG偶联转铁蛋白的含量为 282-316微克，其粒径大小为224 · 5 ± 90 · 2nm。
[0008] 本发明的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的制备方法，包括如下步骤：
[0009] 1)将抗坏血酸溶于水中，搅拌均匀后，加入PEG搅拌，微波反应，将所得溶液过滤、 洗涤和纯化后，即得碳量子点水溶液;所得的碳量子点水溶液除去过量的溶剂，干燥，得到 碳量子点，粒径为7 · 32 ± 0 · 98nm;
[0010] 2)取步骤1)所得干燥碳量子点，按比例加入无水N，N二甲基甲酰胺DMF和二氯亚砜 SOCl 2，搅拌反应，反应结束旋除去过量的SOCl 2，得到酰氯化的碳量子点；
[0011] 3)取步骤2)所得酰氯化的碳量子点，按比例加入无水DMF中，并按比例加入聚乙二 醇和三乙胺，搅拌反应;离心，除去上清液，得沉积物碳量子点-聚乙二醇CQDs-PEG-OH，并 烘干；
[0012 ] 4)取步骤3)所得干燥碳量子点-聚乙二醇CQDs-PEG-OH中按比例加入无水DMF形 成悬浊液后，按质量比加入琥珀酸酐SA和4-二甲胺基吡啶DMAP，搅拌反应;离心，除去上清 液，得沉积物碳量子点-聚乙二醇CQDs - PEG-COOH，并烘干；
[0013 ] 5)取步骤4)所得干燥沉积物碳量子点-聚乙二醇CQDs-PEG-COOH按比例加入至 硼酸缓冲溶液，形成悬浊液后，按比例加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC，常温 下搅拌反应;反应液中按质量比加入转铁蛋白Tf，摇匀过夜，离心，除去上清液，得沉积物碳 量子点-聚乙二醇-转铁蛋白CQDs - PEG-Tf。
[0014]所述步骤1)中，抗坏血酸在反应液中的浓度为0.03g/ml，PEG在反应液中的的体积 百分数为66.7 % ;透析袋截留分子量为8000;微波功率200~400W，设定温度60~100°C，微 波作用时间80~200秒。
[0015] 所述步骤2)中，无水N，N二甲基甲酰胺(DMF)溶剂的体积与碳量子点的质量比为 (0.1-0.2)1111^111^，二氯亚砜(30(：12)的体积与碳量子点的质量比为(0.4-0.6)1]11^111^，反应 温度为65-70 °C。
[0016] 所述步骤3)中，无水DMF的体积与碳量子点的质量比为(0.5-0.8)mL: Img;聚乙二 醇与碳量子点的质量比为（2-2.5):1;三乙胺的体积与酰氯化碳量子点的质量比为(0.05- 0.1)!1^:111^，反应温度为100°(：。
[0017] 所述步骤4)中，无水DMF的体积与CQDs-PEG-OH的质量比为（2.0-3.0 )mL: Img， CQDs-PEG-OH、琥珀酸酐SA和4-二甲胺基吡啶DMAP质量比为1: (2-2 · 5): (2-2 · 5)，反应温 度为l〇〇°C。
[0018] 所述步骤5)中，硼酸缓冲溶液的体积与CQDs-PEG-⑶OH的质量比为（0.4-0.6) mL: Img，硼酸缓冲溶液pH为8.0; 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC与CQDs-PEG- COOH的质量比为（2.2-2.5): 1，所用的转铁蛋白Tf的分子量为80kDa，CQDs-PEG-COOH与转 铁蛋白的质量比1:(0.3-1)。
[0019]含有辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的免疫细胞一 CQDs-PEG-Tf复合 物，采用如下制备方法制成:首先按照每种类型的免疫细胞的标准培养方法对免疫细胞进 行体外培养、诱导、扩增获得免疫细胞，在获得的免疫细胞中加入CQDs-PEG-Tf共同孵育 后得到免疫细胞内吞碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白复合物，即免疫细胞一CQDs-PEG-Tf 复合物。
[0020] 所述的免疫细胞一 CQDs-PEG-Tf复合物中：制备过程中所加入的CQDs-PEG-Tf 复合物浓度为40-100yg/mL，所述的免疫细胞，包括树突状细胞(dendr i t i c ce 11 s，DC)、细 胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL)、自然杀伤细胞(natural killer cell， NK)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)或肿瘤浸润性淋巴细胞 (tumor infiltrating lymphocyte，TIL)，其浓度为105-108/ml〇
[0021] 含有辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的CQDs-PEG-Tf 一药物分子复合 物，采用如下制备方法制成：将抗癌药物分子通过物理吸附作用结合CQDs-PEG-Tf形成 CQDs - PEG-Tf 一药物分子复合物。
[0022] 所述的CQDs-PEG-Tf一药物分子复合物中，所述的抗肿瘤药物分子是能通过物 理吸附作用结合靶向纳米载体CQDs- PEG-Tf的药物分子。
[0023] 含有CQDs-PEG-Tf 一药物分子复合物的免疫细胞一 CQDs-PEG-Tf 一药物分子 复合物，采用如下制备方法制成:首先按照每种类型的免疫细胞的标准培养方法对免疫细 胞进行体外培养、诱导、扩增获得免疫细胞，在获得的免疫细胞中加入CQDs-PEG-Tf 一药 物分子复合物共同孵育，得到免疫细胞内吞碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白-药物分子复合 物，即免疫细胞一 CQDs - PEG-Tf 一药物分子。
[0024] 所述的免疫细胞一CQDs-TOG-Tf一药物分子复合物中：制备过程中所加入的 CQDs-PEG-Tf 一药物分子复合物浓度为40-100yg/mL，所述的免疫细胞，包括树突状细胞 (dendritic cells，DC)、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)、自然杀伤细胞 (natural killer cell，NK)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK) 或肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)，其浓度为105_108/ml〇 [0025]本发明提供了辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系CQDs-PEG-Tf在制备抗肿 瘤药物中的应用。
[0026]本发明提供了CQDs-PEG-Tf 一药物分子复合物在制备肿瘤靶向治疗药物中的应 用。
[0027]本发明提供了辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的免疫细胞一 CQDs-PEG- Tf复合物在制备肿瘤靶向治疗药物中的应用。
[0028]本发明提供了辅助免疫细胞疗法的免疫细胞一 CQDs-PEG-Tf 一药物分子复合物 在制备肿瘤靶向治疗药物中的应用。
[0029]本发明的机理为：
[0030]本发明所制成的碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白（CQDs - PEG-Tf)，一方面具有碳 量子点的优点，即可透过毛细血管和跨越血脑屏障等机体屏障，提高药物分子的稳定性，延 长药物分子在体内的半衰期，通过被动靶向作用增强靶细胞对药物分子的摄取率。另一方 面利用转铁蛋白的主动靶向肿瘤细胞的作用，即可实现药物分子经循细胞膜上的TfR选择 性的靶向于过表达TfR的肿瘤细胞内，杀伤肿瘤细胞，可有效避免药物分子对正常组织的毒 副作用。碳量子点表面易修饰，在其表面修饰转铁蛋白后可实现药物分子的被动和主动靶 向性。碳量子点表面含有大量的羟基和羧基等官能团，聚乙二醇作为桥梁，其一端可与碳量 子点上羧基形成酯基，另一端被羧基化后可与转铁蛋白上的氨基结合形成碳量子点-聚乙 二醇-转铁蛋白（CQDs-PEG-Tf)。利用聚乙二醇作为交联剂，实现碳量子点与转铁蛋白共 价偶联，可避免转铁蛋白直接与碳量子点连接产生的空间位阻效应。
[0031] 本发明具有如下技术优势：
[0032] 1)本发明的优势是纳米材料碳量子点具有生物可降解性、生物相容性好、低毒性、 荧光强度高、化学性质稳定、表面易修饰及较高的亲和力等诸多优点，利用其作为载体可保 护药物分子不被机体血浆或组织细胞中多种酶类的破坏，可跨越肺毛细血管、血脑屏障及 其他机体屏障将药物分子的输送至治疗部位，可控制药物分子在靶点部位的缓释作用。
[0033] 2)转铁蛋白作为靶向分子，由于其受体在肿瘤细胞表面过量表达，利用转铁蛋白 与其受体的特异性识别作用可进一步提高药物分子的靶向性。因此通过转铁蛋白修饰碳量 子点可形成具有缓释作用、高度靶向性和生物兼容性好的靶向纳米载体。利用该靶向纳米 载药体系介导药物分子可实现药物分子双重靶向治疗位点，可实现药物分子的高度选择靶 向肿瘤组织和病变组织，减少对正常组织器官的毒副作用，进一步提高肿瘤治疗效果。 [0034] 3)利用免疫细胞的肿瘤趋化作用及肿瘤杀谱广等特性联合靶向纳米载药体系 CQDs - PEG-Tf的特异性识别肿瘤及其靶向药物的作用，可实现双重抗肿瘤效应，可弥补现 有免疫细胞治疗技术的不足之处。
【附图说明】
[0035]图1为靶向纳米载体CQDs-PEG-Tf的结构模拟示意图。
[0036]图2为CQDs-PEG-Tf 一 MMC复合物1#对体外培养免疫细胞(CIK)存活率的影响结 果分析。
[0037]图3为CQDs-PEG-Tf 一 MMC复合物2#对体外培养免疫细胞(CIK)存活率的影响结 果分析。
[0038]图4为CQDs-PEG-Tf 一 MMC复合物3#对体外培养免疫细胞(CIK)存活率的影响结 果分析。
[0039] 图 5为CQDs-PEG-Tf 1# 和CIK 一 CQDs-PEG-Tf 1# 作用于 HepG2细胞和 L-02细胞 的流式检测图。
[0040] 图6为CQDs-PEG-Tf 2#和CIK一CQDs-PEG-Tf 2#作用于HepG2细胞和L-02细胞 的流式检测图。
[0041 ]图7为CQDs-PEG-Tf 3#和CIK一CQDs-PEG-Tf 3#作用于HepG2细胞和L-02细胞 的流式检测图。
[0042] 图8为靶向纳米载体CQDs-PEG-Tf 1#进入肿瘤细胞的吸收机理图。
[0043] 图9为靶向纳米载体CQDs-PEG-Tf 2#进入肿瘤细胞的吸收机理图。
[0044] 图10为靶向纳米载体CQDs-PEG-Tf 3#进入肿瘤细胞的吸收机理图。
【具体实施方式】
[0045] 以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实 施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0046] 实施例1
[0047]本发明的所述的革El向纳米载药体系是以纳米材料碳量子点CQDs为载体，聚乙二醇 PEG为交联物，转铁蛋白Tf为靶向分子，通过共价偶联形成的靶向纳米载体CQDs-PEG-Tf， 其粒径大小为224.5 ± 90.2nm。结构如图1所示。
[0048] 其制备过程如下：
[0049] (1)载体碳量子点-聚乙二醇(CQDs-PEG-OH)的制备
[0050] 取0.2g抗坏血酸溶于2mL超纯水中，磁力搅拌15min，形成透明均匀的溶液后，加入 4mL PEG-200搅拌20min，使用微波功率200W，设定温度60°C，微波反应80s，将所得溶液用溶 剂过滤器过滤，并在透析袋(截留分子量8000)中进行洗涤和纯化，即得碳量子点水溶液。所 得的碳量子点水溶液于旋转蒸发仪中蒸除大部分溶剂后，于真空干燥箱中35-65Γ烘干;得 到碳量子点。
[0051 ] 取干燥后的碳量子点30.85mg，加入到3mL无水DMF中，超声分散形成悬浊液后，立 即加入到12mL重蒸的SOCl2中，65°C回流反应20h。反应结束，旋蒸除去过量的SOCl2;得到酰 氯化的碳量子点。
[0052] 将所得的酰氯化碳量子点加入到15mL无水DMF中，并加入聚乙二醇（PEGn1500 ) 61.70mg，三乙胺1.5mL，100°C搅拌反应20h。反应结束，产物经2000rmp离心10min，超纯水洗 涤6次，除去上清液，得碳量子点-聚乙二醇(CQDs - PEG-OH)，真空干燥。
[0053] (2)靶向纳米载体碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白（CQDs-PEG-Tf )1#的制备
[0054] 取干燥的碳量子点-聚乙二醇（CQDs-PEG-OH)20.22mg于40mL DMF中，超声分散 20min后，加入琥?自酸酐40.44mg，4-二甲氨基吡啶40.44mg，于100 °C下反应20h。反应结束， 2000rmp离心I Omin，超纯水洗涤6次，除去上清液得CQDs -PEG一COOH，真空干燥I Oh。
[0055] 取干燥后的CQDs-PEG-COOH 2.Omg于0.8mL pH=8.0的硼酸缓冲液中，超声分散 20min后，加入EDC 4.4mg，反应20min后，加入转铁蛋白O . 62mg，室温搅拌反应IOh后， 2000rmp离心10min，超纯水洗涤6次，除去上清液，得碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白（CQDs- PEG-Tf)，4°C冷藏。
[0056]采用考马斯亮蓝G250试剂(Bradford)测定反应后上清液中转铁蛋白（Tf)的含量 来计算碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白上Tf的偶联量，方法为：反应前的Tf量减去反应后上 清液中的Tf量，即为碳量子点-聚乙二醇偶联的转铁蛋白含量，计算后得，每毫克碳量子点-聚乙^?醇偶联转铁蛋白的含量为282yg。
[0057] (3)碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白-丝裂霉素复合物(CQDs-PEG-Tf 一 MMC)1#的 制备(丝裂霉素为抗癌药物分子）
[0058] 取3mg干燥的CQDs-PEG-Tf加入4mL超纯水，超声分散25min形成悬浊液，加入40μ 区丝裂霉素(1:11:〇1115^;[11，匪0，室温下摇211，20001'11^1离心15111；[11，超纯水洗涤6次，除去上清 液，得到沉淀物碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白-丝裂霉素(CQDs-PEG-Tf 一 MMC )，4 °C冷藏。 采用紫外可见光谱检测MMC 365nm峰位处的吸光度，计算MMC的吸附量，经计算获得每毫克 CQDs - PEG-Tf 吸附 MMC约 4 · 6yg。
[0059] (4)免疫细胞-碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白-药物分子复合物（免疫细胞一 CQDs - PEG-Tf 一药物分子）1 #的制备
[0060] 将体外经免疫细胞特定细胞因子诱导扩增得到的细胞因子诱导的杀伤 (cytokine-induced killer，CIK)细胞与40yg/mL的CQDs-PEG一Tf一MMC继续共同孵育4h， CIK细胞浓度为105/ml，得到CIK 一 CQDs-PEG-Tf 一 MMC复合物。
[00611 (5)免疫细胞-碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白复合物(免疫细胞一 CQDs-PEG-Tf) 1#的制备
[0062] 将体外经免疫细胞特定细胞因子诱导扩增得到的细胞因子诱导的杀伤细胞CIK与 40yg/mL的CQDs-PEG-Tf 继续共同孵育4h，CIK细胞浓度为 105/ml，得到CIK一CQDs-PEG- Tf复合物。
[0063] 实施例2
[0064]本发明的所述的革El向纳米载药体系是以纳米材料碳量子点CQDs为载体，聚乙二醇 PEG为交联物，转铁蛋白Tf为靶向分子，通过共价偶联形成的靶向纳米载体CQDs-PEG-Tf， 其粒径大小为224.5 ± 90.2nm。结构如图1所示。
[0065] 其制备过程如下：
[0066] (1)载体碳量子点-聚乙二醇(CQDs-PEG-OH)的制备
[0067] 取0.2g抗坏血酸溶于2mL超纯水中，磁力搅拌15min，形成透明均匀的溶液后，加入 4mL PEG-200搅拌20min，使用微波功率300W，设定温度85°C，微波反应140s，将所得溶液用 溶剂过滤器过滤，并在透析袋(截留分子量8000)中进行洗涤和纯化，即得碳量子点水溶液。 所得的碳量子点水溶液于旋转蒸发仪中蒸除大部分溶剂后，于真空干燥箱中35-65Γ烘干； 得到碳量子点。
[0068] 取干燥后的碳量子点30.85mg，加入至lj5mL无水DMF中，超声分散形成悬浊液后，立 即加入到15mL重蒸的SOCl2中，70°C回流反应20h。反应结束，旋蒸除去过量的SOCl2;得到酰 氯化的碳量子点。
[0069] 将所得的酰氯化碳量子点加入到20mL无水DMF中，并加入聚乙二醇（PEGn1500 ) 69.41mg，三乙胺2.2mL，100°C搅拌反应20h。反应结束，产物经2000rmp离心10min，超纯水洗 涤6次，除去上清液，得碳量子点-聚乙二醇(CQDs - PEG-OH)，真空干燥。
[0070] (2)靶向载体碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白（CQDs-PEG-Tf )2#的制备
[0071] 取干燥的碳量子点-聚乙二醇（CQDs-PEG-OH)20.22mg于50mL DMF中，超声分散 20min后，加入琥珀酸酐40.55mg，4-二甲氨基吡啶40.64mg，于100 °C下反应20h。反应结束， 2000rmp离心I Omin，超纯水洗涤6次，除去上清液得CQDs -PEG一COOH，真空干燥I Oh。
[0072] 取干燥后的CQDs-PEG-⑶OH 2.0mg于ImL ρΗ = 8·0的硼酸缓冲液中，超声分散 20min后，加入EDC 5. Omg，反应20min后，加入Tf 1.32mg，室温搅拌反应20h后，2000rmp离心 15min，超纯水洗涤6次，除去上清液，得碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白（CQDs-PEG-Tf)，4 C冷减。
[0073]采用考马斯亮蓝G250试剂(Bradford)测定反应后上清液中转铁蛋白（Tf)的含量 来计算碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白上Tf的偶联量，方法为：反应前的Tf量减去反应后上 清液中的Tf量，即为碳量子点-聚乙二醇偶联的转铁蛋白含量，计算后得，每毫克碳量子点-聚乙^?醇偶联转铁蛋白的含量为294yg。
[0074] (3)碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白-丝裂霉素复合物(CQDs-PEG-Tf 一 MMC) 2#的 制备(丝裂霉素为抗癌药物分子）
[0075] 取3mg干燥的CQDs-PEG-Tf加入4mL超纯水，超声分散25min形成悬浊液，加入80μ g MMC，室温下摇2h，2000rmp离心15min，超纯水洗涤6次，除去上清液，得到沉淀物碳量子 点-聚乙二醇-转铁蛋白-丝裂霉素(CQDs-PEG-Tf一MMC)，4°C冷藏。采用紫外可见光谱检 测丽C 365nm峰位处的吸光度，计算MMC的吸附量，经计算获得每毫克CQDs-PEG-Tf吸附 MMC约 9.8yg。
[0076] (4)免疫细胞-碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白-药物分子复合物(免疫细胞+CQDs- PEG-Tf 一药物分子)2#的制备
[0077]将体外经免疫细胞特定细胞因子诱导扩增得到的细胞因子诱导的杀伤 (cytokine-induced killer，CIK)细胞与70yg/mL的CQDs-PEG一Tf一MMC继续共同孵育4h， CIK细胞浓度为l〇Vml，得到CIK 一 CQDs-PEG-Tf 一 MMC复合物。
[0078] (5)免疫细胞-碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白复合物(免疫细胞一 CQDs-PEG-Tf) 2#的制备
[0079] 将体外经免疫细胞特定细胞因子诱导扩增得到的细胞因子诱导的杀伤细胞CIK与 70yg/mL的CQDs-PEG-Tf 继续共同孵育4h，CIK细胞浓度为IOVml，得到CIK一CQDs-PEG- Tf复合物。
[0080] 实施例3
[0081 ]本发明的所述的革El向纳米载药体系是以纳米材料碳量子点CQD S为载体，聚乙二醇 PEG为交联物，转铁蛋白Tf为靶向分子，通过共价偶联形成的靶向纳米载体CQDs-PEG-Tf， 其粒径大小为224.5 ± 90.2nm。结构如图1所示。
[0082] 其制备过程如下：
[0083] (1)载体碳量子点-聚乙二醇(CQDs-PEG-OH)的制备
[0084] 取0.2g抗坏血酸溶于2mL超纯水中，磁力搅拌15min，形成透明均匀的溶液后，加入 4mL PEG-200搅拌20min，使用微波功率400W，设定温度100°C，微波反应200s，将所得溶液用 溶剂过滤器过滤，并在透析袋(截留分子量8000)中进行洗涤和纯化，即得碳量子点水溶液。 所得的碳量子点水溶液于旋转蒸发仪中蒸除大部分溶剂后，于真空干燥箱中35-65Γ烘干； 得到碳量子点。
[0085] 取干燥后的碳量子点30.85mg，加入至lj6mL无水DMF中，超声分散形成悬浊液后，立 即加入到18mL重蒸的SOCl2中，70°C回流反应20h。反应结束，旋蒸除去过量的SOCl2;得到酰 氯化的碳量子点。
[0086] 将所得的酰氯化碳量子点加入到24mL无水DMF中，并加入聚乙二醇（PEGn1500 ) 77.13mg，三乙胺3mL，100°C搅拌反应20h。反应结束，产物经2000rmp离心10min，超纯水洗涤 6次，除去上清液，得碳量子点-聚乙二醇(CQDs - PEG-OH)，真空干燥。
[0087] (2)靶向纳米载体碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白（CQDs-PEG-Tf )3#的制备
[0088] 取干燥的碳量子点-聚乙二醇（CQDs-PEG-OH)20.22mg于60mL DMF中，超声分散 20min后，加入琥珀酸酐50.55mg，4_二甲氨基吡啶50.55mg，于100°C下反应20h。反应结束， 2000rmp离心I Omin，超纯水洗涤6次，除去上清液得CQDs -PEG一COOH，真空干燥I Oh。
[0089] 取干燥后的CQDs-PEG-COOH 2.Omg于1.2mL pH=8.0的硼酸缓冲液中，超声分散 20min后，加入EDC 4.8mg，反应20min后，加入转铁蛋白2 . OOmg，室温搅拌反应IOh后， 2000rmp离心10min，超纯水洗涤6次，除去上清液，得碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白（CQDs- PEG-Tf)，4°C冷藏。
[0090] 采用考马斯亮蓝G250试剂(Bradford)测定反应后上清液中转铁蛋白（Tf)的含量 来计算碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白上Tf的偶联量，方法为：反应前的Tf量减去反应后上 清液中的Tf量，即为碳量子点-聚乙二醇偶联的转铁蛋白含量，计算后得，每毫克碳量子点-聚乙^?醇偶联转铁蛋白的含量为316yg。
[0091] (3)碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白-丝裂霉素复合物(CQDs-PEG-Tf 一 MMC) 3#的 制备(丝裂霉素为抗癌药物分子）
[0092] 取3mg干燥的CQDs-PEG-Tf加入4mL超纯水，超声分散25min形成悬浊液，加入120 yg MMC，室温下摇2h，2000rmp离心15min，超纯水洗涤6次，除去上清液，得到沉淀物碳量子 点-聚乙二醇-转铁蛋白一丝裂霉素 (CQDs-PEG-Tf 一 MMC)，4 °C冷藏。采用紫外可见光谱检 测丽C 365nm峰位处的吸光度，计算MMC的吸附量，经计算获得每毫克CQDs-PEG-Tf吸附 MMC约10.2yg。
[0093] (4)免疫细胞-碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白-药物分子复合物（免疫细胞一 CQDs - PEG-Tf 一药物分子)3#的制备
[0094] 将体外经免疫细胞特定细胞因子诱导扩增得到的免疫细胞为细胞因子诱导的杀 伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)与 100yg/mL的CQDs-PEG一Tf一MMC继续共同孵育 4h，CIK细胞浓度为 108/ml，得到CIK一CQDs-PEG-Tf一MMC复合物。
[0095] (5)免疫细胞-碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白复合物(免疫细胞一 CQDs-PEG-Tf) 3#的制备
[0096]将体外经免疫细胞特定细胞因子诱导扩增得到的细胞因子诱导的杀伤细胞CIK与 100yg/mL的CQDs - PEG-Tf继续共同孵育4h，CIK细胞浓度为108/ml，得到CIK 一 CQDs - PEG-Tf复合物。
[0097] 实施例4碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白-丝裂霉素复合物(CQDs-PEG-Tf-MMC) 1#对免疫细胞(CIK)的活性影响
[0098] 采用CCK8毒性试验检测实施例1制备的CQDs-PEG-Tf 一 MMC 1#对免疫细胞(CIK) 活性的影响。CCK8毒性试验是将不同浓度的CQDs-PEG-Tf 一 MMC与CIK共培养，不同时间段 检测CIK存活率的变化。以CQDs - PEG-Tf 一 MMC和CIK共培养为实验组，不加入CQDs - PEG- Tf一MMC培养的细胞为对照组。对照组与实验组平行重复5次。取约I X IO5细胞接种96孔板 中，添加淋巴细胞无血清培养液及因子IFN- γ，5 %⑶2，37°C环境下培养，24h后加入因子 IL-2和抗⑶3单抗继续培养5d，除空白对照外，其余每个孔加入含的50yg/mL CQDs-PEG- Tf 一 MMC的培液IOOyL共培养3h，每孔更换新鲜培液IOOyL，持续培养5d，每天定时检测并记 录细胞的吸光值:每孔加入IOyL WST-8溶液，孵育Ih后，选择480nm的波长，在酶标仪上测定 各孔的光吸收值并计算5个平行孔的平均值，结果见图2。存活率计算公式如下：
[0099] 存活率（％ ) =A48Q(实验组)/A48Q(对照组）X 100
[0100]图2为CQDs-PEG-Tf一MMC复合物对体外培养免疫细胞(CIK)增殖的影响。由图可 见，CQDs-PEG-Tf 一 MMC低于100yg/mL对细胞几乎没有毒性作用。但是，CIK对于CQDs- PEG-Tf 一 MMC在第一天产生应激反应，约30%CIK发生凋亡，随后的四天，CIK以约5%的速 率扩增并在第五天达到90%以上的存活率。因此，一定浓度下的CQDs-PEG-Tf一MMC具有 良好的生物安全性。
[0101] 实施例5碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白-丝裂霉素复合物(CQDs-PEG-Tf-MMC) 2#对免疫细胞(CIK)的活性影响
[0102] 采用CCK8毒性试验检测实施例2制备的CQDs-PEG-Tf一MMC 2#对免疫细胞(CIK) 活性的影响。CCK8毒性试验是将不同浓度的CQDs-PEG-Tf 一 MMC与CIK共培养，不同时间段 检测CIK存活率的变化。以CQDs - PEG-Tf 一 MMC和CIK共培养为实验组，不加入CQDs - PEG- Tf一MMC培养的细胞为对照组。对照组与实验组平行重复5次。取约I X IO5细胞接种96孔板 中，添加淋巴细胞无血清培养液及因子IFN- γ，5 %⑶2，37°C环境下培养，24h后加入因子 IL-2和抗⑶3单抗继续培养5d，除空白对照外，其余每个孔加入含的50yg/mL CQDs-PEG- Tf 一 MMC的培液IOOyL共培养3h，每孔更换新鲜培液IOOyL，持续培养5d，每天定时检测并记 录细胞的吸光值:每孔加入IOyL WST-8溶液，孵育Ih后，选择480nm的波长，在酶标仪上测定 各孔的光吸收值并计算5个平行孔的平均值，结果见图3。存活率计算公式如下：
[0103] 存活率（％)=A48Q(实验组)/A48Q(对照组）XlOO
[0104] 图3为CQDs-PEG-Tf 一MMC复合物对体外培养免疫细胞(CIK)增殖的影响。由图可 见，CQDs-PEG-Tf 一 MMC低于100yg/mL对细胞几乎没有毒性作用。但是，CIK对于CQDs- PEG-Tf 一 MMC在第一天产生应激反应，约30%CIK发生凋亡，随后的四天，CIK以约5%的速 率扩增并在第五天达到90%以上的存活率。因此，一定浓度下的CQDs-PEG-Tf一MMC具有 良好的生物安全性。
[0105] 实施例6碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白-丝裂霉素复合物(CQDs-PEG-Tf-MMC) 3#对免疫细胞(CIK)的活性影响
[0106] 采用CCK8毒性试验检测实施例3制备的CQDs-PEG-Tf一MMC 3#对免疫细胞(CIK) 活性的影响。CCK8毒性试验是将不同浓度的CQDs-PEG-Tf 一 MMC与CIK共培养，不同时间段 检测CIK存活率的变化。以CQDs - PEG-Tf 一 MMC和CIK共培养为实验组，不加入CQDs - PEG- Tf一MMC培养的细胞为对照组。对照组与实验组平行重复5次。取约I X IO5细胞接种96孔板 中，添加淋巴细胞无血清培养液及因子IFN- γ，5 %⑶2，37°C环境下培养，24h后加入因子 IL-2和抗⑶3单抗继续培养5d，除空白对照外，其余每个孔加入含50yg/mL CQDs-PEG- Tf 一 MMC (实施例3制备所得)的培液I OOyL共培养3h，每孔更换新鲜培液I OOyL，持续培养5d， 每天定时检测并记录细胞的吸光值:每孔加入IOyL WST-8溶液，孵育Ih后，选择480nm的波 长，在酶标仪上测定各孔的光吸收值并计算5个平行孔的平均值，结果见图4。存活率计算公 式如下：
[0107] 存活率（％)=A48Q(实验组)/A48Q(对照组）XlOO
[0108] 图4为CQDs-PEG-Tf一MMC复合物对体外培养免疫细胞(CIK)增殖的影响。由图可 见，CQDs-PEG-Tf 一 MMC低于100yg/mL对细胞几乎没有毒性作用。但是，CIK对于CQDs- PEG-Tf 一 MMC在第一天产生应激反应，约30%CIK发生凋亡，随后的四天，CIK以约5%的速 率扩增并在第五天达到90%以上的存活率。因此，一定浓度下的CQDs-PEG-Tf一MMC具有 良好的生物安全性。此外，比较CQDs-PEG-Tf一MMCl#、CQDs-PEG-Tf一MMC 2#和CQDs- PEG-Tf一MMC 3#对CIK的活性影响，发现这三种载体对CIK活性的影响无明显差异，说明一 定范围内的载体粒径大小以及载体上偶联的转铁蛋白量对CIK的活性影响不大。
[0109] 实施例7靶向纳米载体碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白（CQDs-PEG-Tf )1#和免疫 细胞CIK-碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白（CIK一CQDs-PEG-Tf) 1#进入体外培养肝癌细胞 !fepG2和正常肝细胞L-02量的差异
[0110] 取对数生长期的HepG2细胞和L-02细胞以6 X IO3/孔的密度分别接种于90mm培养 皿中，培养24h后，弃液，PBS洗涤，在HepG2细胞和L-02细胞中均分别加入实施例1制备的 CQDs-PEG-Tf(100yg/mL) 1# 和 CIK 一 CQDs-PEG-Tf(100yg/mL) 1# 于 37 °C 孵育 4h，孵育完 毕，PBS洗涤，上流式细胞仪测定其荧光强度(380nm激发波长，发射波长468nm)，结果见图5〇
[0111] 图5为CQDs- PEG-Tf和CIK 一CQDs- PEG-Tf作用于HepG2细胞和L-02细胞的流式 检测图，纵坐标为CQDs-PEG-Tf和CIK一CQDs-PEG-Tf进入细胞的荧光强度。由图可知， CQDs - PEG-Tf和CIK-CQDs-PEG-Tf与两种细胞作用4h后，荧光强度均比细胞自发荧光强 度大，且CIK 一 CQDs-PEG-Tf进入细胞的量明显高于CQDs-PEG-Tf进入细胞的量，说明 CQDs - PEG-Tf载体具有靶向特性，且利用其联合免疫细胞CIK的肿瘤趋化作用可高效靶向 肿瘤细胞。此外，CQDs-PEG-Tf和CIK 一 CQDs-PEG-Tf进入HepG2细胞的量均明显高于进 入L-02细胞的量，这是因为H印G2细胞表面的转铁蛋白受体高于L-02细胞表面的受体。
[0112] 实施例8靶向纳米载体碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白（CQDs-PEG-Tf )2#和免疫 细胞CIK-碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白（CIK一CQDs-PEG-Tf )2#进入体外培养肝癌细胞 !fepG2和正常肝细胞L-02量的差异
[0113] 取对数生长期的HepG2细胞和L-02细胞以6 X IO3/孔的密度分别接种于90mm培养 皿中，培养24h后，弃液，PBS洗涤，在HepG2细胞和L-02细胞中均分别加入实施例2制备的 CQDs-PEG-Tf(100yg/mL) 2# 和 CIK 一 CQDs-PEG-Tf(100yg/mL) 2# 于 37 °C 孵育 4h，孵育完 毕，PBS洗涤，上流式细胞仪测定其荧光强度(380nm激发波长，发射波长468nm)，结果见图6〇
[0114] 图6为CQDs- PEG-Tf和CIK 一CQDs- PEG-Tf作用于HepG2细胞和L-02细胞的流式 检测图，纵坐标为CQDs-PEG-Tf 一MMC和CIK一CQDs-PEG-Tf进入细胞的荧光强度。由图 可知，CQDs-PEG-Tf和CIK 一 CQDs-PEG-Tf与两种细胞作用4h后，荧光强度均比细胞自发 荧光强度大，且CIK 一 CQDs-PEG-Tf进入细胞的量明显高于CQDs-PEG-Tf进入细胞的量， 说明CQDs-PEG-Tf载体具有靶向特性，且利用其联合免疫细胞CIK的肿瘤趋化作用可高效 靶向肿瘤细胞。此外，CQDs-PEG-Tf和CIK 一 CQDs-PEG-Tf进入HepG2细胞的量均明显高 于进入L-02细胞的量，这是因为HepG2细胞表面的转铁蛋白受体高于L-02细胞表面的受体。 相比于 CQDs-PEG-Tfli^PCIK-CQDs-PEG-Tfl#，CQDs-PEG-Tf2i^PCIK-CQDs-PEG- Tf2#进入细胞的量较高，这可能是因为载体上偶联转铁蛋白的含量增加，促进了载体与细 胞上过表达的转铁蛋白受体接触，从而提高细胞对载体的摄取。
[0115] 实施例9靶向纳米载体碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白（CQDs-PEG-Tf )3#和免疫 细胞CIK-碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白（CIK一CQDs-PEG-Tf )3#进入体外培养肝癌细胞 !fepG2和正常肝细胞L-02量的差异
[0116] 取对数生长期的HepG2细胞和L-02细胞以6 X IO3/孔的密度分别接种于90mm培养 皿中，培养24h后，弃液，PBS洗涤，在HepG2细胞和L-02细胞中均分别加入实施3制备所得的 CQDs-PEG-Tf (lOOyg/mL) 3# 和 CIK 一 CQDs-PEG-Tf (100yg/mL) 3# 于 37 °C 孵育 4h，孵育完 毕，PBS洗涤，上流式细胞仪测定其荧光强度(380nm激发波长，发射波长468nm)，结果见图7〇
[0117] 图7为CQDs- PEG-Tf和CIK 一CQDs- PEG-Tf作用于HepG2细胞和L-02细胞的流式 检测图，纵坐标为CQDs-PEG-Tf和CIK一CQDs-PEG-Tf进入细胞的荧光强度。由图可知， CQDs-PEG-Tf和CIK一CQDs-PEG-Tf与两种细胞作用4h后，焚光强度均比细胞自发荧光 强度大，且CIK 一 CQDs-PEG-Tf进入细胞的量明显高于CQDs-PEG-Tf进入细胞的量，说明 CQDs - PEG-Tf载体具有靶向特性，且利用其联合免疫细胞CIK的肿瘤趋化作用可高效靶向 肿瘤细胞。此外，CQDs-PEG-Tf和CIK 一 CQDs-PEG-Tf进入HepG2细胞的量均明显高于进 入L-02细胞的量，这是因为H印G2细胞表面的转铁蛋白受体高于L-02细胞表面的受体。比较 CQDs-PEG-Tf 1#和CIK一CQDs-PEG-Tf 1#，CQDs-PEG-Tf 2#和CIK一CQDs-PEG-Tf 2#以及CQDs-PEG-Tf 3#和CIK一CQDs-PEG-Tf 3#与细胞作用后的荧光强度，发现 CQDs-PEG-Tf 3#和CIK一CQDs - PEG-Tf 3#的荧光强度较前两者的高，说明CQDs - PEG- Tf 3#和CIK一CQDs-PEG-Tf 3#进入细胞的量更高，且随着载体上偶联转铁蛋白的含量增 加，!fepG2细胞对载体的摄入量也随之增加。
[0118] 实施例10定量检测体外培养HepG2细胞对碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白（CQDs- PEG-Tf) 1 #摄取的靶向分析
[0119] 为了进一步确定实施例1制备的载体CQDs-PEG-Tf 1#具有靶向性，我们采用游离 的转铁蛋白作竞争剂。通过该方法可证明CQDs-PEG-Tf是通过肿瘤细胞表面表达的转铁 蛋白受体(TfR)介导的途径。转铁蛋白有三种构型：人血清转铁蛋白（h-Tf)、铁饱和的转铁 蛋白（holo-Tf)、未含铁转铁蛋白（apo-Tf)，这三种构型的转铁蛋白与其受体的亲和力也有 很大差异:铁饱和的转铁蛋白与其受体的亲和力最大，人血清转铁蛋白次之，未含铁转铁蛋 白的亲和力最弱。由于载体CQDs-PEG-Tf进入细胞的时间要明显比游离的转铁蛋白慢，所 以为了使细胞外有足够的含Fe 3+形式的转铁蛋白与TfR结合，占据TfR位点，达到与载体 CQDs - PEG-Tf竞争TfR，我们选择过表达转铁蛋白受体的H印G2细胞作为靶细胞。
[0120] (1)首先取对数生长的HepG2细胞6 X 103/孔的密度接种于90mm培养皿中，培养24h 后，弃液，PBS洗涤，加入不同浓度的游离转铁蛋白（I50yg/mL、350yg/mL和1.5mg/mL)和0.12 ymol/mL Fe3+于37°C、5%⑶2培养箱中培养Ih后，加入实施例1制备所得的CQDs - PEG-Tf (100yg/mL)继续孵育 4h;
[0121] (2)HepG2细胞中仅加入实施例1制备所得的CQDs-PEG-Tf(100yg/mL)继续孵育 4h作为对照组；
[0122] (3)孵育完毕，PBS洗涤，采用流式仪检测其荧光强度（380nm激发波长，接受波长 468nm)，结果见图8〇
[0123] 图8为考察靶向纳米载体CQDs-PEG-Tf是否以肿瘤细胞表面转铁蛋白受体介导 的途径进入细胞。结果显示，未加入Fe 3+，即使游离转铁蛋白的浓度不断增加也未能影响载 体CQDs-PEG-Tf进入细胞，而当溶液中含Fe3+时，随着游离转铁蛋白浓度的增加，HepG2细 胞对载体CQDs - PEG-Tf的吸收抑制程度越大，当游离转铁蛋白浓度为1.5mg/mL时，细胞吸 收抑制率约达82%。由此说明靶向纳米载体CQDs-PEG-Tf是通过转铁蛋白受体介导作用 进入细胞。
[0124] 实施例11定量检测体外培养HepG2细胞对碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白（CQDs- PEG-Tf) 2#摄取的靶向分析
[0125] 为了进一步确定实施例2制备的载体CQDs-PEG-Tf2#具有靶向性，我们采用游离 的转铁蛋白作竞争剂。通过该方法可证明CQDs-PEG-Tf是通过肿瘤细胞表面表达的转铁 蛋白受体(TfR)介导的途径。转铁蛋白有三种构型：人血清转铁蛋白（h-Tf)、铁饱和的转铁 蛋白（holo-Tf)、未含铁转铁蛋白（apo-Tf)，这三种构型的转铁蛋白与其受体的亲和力也有 很大差异:铁饱和的转铁蛋白与其受体的亲和力最大，人血清转铁蛋白次之，未含铁转铁蛋 白的亲和力最弱。由于载体CQDs-PEG-Tf进入细胞的时间要明显比游离的转铁蛋白慢，所 以为了使细胞外有足够的含Fe 3+形式的转铁蛋白与TfR结合，占据TfR位点，达到与载体 CQDs - PEG-Tf竞争TfR，我们选择过表达转铁蛋白受体的H印G2细胞作为靶细胞。
[0126] (1)首先取对数生长的HepG2细胞6 X IO3/孔的密度接种于90mm培养皿中，培养24h 后，弃液，PBS洗涤，加入不同浓度的游离转铁蛋白（I50yg/mL、350yg/mL和1.5mg/mL)和0.12 ymol/mL Fe3+于37°C、5%⑶2培养箱中培养Ih后，加入实施例2制备所得的CQDs - PEG-Tf (100yg/mL)继续孵育 4h;
[0127] (2)HepG2细胞中仅加入实施例2制备所得的CQDs-PEG-Tf(100yg/mL)继续孵育 4h作为对照组；
[0128] (3)孵育完毕，PBS洗涤，采用流式仪检测其荧光强度（380nm激发波长，接受波长 468nm)，结果见图9〇
[0129] 图9为考察靶向纳米载体CQDs-PEG-Tf是否以肿瘤细胞表面转铁蛋白受体介导 的途径进入细胞。结果显示，未加入Fe 3+，即使游离转铁蛋白的浓度不断增加也未能影响载 体CQDs-PEG-Tf进入细胞，而当溶液中含Fe3+时，随着游离转铁蛋白浓度的增加，HepG2细 胞对载体CQDs - PEG-Tf的吸收抑制程度越大，当游离转铁蛋白浓度为1.5mg/mL时，细胞吸 收抑制率约达80%。由此说明靶向纳米载体CQDs-PEG-Tf是通过转铁蛋白受体介导作用 进入细胞。
[0130]实施例12定量检测体外培养HepG2细胞对碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白（CQDs- PEG-Tf) 3#摄取的靶向分析
[0131]为了进一步确定实施例3制备的载体CQDs-PEG-Tf3#具有靶向性，我们采用游离 的转铁蛋白作竞争剂。通过该方法可证明CQDs-PEG-Tf是通过肿瘤细胞表面表达的转铁 蛋白受体(TfR)介导的途径。转铁蛋白有三种构型：人血清转铁蛋白（h-Tf)、铁饱和的转铁 蛋白（holo-Tf)、未含铁转铁蛋白（apo-Tf)，这三种构型的转铁蛋白与其受体的亲和力也有 很大差异:铁饱和的转铁蛋白与其受体的亲和力最大，人血清转铁蛋白次之，未含铁转铁蛋 白的亲和力最弱。由于载体CQDs-PEG-Tf进入细胞的时间要明显比游离的转铁蛋白慢，所以 为了使细胞外有足够的含Fe 3+形式的转铁蛋白与TfR结合，占据TfR位点，达到与载体CQDs-PEG-Tf竞争TfR，我们选择过表达转铁蛋白受体的H印G2细胞作为靶细胞。
[0132] (1)首先取对数生长的HepG2细胞6 X 103/孔的密度接种于90mm培养皿中，培养24h 后，弃液，PBS洗涤，加入不同浓度的游离转铁蛋白（I50yg/mL、350yg/mL和1.5mg/mL)和0.12 ymol/mL Fe3+于37°C、5%⑶2培养箱中培养Ih后，加入实施例3制备所得的CQDs - PEG-Tf (100yg/mL)继续孵育 4h;
[0133] (2)HepG2细胞中仅加入实施例3制备所得的CQDs-PEG-Tf(100yg/mL)继续孵育 4h作为对照组；
[0134] (3)孵育完毕，PBS洗涤，采用流式仪检测其荧光强度（380nm激发波长，接受波长 468歷），结果见图10〇
[0135] 图10为考察靶向纳米载体CQDs-PEG-Tf是否以肿瘤细胞表面转铁蛋白受体介导 的途径进入细胞。结果显示，未加入Fe 3+，即使游离转铁蛋白的浓度不断增加也未能影响载 体CQDs-PEG-Tf进入细胞，而当溶液中含Fe3+时，随着游离转铁蛋白浓度的增加，HepG2细 胞对载体CQDs - PEG-Tf的吸收抑制程度越大，当游离转铁蛋白浓度为1.5mg/mL时，细胞吸 收抑制率约达76%。由此说明靶向纳米载体CQDs-PEG-Tf是通过转铁蛋白受体介导作用 进入细胞。此外，通过比较HepG2细胞对载体CQDs-PEG-Tf l#，CQDs-PEG-Tf 2#和 CQDs-PEG-Tf 3#的抑制率，发现HepG2细胞对这三种载体的抑制率有一定的差别，其对 CQDs - PEG-Tf 3#的抑制率明显低于前两者，这充分说明了载体上偶联转铁蛋白的含量的 增高有利于促进ifepG2细胞对载体的摄取。
[0136] 实施例13碳量子点靶向纳米载体靶向药物的体外杀瘤性实验
[0137] 以抗癌药物丝裂霉素 MMC作为该实施例的药物制剂，以HepG2细胞为靶细胞。取处 于对数生长期的HepG2细胞分别接种于96孔板中，接种浓度为5000个/孔，培养液为含10% FBS的DMEM培养基，放置于37°C、5 %CO2培养箱中培养24h后，吸弃原培养基，每孔按照表1实 验组别设定重新加入200yL含10%FBS的DMEM培养基配制的药物，同时以未加入药物的 HepG2作为阴性对照组，每组均设4个复孔，分别培养24、48和72h，换新鲜培养基和MTT( 5mg/ mL)溶液，继续培养4h后弃上清液，加入二甲基亚砜150yL/孔，振荡IOmin左右，采用MTT测定 吸光值(〇D480nm)，并按照下述公式计算其杀瘤性：
[0138] 杀伤率（％ ) = [(空白组OD值-实验组OD值)/空白组OD值]X 100%
[0139] 表1体外杀瘤性实验组别设定
L0142J 实验结果见表2,从表2可以看出，相比于细胞对照组，三种碳量于点靶向纳米载体 CQDs - PEG-Tf在选定浓度下对细胞的影响很小，说明三种CQDs-PEG-Tf均具有很好的生 物相容性。在24h时，A组中三种CQDs - PEG-Tf 一 MMC对细胞的杀伤作用较弱，但随着时间的 延长，A组中三种CQDs-PEG-Tf 一 MMC对细胞的杀伤作用明显增强，说明A组药物均能够有 效杀死肿瘤细胞。在相同时间和相同丝裂霉素浓度条件下，B组药物对细胞的杀伤力大于A 组药物对细胞的杀伤力，说明CQDs-PEG-Tf一MMC药物具有缓释药物特性。由此说明 CQDs - PEG-Tf 一 MMC药物既具有靶向抗肿瘤效应又具有缓释药物特性。
[0143] 表2体外杀瘤性实验结果
[0145] 实施例14碳量子点靶向纳米载体靶向药物联合免疫细胞的体外杀瘤性实验
[0146] 以免疫细胞CIK和丝裂霉素 MMC作为该实施例的药物制剂，首先取对数生长期的约 I X IO5CIK细胞接种于96孔板中，添加淋巴细胞无血清培养液及因子IFN-γ，5%C02,37°C环 境下培养，24h后加入因子IL-2和抗CD3单抗继续培养5d，收获CIK细胞。取处于对数生长期 的HepG2细胞分别接种于96孔板中，接种浓度为5X IO3个/孔，培养液为含10%FBS的DMEM培 养基，放置于37 °C、5 % CO2培养箱中培养24h后，吸弃原培养基，每孔按照表3实验组别设定 分别重新加入200yL含10%FBS的DMEM培养基配制的药物lOOyg/mL CQDs-PEG-Tf+2yg/mL MMC+重悬好的免疫细胞CIK悬液(浓度为I X lOVmL)和重悬好的免疫细胞CIK悬液(浓度为1 X 107/mL)+2yg/mL MMC(详见表3)，同时以未加入药物的HepG2作为阴性对照组。每组均设4 个复孔，分别培养12、24和48h，换新鲜培养基和MTT (5mg/mL)溶液，继续培养4h后弃上清液， 加入二甲基亚砜150yL/孔，振荡IOmin左右，采用MTT测定吸光值(0D480nm)，并按照下述公 式计算其杀瘤性：
[0147] 杀伤率（％) = [(空白组OD值-实验组OD值)/空白组OD值]X 100%
[0148] 表3体外杀瘤性实验组别设定
[0150] 实验结果见表4,从表4可以看出，相比于细胞对照组，A组药物和B组药物对细胞均 具有杀伤作用，且在相同时间和相同药物制剂浓度条件下，B组药物对肝癌细胞的杀伤力均 大于A组药物对肝癌细胞的杀伤力，说明碳量子点靶向纳米载体CQDs-PEG-Tf对药物具有 缓释特性。在12h时，A组药物对细胞的杀伤作用较弱，但随着时间的延长，A组药物对细胞的 杀伤力显著增强，进一步说明了 CQDs - PEG-Tf对药物的缓释特性，且其靶向药物后联合免 疫细胞应用可大幅度增强抗癌效果。
[0151]表4体外杀瘤性实验结果
【主权项】
1. 一种辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系，其特征在于:所述的靶向纳米载药体 系是以纳米材料碳量子点CQDs为载体，聚乙二醇PEG为交联物，转铁蛋白Tf为靶向分子，通 过共价偶联形成的靶向纳米载体CQDs-PEG-Tf，其中每毫克CQDs - PEG偶联转铁蛋白的含 量为282-316微克，其粒径大小为224.5 ± 90.2nm。2. 如权利要求书1所述的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的制备方法，其特征 在于:包括如下步骤： 1) 将抗坏血酸溶于水中，搅拌均匀后，加入PEG搅拌，微波反应，将所得溶液过滤、洗涤 和纯化后，即得碳量子点水溶液;所得的碳量子点水溶液除去过量的溶剂，干燥，得到碳量 子点，粒径为7 · 32 ± 0 · 98nm; 2) 取步骤1)所得干燥碳量子点，按比例加入无水N，N二甲基甲酰胺DMF和二氯亚砜 SOCl 2，搅拌反应，反应结束旋除去过量的SOCl 2，得到酰氯化的碳量子点； 3) 取步骤2)所得酰氯化的碳量子点，按比例加入无水DMF中，并按比例加入聚乙二醇和 三乙胺，搅拌反应;离心，除去上清液，得沉积物碳量子点-聚乙二醇CQDs-PEG-OH，并烘 干； 4) 取步骤3)所得干燥碳量子点-聚乙二醇CQDs-PEG-OH中按比例加入无水DMF形成悬 浊液后，按质量比加入琥珀酸酐SA和4-二甲胺基吡啶DMAP，搅拌反应;离心，除去上清液，得 沉积物碳量子点-聚乙二醇CQDs - PEG-COOH，并烘干； 5) 取步骤4)所得干燥沉积物碳量子点-聚乙二醇CQDs-PEG-⑶OH按比例加入至硼酸 缓冲溶液，形成悬浊液后，按比例加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC，常温下搅 拌反应;反应液中按质量比加入转铁蛋白Tf，摇匀过夜，离心，除去上清液，得沉积物碳量子 点-聚乙二醇-转铁蛋白CQDs - PEG-Tf。3. 根据权利要求书2所述的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的制备方法，其特 征在于:所述步骤1)中，抗坏血酸在反应液中的浓度为0.03g/ml，PEG在反应液中的的体积 百分数为66.7 % ;透析袋截留分子量为8000;微波功率200~400W，设定温度60~100°C，微 波作用时间80~200秒。4. 根据权利要求2所述的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的制备方法，其特征 在于:所述步骤2)中，无水N，N二甲基甲酰胺(DMF)溶剂的体积与碳量子点的质量比为(0.1- 0.2)mL: Img，二氯亚砜(SOCh)的体积与碳量子点的质量比为(0.4-0.6)mL: Img，反应温度 为65-70 °C。5. 根据权利要求2所述的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的制备方法，其特征 在于:所述步骤3)中，无水DMF的体积与碳量子点的质量比为(0.5-0.8)mL: Img;聚乙二醇与 碳量子点的质量比为（2-2.5): 1;三乙胺的体积与酰氯化碳量子点的质量比为(0.05-0.1) mL: lmg，反应温度为100°C。6. 根据权利要求2所述的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的制备方法，其特征 在于：所述步骤4)中，无水DMF的体积与CQD s-PEG-OH的质量比为（2.0-3.0) mL: I mg， CQDs-PEG-OH、琥珀酸酐SA和4-二甲胺基吡啶DMAP质量比为1: (2-2 · 5): (2-2 · 5)，反应温 度为l〇〇°C。7. 根据权利要求2所述的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的制备方法，其特征 在于:所述步骤5)中，硼酸缓冲溶液的体积与CQDs - PEG-COOH的质量比为(0.4-0.6)mL: lmg，硼酸缓冲溶液pH为8.0; 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC与CQDs-PEG-COOH 的质量比为(2.2-2.5): 1，所用的转铁蛋白Tf的分子量为80kDa，CQDs-PEG-COOH与转铁蛋 白的质量比1:(0.3-1)。8. 含有如权利要求1-7任意一项所述的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的免疫 细胞一 CQDs-PEG-Tf复合物，其特征在于，采用如下制备方法制成：首先按照每种类型的 免疫细胞的标准培养方法对免疫细胞进行体外培养、诱导、扩增获得免疫细胞，在获得的免 疫细胞中加入CQDs-PEG-Tf共同孵育后得到免疫细胞内吞碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白 复合物，即免疫细胞一 CQDs - PEG-Tf复合物。9. 根据权利要求8所述的免疫细胞一CQDs - PEG-Tf复合物，其特征在于：制备过程中 所加入的CQDs-PEG-Tf复合物浓度为40-100yg/mL，所述的免疫细胞选自树突状细胞DC、 细胞毒性T淋巴细胞CTL、自然杀伤细胞NK、细胞因子诱导的杀伤细胞CIK或肿瘤浸润性淋巴 细胞TIL，其浓度为IO 5-IO8Ail。10. 含有如权利要求1-7任意一项所述的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的 CQDs-PEG-Tf 一药物分子复合物，其特征在于，采用如下制备方法制成:将抗癌药物分子 通过物理吸附作用结合CQDs - PEG-Tf形成CQDs - PEG-Tf 一药物分子复合物。11. 根据权利要求10所述的CQDs - PEG-Tf 一药物分子复合物，其特征在于，所述的抗 肿瘤药物分子是能通过物理吸附作用结合靶向纳米载体CQDs - PEG-Tf的药物分子。12. 含有如权利要求10所述的CQDs-PEG-Tf 一药物分子复合物的免疫细胞一 CQDs- PEG-Tf 一药物分子复合物，其特征在于，采用如下制备方法制成:首先按照每种类型的免 疫细胞的标准培养方法对免疫细胞进行体外培养、诱导、扩增获得免疫细胞，在获得的免疫 细胞中加入CQDs-PEG-Tf 一药物分子复合物共同孵育，得到免疫细胞内吞碳量子点-聚乙 二醇-转铁蛋白-药物分子复合物，即免疫细胞一 CQDs - PEG-Tf 一药物分子。13. 根据权利要求11所述的免疫细胞一CQDs-PEG-Tf 一药物分子复合物，其特征在 于：制备过程中所加入的CQDs-PEG-Tf 一药物分子复合物浓度为40-100yg/mL，所述的免 疫细胞选自树突状细胞DC、细胞毒性T淋巴细胞CTL、自然杀伤细胞NK、细胞因子诱导的杀伤 细胞CIK或肿瘤浸润性淋巴细胞TIL，其浓度为IO 5-IO8Ail。14. 如权利要求1-7任意一项所述的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系CQDs - PEG-Tf在制备抗肿瘤药物中的应用。15. 如权利要求10-11任意一项所述的CQDs-PEG-Tf 一药物分子复合物在制备肿瘤靶 向治疗药物中的应用。16. 如权利要求8-9任意一项所述的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的免疫细 胞一 CQDs - PEG-Tf复合物在制备肿瘤靶向治疗药物中的应用。17. 如权利要求12-13任意一项所述的辅助免疫细胞疗法的免疫细胞一 CQDs-TOG- Tf 一药物分子复合物在制备肿瘤靶向治疗药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK105944110SQ201610448034
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月20日
【发明人】徐妍, 陈蕾, 郭世磊
【申请人】徐妍