脂肪酸短链酯化中的脂肪酶的制作方法

脂肪酸短链酯化中的脂肪酶的制作方法
【专利摘要】已经发现，马铃薯糖蛋白，一种可从马铃薯中得到的脂肪酶，在产生脂肪酸烷基酯的脂肪酸酯化反应中具有优点。描述了应用该脂肪酶活性的方法，以及马铃薯糖蛋白在各种工业过程中的用途。
【专利说明】脂肪酸短链酯化中的脂肪酶

【技术领域】
[0001] 众所周知，脂肪酶能够在有机介质中催化形成酯。因此，通过使用脂肪酶，羧酸可 以在足够的游离的羟基取代的化合物的存在下转化成酯。

【背景技术】
[0002] 脂肪酶的使用在工业中是常见的。例子包括：外消旋药物拆分、脂肪和脂质改性、 香料合成，以及药物和营养品的生产。目前使用的脂肪酶的绝大部分是通过使用真菌或细 菌发酵体系而获得的，尽管动物来源的脂肪酶也见到一些使用。植物来源的脂肪酶对于工 业应用来讲相对罕见。
[0003] 大部分工业上适用的脂肪酶由细菌发酵混合物而获得。随后，该脂肪酶必须通过 使用繁琐的下游处理而被分离。这是困难且昂贵的过程，限制了它们的可用性。因此，这 样的脂肪酶往往具有低的基于总基和蛋白质基（total-andprotein-basis)的纯度,并且 还含有大量的碳水化合物、盐和可能的不期望副活性。此外，商业脂肪酶制剂通常含有各种 各样的非蛋白物质、盐和非脂肪酶的酶（Bjurlin等人，2001年，《JA0CS78-2》，153-160页 (Bjurlinetal2001JA0CS78-2p153-160))。
[0004] 通常，需要脂肪酸的酯化反应依赖于使用含有高含量游离脂肪酸的发酵泥 (fermentationsludge)。这导致高度可变的混合物，其中游离脂肪酸作为很多杂质中的成 分而存在。存在于细胞膜中的磷脂是这些杂质的重要成分。例如，常用的脂肪酶诺维信435 脂肪酶（Novozyme435)需要脱胶油，以便由油来生产酯；磷脂的存在抑制酯化反应。脂肪 酶通常难以对付大量的杂质，这导致脂肪酸酯的合成效率低。
[0005] 植物来源的脂肪酶可由马铃薯获得。马铃薯蛋白可分为三类：（i)马铃薯糖蛋白 (patatin)家族，高度同源性的酸性43kDa糖蛋白（40-50重量％的马铃薯蛋白）；（ii)碱 性5-25kDa蛋白酶抑制剂（30-40重量％的马铃薯蛋白）；和（iii)主要为高分子量蛋白的 其它蛋白质（10-20重量％的马铃薯蛋白）。已知，马铃薯糖蛋白家族具有一些脂肪酶活性， 并且可以通过单步层析法，随后进行浓缩和干燥而获得。申请W02008/069650中描述了尤 其用于分离高纯度马铃薯糖蛋白的非常方便的方法。
[0006] 然而，在实践中，马铃薯蛋白，包括被称为马铃薯糖蛋白的马铃薯蛋白脂肪酶，因 为缺乏实际商业用途而已被主要用作动物饲料。


【发明内容】

[0007] 本发明提供一种使用马铃薯糖蛋白合成特定酯的方法。因此，马铃薯糖蛋白可被 用于由C4-C26脂肪酸，优选C4-C12脂肪酸，更优选C6-Cltl脂肪酸且最优选C8-Cltl脂肪酸来制 备酯。用本发明的方法所得到的酯由C1-C3醇，优选单羟基醇，更优选乙醇或甲醇且最优选 甲醇来制备。

【专利附图】

【附图说明】
[0008] 图I :不同甲醇浓度下残留的脂肪酶活性。
[0009] 图2 :通过马铃薯糖蛋白合成的脂肪酸烷基酯（FAAE)的薄层层析。泳道（lane) 1 含有游离脂肪酸（FFA，具体为月桂酸，C12)，泳道2含有椰子油类FAME，泳道3至7分别含有 月桂酸与甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇和正丁醇的反应产物。
[0010] 图3 :在增加的盐浓度的存在下的脂肪酸的沉淀。左：在辛酸和除矿质水 (demi-water)的两相体系中未沉淀的辛酸。右：在辛酸和饱和KCl水性溶液的两相体系中 脂肪酸辛酸的沉淀。

【具体实施方式】
[0011] 对于本发明的范围，马铃薯糖蛋白被理解为是指天然马铃薯蛋白分离物的高分子 量（HMW)部分，分子量为30kDa或更多，优选为35kDa或更多，且更优选为约43kDa，等电点 小于5. 8,优选为4. 8至5. 5的高度同源性的糖蛋白家族，它构成马铃薯蛋白的约40-50重 量％。马铃薯糖蛋白是一类显示出酰基水解酶反应性的糖蛋白，并且占马铃薯块茎中总可 溶性蛋白的多达40重量％。在申请W02008/069650中，描述了从马铃薯果汁（PFJ，potato fruitjuice)或马铃薯果水（PFW，potatofruitwater)中分离马铃薯糖蛋白的详尽说明， 该申请通过引入并入本文中。
[0012] 该方法需要使马铃薯果汁经受在pH为7-9下用二价金属阳离子进行的絮凝，并且 离心絮凝的马铃薯果汁，由此形成上清液。接着，使用能够结合马铃薯蛋白的吸附剂，使上 清液经受在PH小于11和温度为5-35°C下操作的膨胀床吸附层析，从而使天然马铃薯蛋白 吸附至该吸附剂。最后，用洗脱液将至少一种天然马铃薯蛋白分离物从吸附剂中洗脱出。这 种方法尤其产生分离的高纯度的天然马铃薯糖蛋白，该分离的高纯度的天然马铃薯糖蛋白 具有最少量的变性蛋白质并且特征在于稳定的溶解性。
[0013] 马铃薯果汁在pH为7-9,优选为7. 0-7. 5下用二价金属阳离子进行预处理，以絮凝 不希望的物质，随后通过离心分离出絮凝物（flock)。特别合适的二价金属阳离子是Ca2+。 这种预处理从马铃薯果汁中除去不希望的物质，诸如带负电的聚合物、果胶、配糖生物碱和 微生物。具体地，除去果胶和配糖生物碱是有利的，因为这些化合物粘附马铃薯蛋白并且可 引起絮凝，从而产生就溶解性和其它物理性质而言不稳定的蛋白分离物。
[0014] 在该方法的第二步骤中，使上清液经受膨胀床吸附层析。有利的是，将原料的温度 保持低于35°c以使马铃薯糖蛋白的稳定性更好。此外，优选的是，使用适当高的流速，流速 通常在600-1200cm/h的范围内。膨胀床吸附层析在pH小于11，优选在pH小于10下进行 操作。
[0015] 在膨胀床吸附柱中，通过将预处理的马铃薯果汁中的天然马铃薯蛋白结合到合适 的吸附剂上而将它们从上清液中分离出来。结合一定量的天然马铃薯蛋白的柱材料包括： 混合模式的吸附剂，诸如AmershamStreamline?DirectCSTI(GEHealthcare(通用电气 医疗集团））、Fastlineadsorbentia(UpfrontChromatographyA/S)(快线吸附剂（前期 层析4/5));大孔吸附剂，诸如八1111^1^ 6"^407即（11511111&!^8公司）；和离子交换吸附 齐U。随后，用合适的洗脱液对吸附有天然马铃薯蛋白的吸附剂进行洗脱，以便回收天然马铃 薯蛋白分离物，诸如马铃薯糖蛋白。洗脱液的pH优选在4-12的范围内，更优选在5. 5-11. 0 的范围内。
[0016] 在优选实施方式中，通过使用混合模式的吸附剂，蛋白质可根据等电点和分子量 进行分馏。这使得例如马铃薯糖蛋白馏分和蛋白酶抑制剂馏分分离。马铃薯糖蛋白分离物 在pH为5. 7-8. 7下，优选在pH为5. 8-6. 5下进行洗脱。
[0017] 酰基水解酶反应性通常被理解为：（一类）酶催化酯键被水分子水解以形成组 分羧酸和醇的能力。通过适当调整反应条件，该反应可发生逆转，在这种情况下，发生羧 酸和醇的酯化。可影响反应方向的反应条件包括：例如温度、反应物恒等式（reactant identity)，和/或存在的水、羧酸和醇的量。
[0018] 按照本发明，已经发现，马铃薯糖蛋白对有机环境具有相对强的耐性。此外，因为 将马铃薯糖蛋白是从常见的植物材料中分离出来，所以容易大量得到，比由发酵液和繁琐 的下游处理所获得的分离的脂肪酶更容易。
[0019] 由于这个原因，马铃薯糖蛋白非常适合于制备C4-C26脂肪酸，优选C4-C12脂肪酸， 更优选C6-Cltl脂肪酸，最优选C8-Cltl脂肪酸的酯。通过与醇，优选小分子醇，即C1-C3的醇，进 行反应而得到上述酯。小分子醇可以以纯物质或几种小分子醇的混合物的形式进行提供。 优选使用单羟基醇，甚至更优选使用乙醇或甲醇，并且最优选使用甲醇。
[0020] 在优选实施方式中，使用C1或C2单羟基醇，即甲醇或乙醇或它们的混合物，来制备 C4-C26脂肪酸，优选C4-C12脂肪酸，更优选C6-Cltl脂肪酸，最优选C8-Cltl脂肪酸的甲酯和乙酯。
[0021] 根据本发明，已经发现，根据本发明的马铃薯糖蛋白的酰基水解酶反应性可以引 起脂肪酸与小分子醇的酯化。以此方式，马铃薯糖蛋白的酰基水解酶反应性能用于合成酯。 因此，即使这种混合物含有大量的杂质，马铃薯糖蛋白也能用于制备短链脂肪酸烷基酯的 方法中。
[0022] 因此，本发明涉及一种用于优选选择性地制备脂肪酸烷基酯的方法，包括：提供包 括一种或多种C4-C26脂肪酸、一种或多种C1-C3醇，和天然马铃薯糖蛋白的液体介质；以及使 一种或多种脂肪酸与一种或多种醇反应以得到脂肪酸烷基酯。
[0023] 在根据本发明的方法中，脂肪酸是C4-C26脂肪酸，优选C4-C12脂肪酸，更优选C6-Cltl 脂肪酸，且最优选C8-Cltl脂肪酸。
[0024] -种或多种C1-C3醇优选包括一种或多种单羟基醇，其中，使用正丙醇、异丙醇、乙 醇和/或甲醇，且更优选使用甲醇和/或乙醇。
[0025] 在更优选的实施方式中，醇是甲醇和/或乙醇，脂肪酸是C4-C12脂肪酸，并且脂肪 酸烷基酯是C4-C12脂肪酸的甲酯或乙酯。
[0026] 根据链长脂肪酸链分为短链至超长链：
[0027] ?短链脂肪酸（SCFA)是比C6短的脂肪酸。
[0028] ?中链脂肪酸（MCFA)是C6-C12脂肪酸。
[0029] ?长链脂肪酸（LCFA)是C13-C21脂肪酸。
[0030] ?超长链脂肪酸（VLCFA)是比C22长的脂肪酸。
[0031] 一般情况下，脂肪酶对酯化混合物中存在的杂质敏感。然而，马铃薯糖蛋白对杂质 特别是对磷脂很不敏感。因此，本发明的方法的优点在于：相比于其它脂肪酶，脂肪酸原料 可以含有更多量的杂质，特别是磷脂。
[0032] 在其它酶基酯化反应中，磷脂的存在常常抑制酯化反应。由于这个原因，必须从脂 肪酸原料中除去磷脂。这导致原料更昂贵，从而导致产品更昂贵。因此，与其它脂肪酶基酯 化过程相比，使用马铃薯糖蛋白使酯产品更便宜。
[0033] 本发明的方法中的脂肪酸可以由脂肪酸原料供给。此原料是固体介质或液体介 质，尤其包括，在本发明中使用的脂肪酸。优选地，原料是液体介质。该液体介质可以包括 溶剂，但进行本发明的方法也可以不使用溶剂，在例如介质是熔化的条件下。
[0034] 脂肪酸原料包括至少一种C4-C26脂肪酸，或C 4-C26脂肪酸的任何混合物，以产生 C4-C26脂肪酸的酯。具体地，根据本发明的与醇反应的原料包括短链脂肪酸或中链脂肪酸 (即C 4-C12脂肪酸）中的至少一种或其任何混合物。更优选原料包括C6-Cltl脂肪酸，最优选 C 8-Cltl脂肪酸中的至少一种或其任何混合物。这产生C4-C12脂肪酸的酯，优选C 6-Cltl脂肪酸 的酯，最优选C8-Cltl脂肪酸的酯。
[0035] 脂肪酸原料中的脂肪酸可以以任何形式存在，诸如以甘油单酯、甘油二酯和/或 甘油三酯的形式结合到甘油，但是原料也可以包括磷脂或部分水解的磷脂。此外，脂肪酸可 作为游离脂肪酸存在于原料中。而且，可以存在这些组分中任意组分或所有组分的混合物， 以及其它非脂肪酸结合的组分。然而，优选地，脂肪酸作为游离脂肪酸至少以显著量存在于 原料中。在这种情况中，显著量为6g/L，优选高于90g/L。
[0036] 本方法的优点是游离脂肪酸可以相对大量地存在。最优选，基于原料的重量，游离 脂肪酸的量（以脂肪酸原料中存在的脂肪酸的总量的百分比表示）为至少25重量％，优选 高于40重量％。
[0037] 合适的脂肪酸原料的实例是动物脂肪或动物油、植物油，尤其是水解的植物油和/ 或氧化的植物油，诸如，例如用过的煎炸油、变坏的黄油脂肪和低质量动物脂。
[0038] 然而，在替代实施方式中，脂肪酸原料是发酵泥。因为根据本发明的方法使用马铃 薯糖蛋白增加对杂质的耐受性，所以发酵泥原料（它含有醇）非常适合于脂肪酸的酯化。本 发明的明显优点是，杂质（尤其重要的是磷脂）可以大量地存在于反应介质中而不阻碍酯 化反应。
[0039] 本发明中使用的醇是至少一种C1-C3醇，优选单羟基醇，且更优选甲醇和/或乙醇。 这些醇与短链脂肪酸的酯往往非常芳香，同时这些醇与中链脂肪酸或长链脂肪酸的酯可以 有利地用作生物柴油。优选地，C 1-C3单羟基醇是末端醇，S卩，甲醇、乙醇和1-丙醇。然而， 更优选，醇是C1-C 2醇，S卩，甲醇或乙醇。然而，最优选，使用甲醇作为脂肪酸受体。因为短链 醇在马铃薯糖蛋白的存在下与脂肪酸的反应性更高，所述优选短链醇。
[0040] 在根据本发明的方法中，马铃薯糖蛋白可以固定于载体上而存在，但是优选使用 没有载体的马铃薯糖蛋白。用于固定脂肪酶的载体为本领域所熟知。实例是硅藻土。因此， 它可以以溶解的形式或分子分散的形式存在，这取决于反应介质的性质。优选的是，马铃薯 糖蛋白自由地悬浮在反应介质中。
[0041] 脂肪酶的缺点是，脂肪酶通常需要大量的盐，诸如多达50 %的钾盐，以使它们在自 由溶液中稳定。然而，因为盐诱导结晶，所以盐对脂肪酸的酯化反应具有阻碍作用。由于这 个原因，在现有技术中，脂肪酶通常以在载体上的固定形式使用。在没有载体的情况下，即 自由地悬浮在介质中，马铃薯糖蛋白不需要使用盐稳定，由于这个原因，特别适合于根据本 发明的脂肪酸与低分子量醇的酯化。
[0042] 正如已提到的，进行本发明的方法的反应介质优选液体，并且至少包括本发明的 脂肪酸原料和或多种醇。此外，该介质可以包括溶剂，诸如水和/或有机化合物，诸如溶剂， 例如脂族化合物、醚、酯或芳族化合物。
[0043] 使用马铃薯糖蛋白的优点是在酯化反应期间可以存在显著量的水。因此，基于反 应介质的体积，在反应介质中水含量高至91体积％的情况下，本发明可以运作。然而，优 选，基于反应介质的体积，水含量低于73体积％，甚至更优选低于40体积％，更优选低于19 体积％。基于反应介质的体积，反应介质中水含量高于50体积％的情况下，被称为水性的。 [0044] 然而，本发明的方法也可以在基本为有机介质中进行（基于反应介质的体积，水 含量低于50体积％)。在那种情况下，基于反应介质的体积，反应容器中的水含量可以低 至5体积％，或甚至低至2体积％。优选的是，即使该方法在基本为有机介质中进行，基于 反应介质的体积，也至少存在一些水，即至少2体积％的水。
[0045] 在介质基本为有机介质的情况下，脂肪酸原料用至少本发明的醇稀释，在该实施 方式中醇可以起到溶剂以及反应物的作用。也可以使用不同的溶剂，可以适当地选择该不 同的溶剂以实现所有反应组分的快速溶解。合适的实例包括：辛烷、异辛烷、戊烷、己烷、庚 烷、石油醚和丁醇。优选的溶剂是辛烷和异辛烷。将理解的是，可以使用溶剂的组合，溶剂 的组合包括一种或多种溶剂和起到溶剂作用的醇的组合。
[0046] 基于反应介质的重量,脂肪酸在反应介质中的浓度优选为12至84重量％。优选 地，这些脂肪酸以游离脂肪酸的形式存在。
[0047] 醇在反应介质中的浓度优选为相对于游离脂肪酸稍微摩尔过量。在熔化的介质 中，基于反应介质的重量，游离脂肪酸优选以高于80重量％的浓度，更优选以高于84重 量％的浓度存在。在有机溶剂中，基于反应介质的重量，游离脂肪酸以高于10重量％的浓 度，更优选以12重量％的浓度存在。
[0048] 一般情况下，基于脂肪酸的量，马铃薯糖蛋白以1重量％的浓度，更优选以10重 量％的浓度存在。
[0049] 因此，本发明还公开了一种优选选择性地制备脂肪酸烷基酯的方法，包括：以任何 顺序将天然马铃薯糖蛋白与脂肪酸、一种或多种醇和任选的其它组分混合，其中，混合物包 括显著量的磷脂；以及使发生酯化，其中，脂肪酸优选包括短链脂肪酸或中链脂肪酸，并且 其中，醇是C1-C3单羟基醇，优选甲醇和/或乙醇，并且其中，脂肪酸烷基酯是C4-C12脂肪酸 的C1-C3酯，优选为C4-C12脂肪酸的甲酯或乙酯。如果马铃薯糖蛋白在没有固定在载体上的 情况下（这是优选的）使用，那么优选进行混合以使马铃薯糖蛋白将自由地悬浮在反应介 质中。在替代实施方式中，有利地，在整个反应中醇可以在不同的时间间隔时以等分试样添 加或连续添加，以控制反应速率并且避免酶变性。当然，为了实现良好的反应产率，醇的总 量必须足以实现所需的转化。
[0050] 在优选实施方式中，根据本发明的方法在不存在额外的溶剂的情况下进行。在 那种情况下，反应介质包括：脂肪酸原料，该脂肪酸原料包括短链脂肪酸或中链脂肪酸；和 醇，优选甲醇或乙醇。根据该实施方式，本方法优选在介质是熔化的条件下进行。
[0051] 本领域技术人员在其公知常识的基础上可以对反应条件进行优化。例如，只要不 影响马铃薯糖蛋白的稳定性和反应性，反应温度并不关键。优选地，反应在环境条件下或在 高于脂肪酸原料熔点的温度下进行。合适的反应温度通常介于10和75°c之间，优选介于 15至60°C之间，更优选介于20至45°C之间。
[0052] 优选地，将所得的脂肪酸烷基酯从反应混合物中分离出来，并且可选地进一步纯 化，例如通过蒸馈、液-液萃取或超临界CO2萃取。
[0053] 本发明的方法可以方便地用于生产生物柴油。因此，本发明公开了一种用于生产 生物柴油的方法，包括：将马铃薯糖蛋白与脂肪酸原料和一种或多种C1-C3醇混合，其中，月旨 肪酸原料包括一种或多种C4-C26脂肪酸；以及使一种或多种脂肪酸与一种或多种醇反应。 在这种方法中，马铃薯糖蛋白优选自由地悬浮在原料中。
[0054] 特别有利的是，在这种方法中使用马铃薯糖蛋白，因为马铃薯糖蛋白易于从普通 植物中获得，并且可以大量地分离出来。而且，马铃薯糖蛋白可以由包括相对大量的杂质 (诸如磷脂）的原料来生产生物柴油。最后，盐的存在使将转化为生物柴油的脂肪酸的熔点 升高。因为，当使用马铃薯糖蛋白时，相比于其它脂肪酶，自由地悬浮的马铃薯糖蛋白不需 要盐稳定，所以避免了在生物柴油生产期间存在的盐的负面影响。这产生可以用作生物柴 油的根据本发明的脂肪酸烷基酯。
[0055] 通过下面的非限制性实施例对本发明进行进一步说明。
[0056] 实施例1 :有机溶剂中的脂肪酶活性
[0057] 许多脂解过程在有机溶剂中或在这些溶剂的水性混合物中进行。典型的实例是由 甘油三酯或游离脂肪酸生产生物柴油。在这些情况下，低分子量（MW)醇被用作酰基受体以 形成脂肪酸烷基酯（FAAE)。醇同时是反应物和溶剂。因为所得的生物柴油的价格和质量， 甲醇是优选的醇。
[0058] 这种方式可以耐受反应混合物中的水，但是的确需要经历高浓度醇仍存活的酶来 提供使反应发生的驱动力。
[0059] 在不同的甲醇浓度下，使马铃薯糖蛋白（Solanic206P)与在IOmM的pH为6.5的 缓冲液中的ImM发色丁酸对硝基苯酯接触。这些体系中的马铃薯糖蛋白活性通过在伯乐 680型读板仪（BioRadModel680platereader)上测量405nm处的吸光度增加来测定，并 且以mOD/分钟表示。结果表明，马铃薯糖蛋白可以耐受多达20%的甲醇而不丧失活性，并 且在丧失所有活性之前可以存在大于40 %的甲醇。
[0060] 实施例2 :在熔化基质中用马铃薯糖蛋白来合成脂肪酸烷基酯
[0061] 使在100μL除矿质水中的IOmg的马铃薯糖蛋白（Solanic206P)与5mmol(I. Og) 的月桂酸（Merck8. 05333)和等摩尔量的甲醇（Merck1. 06007)、乙醇（Prolabo 83804. 360)、正丙醇（AlfaAesarA19902)、异丙醇（Prolabo437423R)或正丁醇（Merck 1.01990)接触。添加除矿质水以产生20% (v:v)醇在水中的溶液。在剧烈搅拌下，使混合 物在45 °C下温育过夜。
[0062] 通过将Ig椰子脂肪（SigmaAldrichC1758)溶解在含1. 85 %的浓盐酸（Merck 1.00317)的IOOmL甲醇中，并且使混合物回流4小时制备了参照脂肪酸甲酯（FAME)。蒸发 反应产物以得到澄清的黄色油状物。
[0063] 反应产物通过在硅胶板（UniplateZ26529-2)上的TLC进行分析，其中，该硅胶板 用在50%水性乙醇中的2. 4%硼酸（Fluka15663)进行预处理。
[0064] 所有样品在由正己烧（MerckL04367)、乙酿（MerckL00921)和乙酸（Prolabo 20104. 334)以80:20:2的比例组成的TLC洗脱液中稀释20倍，并且将单毛细管体积点样到 板上。使板在洗脱液中运行，并且在空气中干燥。用浓硫酸（Merck1.00371)对板进行喷 雾。这种处理使月桂酸及其酯相对于蓝色背景显示为白点（图10)。
[0065] 显色的TLC板示出：在第1泳道的大致一半高的游离月桂酸，以及在第2泳道的运 动至接近前沿的FAME。
[0066] 用马铃薯糖蛋白和醇温育的月桂酸示出：残留量的游离脂肪酸在距离底部的中 途，以及脂肪酸烷基酯在前沿，靠近板的顶部。马铃薯糖蛋白催化由游离脂肪酸和小醇形成 FAAE，并且最高的转化率以甲醇、乙醇，和正丙醇的顺序发生。
[0067] 实施例3 :在有机溶剂中通过马铃薯糖蛋白来合成脂肪酸烷基酯
[0068] 将辛酸（Merck8. 00192. 1000)和 20% 甲醇（MerckIiChrosolvL06007. 1000)混 合到异辛烷（SigmaAldrich360597)中，以使得辛酸和甲醇大约为等摩尔量（在异辛烷中， 11.OmL的辛酸和16. 8mL的20%的甲醇）。添加500mg的马铃薯糖蛋白（Solanic206P)和 40mg的水。以相同的方式制备空白样品，但没有马铃薯糖蛋白。反应在水浴中加热的具有 封闭盖的封闭试管中进行。使溶液在50°C下温育四小时。从反应容器中取等分试样，并且 在纯乙腈（MerckLiChrosolvl. 00030. 25007)中稀释10倍，并且通过HPLC进行分析。HPLC 配备有反相娃胶柱（C18琼脂糖）、202nm下操作的UV检测器（KnauerSmartlineUV检测器 2600)和梯度混合器（SmartlineManager5000洗脱液混合器）。使乙腈梯度应用于HPLC 实验。
[0069] 通过与超纯水（miIliQwater)混合以及0· 5μm过滤来制备50%乙腈洗脱液。用 洗脱液对柱进行预处理。将样品直接注入乙腈中，并且在20分钟的时间内在50至100%乙 腈梯度上进行洗脱。由纯辛酸甲酯（SigmaAldrich260673-23G)制订的校准曲线对脂肪酸 甲酯进行定量。
[0070] 马铃薯糖蛋白样品示出：12%的辛酸转化为相应的甲酯，表明酯化成功。
[0071] 实施例4 :马铃薯糖蛋白的磷脂酶活性
[0072] 通过超声30分钟，将不同酰基链长的磷脂分散在含有0. 5%阿拉伯树胶和IOOmM 的TritonXlOO的水性溶液中。马铃薯糖蛋白的添加量多达lOOmg，并且，通过在pH7. 5下 操作的pH计装置（pHstatsetup),监测氢氧化钠的消耗。
[0073] 链长至9的二酰基甘油磷酸胆碱易于使马铃薯糖蛋白水解。
[0074] 表2 :在环境温度下以mmol/分钟/g马铃薯糖蛋白计的马铃薯糖蛋白对各种基质 的活性
[0075] 链长1，2-二酰基-sn-3-甘油磷酸胆碱
[0076]

【权利要求】
1. 一种用于选择性地制备脂肪酸烷基酯的方法，包括： 提供液体介质，所述液体介质包括一种或多种c4-c26脂肪酸、一种或多种Ci-Q醇，和天 然马铃薯糖蛋白；以及 使所述一种或多种脂肪酸与所述一种或多种醇反应以得到所述脂肪酸烷基酯。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，马铃薯糖蛋白自由地悬浮在所述液体介质中。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述醇是甲醇和/或乙醇，其中，所述脂肪酸 是C4-C12脂肪酸，并且其中，所述脂肪酸烷基酯是C4-C12脂肪酸的甲酯或乙酯。
4. 根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述介质基本上仅包括脂肪酸原 料以及甲醇或乙醇，所述脂肪酸原料包括短链脂肪酸或中链脂肪酸。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述介质是熔化的。
6. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述醇是甲醇。
7. -种用于生产生物柴油的方法，包括： 将马铃薯糖蛋白与脂肪酸原料和一种或多种醇混合，其中，所述脂肪酸原料包括 一种或多种(；-(：26脂肪酸；以及 使所述一种或多种脂肪酸与所述一种或多种醇反应。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中，马铃薯糖蛋白自由地悬浮在所述原料中。
9. 根据权利要求7或8所述的方法，其中，所述醇是甲醇和/或乙醇，其中，所述脂肪酸 是C4-C12脂肪酸，并且其中，所述脂肪酸烷基酯是C4-C12脂肪酸的甲酯或乙酯。
10. 根据权利要求7-9中任意一项所述的方法，其中，所述原料基本上仅包括脂肪酸原 料以及甲醇或乙醇，所述脂肪酸原料包括短链脂肪酸或中链脂肪酸。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中，所述原料是熔化的。
12. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述醇是甲醇。
【文档编号】C11B3/00GK104428420SQ201380035725
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年7月3日 优先权日:2012年7月4日
【发明者】罗宾·埃里克·雅各布斯·斯贝尔布灵克, 马尔克·路易吉·费代里科·朱塞平, 马敦·罗伯特·艾格蒙特 申请人:艾维贝合作公司