专利名称：一种静电纺多壁碳纳米管含糖纳米纤维膜的制备的制作方法
技术领域：
本发明属于纳米纤维膜的制备领域，特别涉及一种静电纺多壁碳纳米管含糖纳米纤维膜的制备方法。
背景技术：
自从1991年Iijima发现碳纳米管以来，由于其独特的物理和化学性质受到了人们的广泛关注。碳纳米管是由类似石墨结构的六边形网格卷绕而成的、同轴中空“微管”，两端的“碳帽”由五边形或七边形网格参与封闭。根据石墨层片数的不同，可以分为单壁碳纳米管(SWCNT)、双壁碳纳米管(DWCNT)和多壁碳纳米管(MWNT)。碳纳米管具有良好的导电性，若将其加入到高分子材料中，可使高聚物的电阻降低三个数量级以上。碳纳米管的尖端具有纳米尺度的曲率，是极佳的发射电极。研究表明碳纳米管不仅对多巴胺、NADH以及 抗坏血酸具有良好的电催化活性，而且对蛋白质和各种酶也具有良好的电子传递作用。静电纺纤维膜是一种优良的酶固定化载体，碳纳米管的掺入会进一步提高这种载体的性能，如机械性能、化学稳定性和导电性等。在电化学生物传感器中，碳纳米管被用于修饰电极表面以加快酶活性中心与电极之间的电子传递速率。因此纤维载体中的碳纳米管也有可能会促进固定化氧化还原酶与底物之间的电子转移，从而提高酶的催化活性。
发明内容
本发明提供一种静电纺多壁碳纳米管含糖纳米纤维膜的制备。本发明的Poly(AN-Co-OVAG)/碳纳米管复合纤维膜作为载体将会有利于氧化还原酶的固定化，载酶量及酶活性、热稳定性、储存稳定性均高于不含多壁碳纳米管的固定化酶膜，因为其表面的羟基可为酶的化学固定提供活性位点，碳纳米管会促进催化过程中的电子传递，而聚合物链与碳纳米管强的界面粘合力保证了这种载体的稳定性。本发明的一种静电纺多壁碳纳米管含糖纳米纤维膜的制备方法，包括(I)将己二酸、乙酸汞以及醋酸铜混合，溶于乙酸乙烯酯中，己二酸与乙酸乙烯酯的质量比为1:2-1:5，乙酸汞与乙酸乙烯酯的质量比为1:60-1:70 ;醋酸铜与乙酸乙烯酯的质量比为1:1395-1:2790。在60°C下加热并搅拌5min，加入3-4滴浓硫酸，反应至溶液变得蓝色澄清，层析分离产物己二酸二乙烯酯；(2)将摩尔比为1:1 4:1己二酸二乙烯酯和葡萄糖混合，溶于吡啶中，己二酸二乙烯酯与吡啶的质量比为1:6-1:8 ;葡萄糖与吡啶的质量比为1:18-1:25。以碱性蛋白酶为催化剂，40-60°C下振荡反应4-5天，过滤、旋蒸后层析分离产物6-0-乙烯己二酰-D-葡萄糖OVAG ；以碱性蛋白酶为催化剂，40-60°C下振荡反应4-5天，过滤、旋蒸后层析分离产物
6-0-乙烯己二酰-D-葡萄糖OVAG ；(3)在上述OVAG中加入丙烯腈AN，OVAG = AN摩尔比为1:20，以过硫酸铵作为引发齐U，H2O作溶剂，然后于氮气保护下搅拌反应4-5h，聚合反应结束后得到Poly(AN-Co-OVAG)共聚物；
(4)用强氧化性的摩尔比为1:4的硫酸和硝酸的混合酸在40°C下对多壁碳纳米管进行表面功能化处理，并将其超声分散进DMF溶剂中；(5)将Poly(AN-Co-OVAG)在常温下溶解于多壁碳纳米管的DMF分散液中，通过静电纺丝制备了 Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs复合纳米纤维膜。 所述步骤(I)中的己二酸二乙烯酯，其粗产物用硅胶层析柱分离提纯，洗脱剂与展开剂的化学组成相同，为石油醚 和乙酸乙酯的混合物，石油醚与乙酸乙酯的体积比9:1，用I2显色。所述步骤(2)中的0VAG，其粗产物用硅胶层析柱分离提纯，洗脱剂为乙酸乙酯，展开剂为乙酸乙酯、甲醇和水的混合物，乙酸乙酯、甲醇、水的体积比为17:3:1，用I2显色。所述步骤(2)中的振荡速率为150r/min。所述步骤(3)中的聚合反应结束后，产物反复经丙酮沉淀、DMF溶解，洗除没反应的 OVAG。所述步骤(3)中OVAG的质量分数占Poly(AN-co-OVAG)共聚物质量的
7.17%-29. 78%ο所述步骤(3)中的最佳聚合条件为引发剂浓度为1%，单体OVAG浓度为20g/100mLH2O,聚合温度为60°C。所述步骤(5)中多壁碳纳米管的质量分数为占Poly(AN-co-OVAG)/MWCNTs复合纳米纤维膜的1%_30%。所述步骤(5)中静电纺丝参数为注射器规格为5ml，直径14mm，流速O. 5-1. 5ml/h，静电压12-17Kv，接收器为接地铝箔，接收距离15-20cm。通过本发明的方法制备的一种静电纺多壁碳纳米管含糖纳米纤维膜应用于酶的固定化，包括(I)将空白纤维膜用环氧氯丙烷活化后，浸入新鲜配制的过氧化氢酶溶液中，在4°C水浴中振荡活化3-4h后取出，用PBS反复冲洗，收集洗液和原酶液以测定载酶量；膜保存于4°C的PBS (pH=7. 4)缓冲液中待测活性。(2)将O. lmg/mL的酶溶液置于一定温度的水浴中恒温，每间隔一段时间，用移液枪取出O. 03mL测定其活性。将多份相同质量的固定化酶膜分别储存于PBS中，置于一定温度的水浴中恒温，每间隔一段时间，取出一份固定化酶膜测定其活性。以未经温度处理的酶活性为100%，通过考察酶残留活性随时间的变化，研究酶的热稳定性。(3)选用不同pH值的缓冲溶液配制底物溶液，测定游离酶和固定化酶的活性。以最高活性为100%，得出相应的酶活(enzyme activity) (%)。其中，pH为4. O和5. O的缓冲体系为酯酸/酯酸钠溶液，pH为6. 5,7. 0,7. 5,8. O的缓冲体系为PBS，pH为9. O的缓冲体系为硼砂/磷酸二氢钾溶液。(4)将游离酶溶液(O. lmg/mL)和一批处于湿态的固定化酶膜置于4°C下保存，间隔一段时间取出一份样品测定其活性。以未经保存处理的酶活性为100%，通过考察酶残留活性随时间的变化，研究酶的储存稳定性。步骤(I)中固定化所用的过氧化氢酶的浓度为O. lmg/mL,固定化酶膜保存于4°C、pH为7.4的PBS缓冲液中。步骤(2)中在20-70 °C测定固定化酶与游离酶的热稳定性，分别在O,20，40，60，80，100，120min 测定酶的活性。步骤(3)中pH范围在4-9，其中，pH为4. O和5. O的缓冲体系为醋酸/醋酸钠溶液，pH为6. 5,7. 0,7. 5,8. O的缓冲体系为PBS，pH为9. O的缓冲体系为硼砂/磷酸二氢钾溶液。步骤 (4)中通过测定固定化酶与游离酶在30d中的残留活性来测定酶的储存稳定性。碳纳米管具有良好的导电性和生物相容性，可促进催化过程中的电子传递，有利于过氧化氢酶的固定；Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs复合纳米纤维膜中，Poly (AN-co-OVAG)共聚物表面的羟基可为酶的化学固定提供活性位点，聚合物链与碳纳米管强的界面粘合力保证了这种膜载体的稳定性。有益.效果本发明在固定化氧化还原酶方面具有特殊意义，本发明制备的Po I y (AN-CO-OVAG) /MWCNTs复合纳米纤维固定化酶膜载酶量及酶活性、热稳定性、储存稳定性均高于不含多壁碳纳米管的固定化酶膜，PH耐受性高于游离酶，这主要是由于多碳纳米管良好的导电性能和良好的生物相容性，碳纳米管的加入增加了催化反应中的电子传递率，并且提高了膜生物相容性，使得固定化酶的催化活性大大提高；本发明的Poly (AN-co-OVAG) /MWCNTs复合纳米纤维膜还具有较好的稳定性。
图I为实施例I中时间对Poly (AN-co-OVAG) /MWCNTs复合纳米纤维膜载酶量及酶活性的影响。图2为对比例中时间对Poly (AN-co-OVAG)/OVAG超细纳米纤维膜载酶量及酶活性的影响。图3为对比例、实施例2中，在60°C条件下120min内游离酶和固定化酶的热稳定性。图4为对比例、实施例3中，在pH=4_9条件下对游离酶和固定化酶的影响。图5为对比例、实施例4中，在4°C条件下30day中游离酶与固定化酶的残留活性。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例I载酶量与固定化酶活性的测定，具体步骤如下(I)称取0. 36mol己二酸、2. Ig乙酸汞、0. 07g醋酸铜于250mL圆底烧瓶中，加入150mL乙酸乙烯酯，置于60°C油浴锅中加热并搅拌，约5min后加入3_4滴浓硫酸，反应至溶液变得蓝色澄清，硅胶柱层析分离产物己二酸二乙烯酯，洗脱剂与展开剂的化学组成相同，为石油醚和乙酸乙酯的混合物，石油醚与乙酸乙酯体积比为9:1，用I2显色。
(2)称取12g己二酸二乙烯酯、4g葡萄糖，溶于75-100mL吡啶中，1.5g碱性蛋白酶为催化剂，50°C摇床中反应4-5天，过滤、旋蒸后硅胶柱层析分离产物6-0-乙烯己二酰-D-葡萄糖(OVAG)，洗脱剂为乙酸乙酯，展开剂为乙酸乙酯、甲醇与水的混合物，乙酸乙酯、甲醇与水的体积比为17:3:1，用I2显色。(3)在反应瓶中加入丙烯腈AN和0VAG，以过硫酸铵(占葡萄糖乙烯脂质量分数的1%)作为引发剂，H2O作溶剂(OVAG浓度为20g/mL H2O),然后于60°C氮气保护下搅拌反应4h，聚合反应结束后得到Poly (AN-co-OVAG )共聚物；(4)用强氧化性的混合酸(硫酸/硝酸)在40°C下处理多壁碳纳米管，并将其超声分散进DMF溶剂中；(5)将Poly(AN-Co-OVAG)在常温下溶解于多壁碳纳米管的分散液中，通过静电纺丝制备了 Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs复合纳米纤维膜，其中多壁碳纳米管的质量分数为占Poly (AN-co-OVAG) /MWCNTs 复合纳米纤维膜的 30% ；(6)将5. OOmg的空白纤维膜用环氧氯丙烷活化后，浸入新鲜配制的O. lmg/mL的过氧化氢酶溶液中，在4°C水浴中振荡活化3. 5h后取出，每反应I. 5h取出固定化酶膜，用PBS反复冲洗，收集洗液和原酶液以测定载酶量(Enzyme loading) (mg enzyme/mg mesh);固定化酶膜保存于4°C的PBS (pH=7. 4)缓冲液中以测定其活性，以最高活性为100%，得出相应的酶活(enzyme activity) (%)，如图 I。实施例2固定化酶热稳定性的测定，具体步骤如下(I)将5. OOmg的空白纤维膜用环氧氯丙烷活化后，浸入新鲜配制的O. lmg/mL的过氧化氢酶溶液中，4°C水浴中振荡活化3. 5h后取出，用PBS反复冲洗，最后将膜保存到40C的PBS (pH=7. 4)缓冲液中。(2)将O. I mg/mL的过氧化氢酶溶液置于60°C的水浴中恒温，以未经温度处理酶活性为100%，每间隔20min，用移液枪取出0. 03mL测定其残留活性。残留活性(Residualactivity)的计算公式如下Ra=At/A0X 100% ;其中Ra :残留活性(%)，At t时间后所测的酶的活性(U) ,Atl:酶的初始活性(U)。通过考察酶的残留活性随时间的变化，研究酶的热稳定性。(3)将多份相同质量的固定化酶膜分别储存于PBS中，置于60°C的水浴中恒温，以未处理酶活性为100%，每间隔20min，取出一份固定化酶膜测定其残留活性。残留活性(Residual activity)的计算公式如下Ra=At/A0X 100% ;其中 Ra :残留活性(%), At :t 时间后所测的酶的活性(U) ,Atl:酶的初始活性(U)。通过考察酶的残留活性随时间的变化，研究酶的热稳定性。如图3。实施例3固定化酶pH耐受性的测定，具体步骤如下(I)将5. OOmg的空白纤维膜用环氧氯丙烷活化后，浸入新鲜配制的0. lmg/mL的过氧化氢酶溶液中，在4°C水浴中振荡活化3. 5h后取出，用PBS反复冲洗，最后将膜保存至IJ 40C的PBS (pH=7. 4)缓冲液中。(2)选用pH=4_9的缓冲溶液配制底物溶液，测定游离酶和固定化酶的活性，以最高活性为100%,得出相应的酶活(enzyme activity) (%),如图4。从图4中可以看出，经Poly (AN-co-OVAG)和Poly (AN-co-OVAG) /MWCNTs复合纳米纤维膜膜固定的过氧化氢酶对pH的耐受性相差不大,但经固定化后pH稳定范围变宽(pH6. 0-8. O)，而游离酶只在PH6. 5-7. 5之间具有较高的稳定性。实施例4固定化酶储存稳定性的测定，具体步骤如下(I)将5. OOmg的空白纤维膜用环氧氯丙烷活化后，浸入新鲜配制的0. lmg/mL的过氧化氢酶溶液中，4°C水浴中振荡活化3. 5h后取出，用PBS反复冲洗，最后将固定化酶膜保存到40C的PBS (pH=7. 4)缓冲液中。(2)将游离酶溶液(0. lmg/mL)和一批处于湿态的固定化酶膜置于4°C下保存，以 未经保存处理酶活性为100%，每隔2. 5天取出一份样品测定其活性。残留活性(Residualactivity)的计算公式如下Ra=At/A0X 100% ;其中Ra :残留活性(%)，At t时间后所测的酶的活性(U) ,Atl:酶的初始活性(U)。通过考察酶的残留活性随时间的变化，研究酶的储存稳定性，如图5。对比例(I)将5. OOmg Poly (AN-CO-0VAG)/OVAG超细纳米纤维膜用环氧氯丙烷活化后，浸入新鲜配制的0. lmg/mL的过氧化氢酶溶液中，在4°C水浴中振荡活化3. 5h后取出，用PBS反复冲洗，最后将膜保存到4°C的PBS (pH=7. 4)缓冲液中。(2)方法同测定固定于Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs复合纳米纤维膜上的酶，测定固定到对比例(I)中提到的膜上的酶的载酶量与酶活力、热稳定性、PH耐受性、储存稳定性，如图2，3,4,50
权利要求
1.一种静电纺多壁碳纳米管含糖纳米纤维膜的制备方法，包括下列步骤 (1)将己二酸、乙酸汞以及醋酸铜混合，溶于乙酸乙烯酯中，己二酸与乙酸乙烯酯的质量比为1:2-1:5，乙酸汞与乙酸乙烯酯的质量比为1:60-1:70 ;醋酸铜与乙酸乙烯酯的质量比为1:1395-1:2790。在60°C下加热并搅拌5min，加入3_4滴浓硫酸，反应至溶液变得蓝色澄清，层析分离产物己二酸二乙烯酯； (2)将摩尔比为1:1 4:1己二酸二乙烯酯和葡萄糖混合，溶于吡啶中，己二酸二乙烯酯与吡啶的质量比为1:6-1:8 ;葡萄糖与吡啶的质量比为1:18-1:25。以碱性蛋白酶为催化剂，40-60°C下振荡反应4-5天，过滤、旋蒸后层析分离产物6-0-乙烯己二酰-D-葡萄糖OVAG ； (3)在上述OVAG中加入丙烯腈AN，OVAG= AN摩尔比为1:20，以过硫酸铵作为引发剂，H2O作溶剂，然后于氮气保护下搅拌反应4-5h，聚合反应结束后得到Poly(AN-Co-OVAG)共 聚物； (4)用强氧化性的摩尔比为1:4的硫酸和硝酸的混合酸在40°C下对多壁碳纳米管进行表面功能化处理，并将其超声分散进DMF溶剂中； (5)将Poly(AN-Co-OVAG)在常温下溶解于多壁碳纳米管的DMF分散液中，通过静电纺丝制备了 Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs复合纳米纤维膜。
2.根据权利要求I所述的一种静电纺多壁碳纳米管含糖纳米纤维膜的制备方法，其特征在于所述步骤(I)中的己二酸二乙烯酯，其粗产物用硅胶层析柱分离提纯，洗脱剂与展开剂的化学组成相同，为石油醚和乙酸乙酯的混合物，石油醚与乙酸乙酯的体积比9:1，用I2显色。
3.根据权利要求I所述的一种静电纺多壁碳纳米管含糖纳米纤维膜的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中的0VAG，其粗产物用硅胶层析柱分离提纯，洗脱剂为乙酸乙酯，展开剂为乙酸乙酯、甲醇和水的混合物，乙酸乙酯、甲醇、水的体积比为17:3:1，用I2显色。
4.根据权利要求I所述的一种静电纺多壁碳纳米管含糖纳米纤维膜的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中的振荡速率为150r/min。
5.根据权利要求I所述的一种静电纺多壁碳纳米管含糖纳米纤维膜的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中的聚合反应结束后，产物反复经丙酮沉淀、DMF溶解，洗除没反应的OVAG0
6.根据权利要求I所述的一种静电纺多壁碳纳米管含糖纳米纤维膜的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中OVAG的质量分数占Poly(AN-co-OVAG)共聚物质量的7. 17%-29. 78%ο
7.根据权利要求I所述的一种静电纺多壁碳纳米管含糖纳米纤维膜的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中的最佳聚合条件为引发剂浓度为1%，单体OVAG浓度为20g/IOOmLH2O,聚合温度为60°C。
8.根据权利要求I所述的一种静电纺多壁碳纳米管含糖纳米纤维膜的制备方法，其特征在于所述步骤(5)中多壁碳纳米管的质量分数为占Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs复合纳米纤维膜的1%_30%。
9.根据权利要求I所述的一种静电纺多壁碳纳米管含糖纳米纤维膜的制备方法，其特征在于所述步骤(5)中静电纺丝参数为注射器规格为5ml，直径14mm，流速O. 5-1. 5ml/h，静电压12-17Kv，接收器为接地铝箔，接收距离15-20cm。
全文摘要
本发明涉及一种静电纺多壁碳纳米管含糖纳米纤维膜的制备方法，包括(1)制备Poly(AN-co-OVAG)含糖高聚物；(2)共价法对多壁碳纳米管MWCNT进行表面功能化处理，并将其超声分散进DMF溶剂中；(3)将Poly(AN-co-OVAG)含糖高聚物在常温下溶解于多壁碳纳米管的分散液中，通过静电纺丝制备得到Poly(AN-co-OVAG)/MWCNTs复合纳米纤维膜。本发明的Poly(AN-co-OVAG)/MWCNTs复合纳米纤维膜载酶量、酶活性、热稳定性、储存稳定性均高于不含多壁碳纳米管的固定化酶膜；pH耐受性高于游离酶。
文档编号D01F1/10GK102776599SQ20121023806
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月10日 优先权日2012年7月10日
发明者刘中青, 朱利民, 权静, 李艳, 王蕾 申请人:东华大学