混合中性纤维素酶及其制备方法和在造纸打浆中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于造纸打浆的混合中性纤维素酶，属于酶制剂领域。所述混合中性纤维素酶，重量份数组成如下：纤维素酶10-40份、酸性木聚糖酶20-30份、果胶酶5-10份、甘露聚糖酶3-8份，中草药粉剂2-8份。本发明制备的混合中性纤维素酶，有效的利用了中草药粉剂的有效成分，并利用特殊方法克服了传统的酸性木聚糖酶采用单一菌种发酵的缺陷；经过混合中性纤维素酶处理的磨浆，叩解度相对于未处理浆增加了11.76%，短纤耐破指数提高了11.98%，环压指数提高了13.99%；长纤拉力指数提高了40.17%,，撕裂指数提高了58.91%，纤维表面变得光滑，酶纤维更为柔软；成纸的撕裂指数、抗张指数、耐破指数分别提高了8.3%，10.6%，16.5%，纸浆白度提高2%-5%，污水质量大大改善，降低了对环境的污染程度。
【专利说明】混合中性纤维素酶及其制备方法和在造纸打浆中的应用
【技术领域】:
[0001] 本发明属于酶制剂领域，特别涉及纸浆造纸领域用酶。
【背景技术】:
[0002]制浆造纸工业是国民经济的重要支柱产业之一，但也是森林、能源、化学品等资源消耗和环境污染的大户。全球的造纸工业每年要砍伐数亿立方米的林木，而其中约半数变为废弃物又被排回至周围的大气和水流中，给人类生存的生态环境造成了巨大威胁和危害。减少能源和化学品消耗、提高纸浆得率、污水生物处理等都是克服上述困难的根本途径。而生物技术恰恰在这些方面是可以大有作为的。
[0003]纤维素酶是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，自然界中很多真菌都能分泌纤维素酶。习惯上，将纤维素酶分成三类:Cl酶、Cx酶和β葡糖苷酶。Cl酶是对纤维素最初起作用的酶，破坏纤维素链的结晶结构。Cx酶是作用于经Cl酶活化的纤维素、分解β-1，
4-糖苷键的纤维素酶。β葡糖苷酶可以将纤维二糖、纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖。
[0004]纤维素酶反应和一般酶反应不一样，其最主要的区别在于纤维素酶是多组分酶系，且底物结构极其复杂。由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用代替了酶与底物形成的ES复合物过程。纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素上，然后在几种组分的协同作用下将纤维素分解成葡萄糖。
[0005]1950年，Reese等提出了 Cl-Cx假说，该假说认为必须以不同的酶协同作用，才能将纤维素彻底的水解为葡萄糖。协同作用一般认为是内切葡聚糖酶(Cl酶)首先进攻纤维素的非结晶区，形成Cx所需的新的游离末端，然后由CX酶从多糖链的还原端或非还原端切下纤维二糖单位，最后由β_葡聚糖苷酶将纤维二糖水解成二个葡萄糖。不过，纤维素酶的协同作用顺序不是绝对的，随后的研究中发现，Cl-Cx和β -葡聚糖苷酶必须同时存在才能水解天然纤维素。若先用Cl酶作用结晶纤维素，然后除掉Cl酶，再加入Cx酶，如此顺序作用却不能将结晶纤维素水解。
[0006]影响纤维素酶产量和活力的因素很多，除菌种外，还有培养温度、pH、水分、基质、培养时间等。这些因素不是孤立的，而是相互联系的。张中良等(1997)采用均匀设计C112 (1210),以绿色木霉(T.ViriclePers.expr)为菌种,研究了影响产纤维素酶的五大因素对产酶量和活力的作用，认为基质粗纤维含量为40%、初始pH7.5、加水4倍、在26-31°C条件下培养45h可获得最大产酶量26mg/g和CMC酶活力20mg/g.h。王成华等(1997)也研究了其诱变筛选的里氏木霉91-3的产酶条件，结果表明该菌种以7:3的秸杆粉和麦麸，另添加4%硫酸铵、0.4%磷酸二氢钾、0.1%硫酸镁为最佳培养基，28-32°C为适宜培养温度，30°C为最佳温度，4%为最佳接种量，96h到达发酵高峰。张苓花等(1998)研究了以康氏木霉W-925为出发菌，经诱变后得到的Wu-932纤维素酶高产菌的最佳发酵条件。结果表明，以1:2的麦麸和稻草粉为培养基，5%的接种量，稻草粉碎平均长度3-5mm，初始pH4-5，温度在28-35°C，发酵时间72h为最佳发酵条件。[0007] 申请人:广东溢多利生物科技股份有限公司提交的一种优化改良的中性纤维素酶MEGl及其基因和应用专利，其申请号:201110362928.0。该发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种优化改良的中性纤维素酶MEGl及其基因和应用。本发明提供了一种优化改良的中性纤维素酶MEGl，发明还提供了编码上述优化改良的中性纤维素酶MEGl的基因，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明的优化改良的中性纤维素酶MEGl在中性条件下酶活有很大的提高，并且，通过高拷贝外源基因菌株的筛选，得到能够在反应器中高效表达的生产菌株，进一步满足工业化生产的要求，因此，本发明的优化改良的MEGl可在纺织、洗涤、造纸、饲料中显示出巨大的应用潜力。
[0008]混合中性纤维素酶是由许多具有高协同作用的水解酶组成的，含有纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等生物活性成分。纤维素酶又含有:(I)外切型葡聚糖酶(Cl酶)；(2)内切型葡聚糖酶(Cx酶)；(3) β -葡萄糖苷酶(也称纤维二糖酶，CBH酶)三种组分。
[0009]混合中性纤维素酶主要是通过对纤维素内部进行分解，促进(打)磨浆过程中纤维的分丝和帚化，使打浆变得更容易，节省打浆能耗。通过对纤维表面进行改性，对纤维末端进行分化，促进纤维的润胀，同时使纤维表面和末端的羟基和羧基增多，从而增强纤维之间的结合力，达到增强成纸性能、提高成纸品质的效果。
[0010]通过生物酶对纤维素的改性，纤维形态起明显有益变化，无论是磨前或者磨后，其纤维表面均有更为明显的分丝帚化，因此浆料的叩解度更易提高，同时表面细纤化有助于提高成纸物理性能和改善留着率，纸张成形时纤维间结合力更强。
[0011]由于纤维得到充分的吸水润涨，使纤维变得柔软增粗。从而使成纸的松厚度有所增加，柔软性提高。同时具有使细小纤维重新组合的作用，有利于湿纸页的滤水，减少白水中细小纤维的含量，使白水循环率有所提高，从而降低吨纸原浆消耗及清水用量。
【发明内容】
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[0012]本发明所解决的技术问题是克服现有制浆造纸技术中废弃物排放量大的缺陷，利用一种混合中性纤维素酶过对纤维素内部进行分解，促进磨浆过程中纤维的分丝和帚化，使打浆变得更容易，从而节省打浆能耗，，使白水循环率有所提高，从而降低吨纸原浆消耗及清水用量，改善了污水的质量。
[0013]为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0014]一种混合中性纤维素酶，用于造纸打浆酶；
[0015]所述混合中性纤维素酶，重量份数组成如下:
[0016]纤维素酶10-40份、酸性木聚糖酶20-30份、果胶酶5_10份、甘露聚糖酶3_8份，中草药粉剂2-8份。 [0017]所述中草药粉剂的制备方法如下:称取当归20-30份；党参10-18份；柴胡10_15份；黄芩10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度80°C—95°C保持2—4h，添加混合物料2_3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至55°C—65°C保持3 — 4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
[0018]所述混合混合中性纤维素酶的制备方法如下:将纤维素酶、酸性木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶和中草药粉剂按照重量份数混合而成；[0019]所述酸性木聚糖酶采用以下技术方案制备:
[0020]一种酸性木聚糖酶制备方法包括如下步骤:
[0021](I)黑曲霉、枯草芽孢杆菌菌种活化
[0022]将保存完好的黑曲霉的斜面菌种接种于斜面培养基，28_35°C培养36_48h进行菌种活化，如此活化2-4次；
[0023]将保存完好的枯草芽孢杆菌的斜面菌种接种于斜面培养基，34_35°C培养24_36h进行菌种活化，如此活化2-3次；
[0024]所述黑曲霉斜面培养基组成为:马铃薯煮汁200g，葡萄糖20g，琼脂20g，中草药剂粉 5-20g,蒸馏水 1000mL, pH 值 5.8，121°C 灭菌 20min ；
[0025]所述枯草芽孢杆菌斜面培养基组成为:牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨10g，琼脂15g，蒸馏水 1000mL，pH 值 6.8，121°C 灭菌 20min ；
[0026](2)黑曲霉液体种子扩大培养
`[0027]所述黑曲霉一级种子罐发酵液菌体浓度为7.0x108-8.0xlO8个/ml ；
[0028]枯草芽孢杆菌液体种子扩大培养
[0029]一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度32-36°C，搅拌速度200-400rpm，通风量(V/V) 1:1-2,罐压0.05Mpa,培养时间 10-20h ；
[0030](3)黑曲霉、枯草芽孢杆菌一级种子罐液体种子混合
[0031]将步骤(2)得到的黑曲霉种子罐液体种子与步骤(2)得到的枯草芽孢杆菌种子罐液体种子按体积比均匀混合；所述黑曲霉种子液与枯草芽孢杆菌种子液体积比为1:0.5-1 ；
[0032]所述混合液体种子菌体浓度为:7.0x108-8.0xlO8个/ml ；
[0033](4) 二级种子罐互生
[0034]将步骤(3)中均匀混合的一级种子罐液体种子以10%接种量接入总容积为300L的二级种子罐，互生培养基装量240L，二级种子罐发酵罐，培养温度28-35 °C，搅拌速度200-700r/m，通风量(V/V) 1:1-3，培养时间 15_24h ；
[0035]所述互生培养基组成为:麦芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麸皮10-15g，海藻糖10-30g，酵母粉4-8g，玉米浆l_5g，硫酸铵l_3g，磷酸氢二钾l_2g，磷酸二氢钾 l_2g，纯净水 1000mL, pH 值 5-7，121°C 灭菌 20min ；
[0036](5)菌种混合发酵
[0037]将步骤(4)中二级种子罐互生液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度28-30°C，搅拌速度 200-700r/m，通风量(V/V) 1:1-3，培养时间 10_15h;然后以 1-2 °C /h降温速率缓慢降温至10-15°C，恒温培养15-20h ;继续以1_2°C /h降温速率缓慢降温至2-5 °C，此时，将步骤(4)中二级种子罐互生液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h ;最后以1_2°C /h升温速率缓慢升温至10-15°C，恒温培养15_20h ;继续以
1-20C /h升温速率缓慢升温至30-35°C，恒温培养15-20h ；
[0038]溶解氧控制:通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30% ；
[0039]PH控制:通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5-7 ；
[0040]补料控制:当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时,开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml ；
[0041 ] 放罐标准:60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
[0042]所述发酵培养基组成为:麦芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麸皮10-15g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆l_5g，硫酸铵l_3g，磷酸氢二钾l_2g，磷酸二氢钾 l_2g，纯净水 1000mL, pH 值 5-7，121°C 灭菌 20min ；
[0043]所述补料培养基重量组成为:麦芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15_25%，不足部分纯净水补足，pH值5-7，121-123°C灭菌30_40min。
[0044](6)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体酸性木聚糖酶。
[0045]有益效果:
[0046]本发明制备的混合中性纤维素酶，有效的利用了中草药粉剂的有效成分，并利用特殊方法克服了传统的酸性木聚糖酶采用单一菌种发酵的缺陷，将产高活力酸性木聚糖酶的菌种黑曲霉与产强热稳定性酸性木聚糖酶的菌种枯草芽孢杆菌科学结合、互生稳定，致使混合菌种的产酶能力最大限度地显现，也使本发明所产酸性木聚糖酶类型全、活力高、作用条件宽泛、稳定性强、适于工业化生产。本发明发酵液酸性木聚糖酶比活力为5300-6800U/mg,比单一菌种黑曲霉发酵液酸性木聚糖酶酶活力平均提高了 2_3倍，热稳定性强，适用反应温度范围为30-78°C ;并且经过混合中性纤维素酶处理的磨浆，叩解度相对于未处理浆增加了 11.76%，短纤耐破指数提高了 11.98%，环压指数提高了 13.99% ;长纤拉力指数提高了 40.17%，，撕裂指数提高了 58.91%，纤维表面变得光滑，酶纤维更为柔软；成纸的撕裂指数、抗张指数、耐破指数分别提高了 8.3%，10.6%，16.5%，减少了盘末磨浆时间，降低电耗10 — 20%，纸浆白度提高2%-5%，白水循环系统变得干净，污水质量大大改善，降低了对环境的污染程度。
【具体实施方式】
`[0047]下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0048]实施例1
[0049]本发明提供的黑曲霉菌株保藏号为CICC2475，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。所述黑曲霉斜面培养基组成为:马铃薯煮汁200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL, pH 值 5.8，121°C 灭菌 20min ；
[0050]枯草芽孢杆菌CICC10158购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。所述枯草芽孢杆菌斜面培养基组成为:牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨10g，琼脂15g，蒸馏水lOOOmL，pH值
6.8，121°C 灭菌 20min ；
[0051]所述黑曲霉一级、二级、三级种子培养基组成为:马铃薯煮汁200g，葡萄糖20g，海藻糖 10-30g,蒸馏水 lOOOmL, pH 值 5.5，121°C 灭菌 20min ；
[0052]所述黑曲霉一级种子罐培养基组成为:玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麸皮10_15g，海藻糖10-30g，硫酸铵l_3g，磷酸氢二钾l_2g，磷酸二氢钾l_2g，纯净水lOOOmL，pH值5-7，121°C 灭菌 20min ；
[0053]所述枯草芽孢杆菌一级、二级、三级种子培养基重量组成为:
[0054]酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氢二钾
0.8-1.5%，海藻糖1_3%，不足部分纯净水补足，pH值6.8，121_123°C灭菌30_40min。
[0055]所述枯草芽孢杆菌种子罐培养基重量组成为:
[0056]麦芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，海藻糖1_3%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米浆
0.1-0.5%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，硫酸镁0.05-0.1%，不足部分纯净水补足，pH值6.8，121-123? 灭菌 30-40min。
[0057]所述互生培养基组成为:麦芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麸皮10-15g，海藻糖10-30g，酵母粉4-8g，玉米浆l_5g，硫酸铵l_3g，磷酸氢二钾l_2g，磷酸二氢钾 l_2g，纯净水 1000mL, pH 值 5-7，121°C 灭菌 20min ；
[0058]所述发酵培养基组成为:麦芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麸皮10-15g，海藻糖30-40g， 酵母粉4-8g，玉米浆l_5g，硫酸铵l_3g，磷酸氢二钾l_2g，磷酸二氢钾 l_2g，纯净水 1000mL, pH 值 5-7，121°C 灭菌 20min ；
[0059]所述补料培养基重量组成为:麦芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15_25%，不足部分纯净水补足，pH值5-7，121-123°C灭菌30_40min。
[0060]实施例2
[0061]混合中性纤维素酶的重量份数组成如下:纤维素酶30份、木聚糖酶酶25份、果胶酶8份、甘露聚糖酶5份，中草药粉剂5份。
[0062]中草药粉剂的制备方法如下:称取当归24份；党参14份；柴胡13份；黄芩14份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加4倍重量的水，控制温度90°C保持4h，添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60°C保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
[0063]所述酸性木聚糖酶采用以下技术方案制备:
[0064](I)黑曲霉、枯草芽孢杆菌菌种活化
[0065]将保存完好的黑曲霉的斜面菌种接种于斜面培养基，30°C培养40h进行菌种活化,如此活化3次；
[0066]将保存完好的枯草芽孢杆菌的斜面菌种接种于斜面培养基，35°C培养30h进行菌种活化，如此活化2次；
[0067]所述黑曲霉斜面培养基组成为:马铃薯煮汁200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL, pH 值 5.8，121°C灭菌 20min ；
[0068]所述枯草芽孢杆菌斜面培养基组成为:牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨10g，琼脂15g，蒸馏水 1000mL，pH 值 6.8，121°C 灭菌 20min ；
[0069](2)黑曲霉液体种子扩大培养
[0070]①一级种子培养:将步骤(1)活化后的黑曲霉斜面菌种以无菌水洗下孢子，接入500毫升摇瓶中，液体种子培养基装量100毫升，30°C、80rpm摇床培养40h ；
[0071]②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
[0072]③三级种子培养:将二级种子以8%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，液体培养基装量1000毫升，30°C、80rpm摇床培养40h ；
[0073]④一级种子罐培养:将三级种子以8%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，控制pH值为5，培养温度28°C，搅拌速度200rpm，通风量(V/V) 1: 0.8，培养时间36h，溶解氧10%;
[0074]所述黑曲霉一级、二级、三级种子培养基组成为:马铃薯(煮汁)200g，葡萄糖20g，海藻糖 IOg,蒸懼水 lOOOmL, pH 值 5.5,121°C灭菌 20min ；
[0075]所述黑曲霉一级种子罐培养基组成为:玉米粉50g，豆粉15g，麸皮10g，海藻糖10g，硫酸铵lg，磷酸氢二钾lg，磷酸二氢钾lg，纯净水10001^，？!1值5，1211:灭菌20min ；
[0076]所述黑曲霉一级种子罐发酵液菌体浓度为7.0xlO8个/ml ；
[0077](3)枯草芽孢杆菌液体种子扩大培养
[0078]①一级种子培养:将步骤(1)活化后的枯草芽孢杆菌斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度35°C，培养时间IOh ；
[0079]②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
[0080]③三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度35°C，培养时间IOh ；
[0081]④一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度32°C，搅拌速度200rpm，通风量(V/V) 1:1,罐压0.05Mpa,培养时间IOh ；
[0082]所述枯草芽孢杆菌一级、二级、三级种子培养基重量组成为:
[0083]酵母粉0.3%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氢二钾0.8%，海藻糖1%，不足部分纯净水补足，pH值6.8，121°C灭菌30min。
[0084]所述枯草芽孢杆菌种子罐培养基重量组成为:
[0085]麦芽糊精5%，酵母粉0.4%，海藻糖1%，蛋白胨0.1%，玉米浆0.1%，磷酸氢二钾
0.8%，硫酸镁0.05%,不足部分纯净水补足，pH值6.8，121°C灭菌30min。
[0086]所述枯草芽孢杆菌种子罐发酵液菌体浓度为7.0xlO8个/ml ；
[0087](4)黑曲霉、枯草芽孢杆菌一级种子罐液体种子混合
[0088]将步骤(2)得到的黑曲霉种子罐液体种子与步骤(3)得到的枯草芽孢杆菌种子罐液体种子按体积比均匀混合；
[0089]所述黑曲霉种子液与枯草芽孢杆菌种子液体积比为1:0.5 ;
[0090]所述混合液体种子菌体浓度为:7.0xlO8个/ml ；
[0091](5) 二级种子罐互生
[0092]将步骤(4)中均匀混合的一级种子罐液体种子以10%接种量接入总容积为300L的二级种子罐，互生培养基装量240L，二级种子罐发酵罐，培养温度28-35 °C，搅拌速度200-700r/m，通风量(V/V) 1:1，培养时间 15h ；
[0093]所述互生培养基组成为:麦芽糊精50g，玉米粉50g，豆粉15g，麸皮10g，海藻糖10g，酵母粉4g，玉米浆lg，硫酸铵lg，磷酸氢二钾lg，磷酸二氢钾lg，纯净水lOOOmL，pH值5，121°C 灭菌 20min ；
[0094](6)菌种混合发酵[0095]将步骤(5)中二级种子罐互生液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度28°C，搅拌速度200r/m，通风量(V/V) 1:1，培养时间IOh ;然后以TC /h降温速率缓慢降温至10°C，恒温培养15h ;继续以1°C /h降温速率缓慢降温至2°C，此时，将步骤(5)中二级种子罐互生液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20h ;最后以1°C /h升温速率缓慢升温至10°C，恒温培养15h ;继续以1°C /h升温速率缓慢升温至30°C，恒温培养15h ；
[0096]溶解氧控制:通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15% ；
[0097]PH控制:通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5 ；
[0098]补料控制:当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时,开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml ；
[0099]放罐标准:60%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
[0100]所述发酵培养基组成为:麦芽糊精50g，玉米粉50g，豆粉15g，麸皮10g，海藻糖30g，酵母粉4g，玉米浆lg，硫酸铵lg，磷酸氢二钾lg，磷酸二氢钾lg，纯净水1000mL，pH值5，121°C 灭菌 20min ；
[0101]所述补料培养基重量组成为:麦芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，中草药剂粉5%，不足部分纯净水补足，pH值5，121°C灭菌30min。[0102](7)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体酸性木聚糖酶。
[0103]所述调配过程不添加任何防腐剂。
[0104]经上述制备方法得到的发酵液酸性木聚糖酶酶活力为5300U/mg。
[0105]实施例3
[0106]所述混合中性纤维素酶的用法及用量:
[0107]根据纸浆原料和工艺、设备的不同选用合适产品，生物酶的添加方法也有所差异，可主要分为以下两类:
[0108](I)纸厂自己制浆、直接供浆的生产线添加地点:最后一道洗浆机出浆口和叩前池进浆口之间可能的位置；洗浆后浆料获得适宜的温度和PH值，叩前池可使生物酶获得足够的停留时间。
[0109]添加方法:根据送浆方式和流量，把生物酶配制成易于准确操作的溶液，然后用计量泵同步加入浆料中。
[0110](2)采用废纸和外来浆板的生产线添加地点:一般情况下碎浆机温度和pH值均可适合生物酶使用，利于生物酶得到充分的搅拌和反应时间。
[0111]添加方法:根据碎浆方式的不同分两种情况:一种为连续碎浆:根据碎浆产量，把生物酶配制成易于准确操作的溶液，然后用计量泵同步加入碎浆机中；第二种为间歇碎浆:根据每次碎浆量称取足量的生物酶，直接投入碎浆机中。
[0112]添加量:50-200g(ml) /t 绝干浆；
[0113]所述混合中性纤维素酶原封装在阴凉、干燥环境下，保质期为12个月，在5°C -15°C低温、干燥环境下，保质期为24个月。
【权利要求】
1.一种混合中性纤维素酶,重量份数组成如下: 纤维素酶10-40份、酸性木聚糖酶20-30份、果胶酶5-10份、甘露聚糖酶3_8份，中草药粉剂2-8份。
2.根据权利要求1所述的混合中性纤维素酶，其特征在于，所述酸性木聚糖酶采用以下技术方案制备: (1)黑曲霉、枯草芽孢杆菌菌种活化 将保存完好的黑曲霉的斜面菌种接种于斜面培养基，28-35°C培养36-48h进行菌种活化,如此活化2-4次； 将保存完好的枯草芽孢杆菌的斜面菌种接种于斜面培养基，34-35°C培养24-36h进行菌种活化，如此活化2-3次； (2)黑曲霉液体种子扩大培养 所述黑曲霉一级种子罐发酵液菌体浓度为7.0x108-8.0xlO8个/ml ； 枯草芽孢杆菌液体种子扩大培养 一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度32-36 °C，搅拌速度200-400rpm，通风量(V/V) 1:1-2，罐压0.05Mpa,培养时间 10-20h ； (3)黑曲霉、枯草芽孢杆菌一级种子罐液体种子混合 将步骤(2)得到的黑曲霉种 子罐液体种子与步骤(2)得到的枯草芽孢杆菌种子罐液体种子按体积比均匀混合；所述黑曲霉种子液与枯草芽孢杆菌种子液体积比为1:0.5-1 ； 所述混合液体种子菌体浓度为:7.0x108-8.0xlO8个/ml ； (4)二级种子罐互生 将步骤(3)中均匀混合的一级种子罐液体种子以10%接种量接入总容积为300L的二级种子罐，互生培养基装量240L，二级种子罐发酵罐，培养温度28-35°C，搅拌速度200_700r/m，通风量(V/V) 1:1-3,培养时间15-24h ； (5)菌种混合发酵 将步骤(4)中二级种子罐互生液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度28-30°C，搅拌速度200-700r/m，通风量(V/V)l:l-3，培养时间10_15h ;然后以1_2°C /h降温速率缓慢降温至10-15°C，恒温培养15-20h ;继续以1_2°C /h降温速率缓慢降温至2_5°C，此时，将步骤(4)中二级种子罐互生液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h ;最后以1-20C /h升温速率缓慢升温至10_15°C，恒温培养15-20h ;继续以1_2°C /h升温速率缓慢升温至30-35°C，恒温培养15-20h ； (6)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体酸性木聚糖酶。
3.根据权利要求1所述的一种混合中性纤维素酶，其特征在于，所述中草药粉剂的制备方法如下:称取当归20-30份；党参10-18份；柴胡10-15份；黄芩10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度80°C—95°C保持2—4h，添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至55°C—65°C保持3 — 4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
4.根据权利要求2所述的一种混合中性纤维素酶，其特征在于，所述黑曲霉一级、二级、三级种子培养基组成为:马铃薯煮汁200g，葡萄糖20g，海藻糖10-30g，蒸馏水1000mL,pH 值 5.5，121°C 灭菌 20min ； 所述黑曲霉一级种子罐培养基组成为:玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麸皮10-15g，海藻糖10_30g，硫酸铵l_3g，磷酸氢二钾l_2g，磷酸二氢钾l_2g，纯净水lOOOmL，pH值5-7，.121°C 灭菌 20min ； 所述枯草芽孢杆菌一级、二级、三级种子培养基重量组成为: 酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氢二钾.0.8-1.5%，海藻糖1_3%，不足部分纯净水补足，pH值6.8，121_123°C灭菌30_40min ； 所述枯草芽孢杆菌种子罐培养基重量组成为: 麦芽糊精5-15%,酵母粉0.4-0.8%，海藻糖1-3%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米浆0.1-0.5%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，硫酸镁0.05-0.1%，不足部分纯净水补足，pH值6.8，121_123°C灭菌.30-40min ； 所述互生培养基组成为:麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麸皮10_15g，海藻糖10_30g，酵母粉4-8g，玉米浆l-5g，硫酸铵l-3g，磷酸氢二钾l_2g，磷酸二氢钾.l_2g，纯净水 1000mL, pH 值 5-7，121°C 灭菌 20min ； 所述发酵培 养基组成为:麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麸皮10_15g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆l-5g，硫酸铵l-3g，磷酸氢二钾l_2g，磷酸二氢钾.l_2g，纯净水 1000mL, pH 值 5-7，121°C 灭菌 20min ； 所述补料培养基重量组成为:麦芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15-25%，不足部分纯净水补足，pH 值 5-7，121-123°C灭菌 30_40min。
5.根据权利要求1所述的一种混合中性纤维素酶，其特征在于，所述混合中性纤维素酶的重量份数组成如下:纤维素酶30份、木聚糖酶酶25份、果胶酶8份、甘露聚糖酶5份，中草药粉剂5份； 中草药粉剂的制备方法如下:称取当归24份；党参14份；柴胡13份；黄芩14份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加4倍重量的水，控制温度90°C保持4h，添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60°C保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂； 所述酸性木聚糖酶采用以下技术方案制备: (O黑曲霉、枯草芽孢杆菌菌种活化 将保存完好的黑曲霉的斜面菌种接种于斜面培养基，30°C培养40h进行菌种活化，如此活化3次； 将保存完好的枯草芽孢杆菌的斜面菌种接种于斜面培养基，35°C培养30h进行菌种活化,如此活化2次； 所述黑曲霉斜面培养基组成为:马铃薯煮汁200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水.1000mL, pH 值 5.8，121°C 灭菌 20min ； 所述枯草芽孢杆菌斜面培养基组成为:牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨10g，琼脂15g，蒸馏水 1000mL, pH 值 6.8，121°C 灭菌 20min ； (2)黑曲霉液体种子扩大培养 ①一级种子培养:将步骤(1)活化后的黑曲霉斜面菌种以无菌水洗下孢子，接入500毫升摇瓶中，液体种子培养基装量100毫升，30°C、80rpm摇床培养40h ；②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同； ③三级种子培养:将二级种子以8%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，液体培养基装量1000毫升，30°C、80rpm摇床培养40h ； ④一级种子罐培养:将三级种子以8%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，控制pH值为5，培养温度28°C，搅拌速度200rpm，通风量(V/V)l: 0.8，培养时间36h，溶解氧10% ； 所述黑曲霉一级、二级、三级种子培养基组成为:马铃薯(煮汁)200g，葡萄糖20g，海藻糖 IOg,蒸馏水 1000mL, pH 值 5.5，121°C 灭菌 20min ； 所述黑曲霉一级种子罐培养基组成为:玉米粉50g，豆粉15g，麸皮10g，海藻糖IOgjt酸铵lg，磷酸氢二钾lg，磷酸二氢钾lg，纯净水10001^，？!1值5，1211:灭菌20min ； 所述黑曲霉一级种子罐发酵液菌体浓度为7.0xlO8个/ml ； (3)枯草芽孢杆菌液体种子扩大培养 ①一级种子培养:将步骤(1)活化后的枯草芽孢杆菌斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度35°C，培养时间IOh ； ②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同； ③三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度35°C，培养时间IOh ； ④一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度32°C，搅拌速度200rpm，通风量(V/V)l:l，罐压0.05Mpa，培养时间IOh ； 所述枯草芽孢杆菌一级、二级、三级种子培养基重量组成为: 酵母粉0.3%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氢二钾0.8%，海藻糖1%，不足部分纯净水补足，pH值6.8，121。。灭菌30min ； 所述枯草芽孢杆菌种子罐培养基重量组成为: 麦芽糊精5%，酵母粉0.4%，海藻糖1%，蛋白胨0.1%，玉米浆0.1%，磷酸氢二钾0.8%，硫酸镁0.05%,不足部分纯净水补足，pH值6.8，121°C灭菌30min ； 所述枯草芽孢杆菌种子罐发酵液菌体浓度为7.0xlO8个/ml ； (4)黑曲霉、枯草芽孢杆菌一级种子罐液体种子混合 将步骤(2)得到的黑曲霉种子罐液体种子与步骤(3)得到的枯草芽孢杆菌种子罐液体种子按体积比均匀混合； 所述黑曲霉种子液与枯草芽孢杆菌种子液体积比为1:0.5 ; 所述混合液体种子菌体浓度为:7.0xlO8个/ml ； (5)二级种子罐互生 将步骤(4)中均匀混合的一级种子罐液体种子以10%接种量接入总容积为300L的二级种子罐，互生培养基装量240L，二级种子罐发酵罐，培养温度28-35°C，搅拌速度200_700r/m，通风量(V/V) 1:1，培养时间15h ； 所述互生培养基组成为:麦芽糊精50g，玉米粉50g，豆粉15g，麸皮10g，海藻糖10g，酵母粉4g，玉米浆lg，硫酸铵lg，磷酸氢二钾lg，磷酸二氢钾lg，纯净水1000mL，pH值5，121 °C灭菌20min ； (6)菌种混合发酵 将步骤(5)中二级种子罐互生液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度28°C，搅拌速度200r/m，通风量(V/V)l:l，培养时间IOh ;然后以1°C /h降温速率缓慢降温至10°C，恒温培养15h ;继续以TC /h降温速率缓慢降温至2°C，此时，将步骤(5)中二级种子罐互生液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20h ;最后以1°C /h升温速率缓慢升温至.10°C，恒温培养15h ;继续以1°C /h升温速率缓慢升温至30°C，恒温培养15h ； 溶解氧控制:通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15% ； PH控制:通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5 ； 补料控制:当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时,开始添加补料培养基,补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml ； 放罐标准:60%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢； 所述发酵培养基组成为:麦芽糊精50g，玉米粉50g，豆粉15g，麸皮10g，海藻糖30g，酵母粉4g，玉米浆lg，硫酸铵lg，磷酸氢二钾lg，磷酸二氢钾lg，纯净水1000mL，pH值5，121 °C灭菌20min ； 所述补料培养基重量组成为:麦芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，中草药剂粉5%，不足部分纯净水补足，pH值5，121°C灭菌30min ； (7)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体酸性木聚糖酶； 所述调配过程不添加任何防腐剂； 经上述制备方法得到的发酵液酸性木聚糖酶酶活力为5300U/mg。
6.根据权利要求1-5所述混合中性纤维素酶的制备方法，包括如下步骤:所述混合混合中性纤维素酶的制备方法如下:将纤维素酶、酸性木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶和中草药粉剂按照重量份数混合而成； (O黑曲霉、枯草芽孢杆菌菌种活化 将保存完好的黑曲霉的斜面菌种接种于斜面培养基，28-35°C培养36-48h进行菌种活化,如此活化2-4次； 将保存完好的枯草芽孢杆菌的斜面菌种接种于斜面培养基，34-35°C培养24-36h进行菌种活化，如此活化2-3次； (2)黑曲霉液体种子扩大培养 所述黑曲霉一级种子罐发酵液菌体浓度为7.0x108-8.0xlO8个/ml ； 枯草芽孢杆菌液体种子扩大培养 一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度32-36 °C，搅拌速度200-400rpm，通风量(V/V) 1:1-2，罐压.0.05Mpa,培养时间 10-20h ； (3)黑曲霉、枯草芽孢杆菌一级种子罐液体种子混合 将步骤(2)得到的黑曲霉种子罐液体种子与步骤(2)得到的枯草芽孢杆菌种子罐液体种子按体积比均匀混合；所述黑曲霉种子液与枯草芽孢杆菌种子液体积比为1:0.5-1 ； 所述混合液体种子菌体浓度为:7.0x108-8.0xlO8个/ml ；(4)二级种子罐互生 将步骤(3)中均匀混合的一级种子罐液体种子以10%接种量接入总容积为300L的二级种子罐，互生培养基装量240L，二级种子罐发酵罐，培养温度28-35°C，搅拌速度200_700r/m，通风量(V/V) 1:1-3,培养时间15-24h ； (5)菌种混合发酵 将步骤(4)中二级种子罐互生液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度28-30°C，搅拌速度200-700r/m，通风量(V/V)l:l-3，培养时间10_15h ;然后以1_2°C /h降温速率缓慢降温至10-15°C，恒温培养15-20h ;继续以1_2°C /h降温速率缓慢降温至2_5°C，此时，将步骤(4)中二级种子罐互生液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h ;最后以1-20C /h升温速率缓慢升温至10_15°C，恒温培养15-20h ;继续以1_2°C /h升温速率缓慢升温至30-35°C，恒温培 养15-20h ； (6)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体酸性木聚糖酶。
【文档编号】D21C5/00GK103642774SQ201310573648
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】赵迎春, 王刚, 谢合群 申请人:宁夏夏盛实业集团有限公司