专利名称：高分子量多环芳烃降解菌株及其混合菌系的制作方法
技术领域：
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及高分子量多环芳烃降解菌株 及其混合菌系，本发明还涉及该些菌株以及其混合菌系的应用。
背景技术：
多环芳烃(PAHs)是一种由两个或两个以上的苯环以线状、角状和簇状排列的稠 环型化合物。由于多环芳烃具有毒性、生物蓄积性和半挥发性，并能在环境中持久存在，被 列入典型持久性有机污染物(POPs)，受到国际上科学界的广泛关注。PAHs在其生成、迁移、 转化和降解过程中，通过呼吸道、皮肤、消化道进入人体，极大地威胁着人类的健康。微生物 降解被认为是PAHs污染土壤修复的重要途径，具有成本低、效率高、不易造成二次污染等 优点。但PAHs随着分子量的增加，其水溶性急剧减小，毒性也越来越高，研究发现苯环数量 越多越难被微生物所降解利用。从受污染的地区土壤中筛选分离出PAHs的降解优势菌株， 再将其投回到污染环境，是进行修复多环芳烃污染土壤的关键环节。近几年随着城市化进程发展迅速，许多城市的发展极为迅速，原先位于郊区的一 些化工类企业周围都逐渐成为人口聚集的市区，例如北京市在最近几年将五环内的工业企 业都进行了搬迁，这些工业用地都将进行二次开发转变为居住、商业或娱乐用地，但由于其 过去生产过程中的废水、废渣及化学品的影响，其厂区或附近区域的土壤受到了严重的污 染，在开发过程或开发后带来了一系列环境和健康风险问题，因此，有必要对其污染进行必 要的评估和修复。调查研究发现，焦化煤气、有机化工、石油工业、炼钢炼铁等工业所排放的 废弃物中有相当高浓度的多环芳烃，其中焦化厂是多环芳烃污染排放最严重的一类企业。近年来，能够降解低分子量PAHs的微生物被大量报道，如假单胞菌属、分枝杆菌 属、芽孢杆菌属等，但关于高分子量PAHs降解菌的报道还相对较少。事实上，环境中PAHs 通常以多种组分同时存在，呈现为复合污染现象，其中包含大量难降解的高分子量PAHs，因 此，筛选能同时降解多种高分子量PAHs的微生物具有十分重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有的降解高分子量多环芳烃存在的难题，提供一种高 效的降解菌系及其应用，主要是在土壤或废水的生物处理和环境污染修复中用于降解高分 子量多环芳烃的应用。本发明所提供的降解菌系从受多环芳烃污染的土壤中经过人工富集培养、分离纯 化得到，来源于北京焦化厂厂区内受多环芳烃污染的土壤。该混合菌系包括四株不同种属的纯菌Methylobacterium sp. lxb_3、 Burkholderia sp. Ixb一5、Rhodococcus sp. Ixb一6、Phyllobacterium sp.Ixb一9。其中，Methylobacterium sp. lxb_3为甲基杆菌属，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落较 小，呈淡粉色，表面光滑不透明，边缘整齐；其16S rDNA的GenBank登录号为GQ249213，序 列如SEQ ID NO :1所示；该菌株于2010年4月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通
3微生物中心(地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏， 编号为CGMCCNo. 3713，其分类学命名为甲基杆菌(Methylobacterium sp.)。Burkholderia sp. lxb_5为伯克霍尔德氏菌属，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈白 色，半透明，边缘不整齐，不易挑取；其16S rDNA的GenBank登录号为GQ249215，序列如SEQ ID NO :2所示；该菌株于2010年4月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心保藏，编号为CGMCC No. 3714，其分类学命名为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)。Rhodococcus sp. lxb_6为红球菌属，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈红色，边缘整 齐，菌落较大，湿润；其16S rDNA的GenBank登录号为GQ249216，序列如SEQ ID N0:3所示； 该菌株于2010年4月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为 CGMCC No. 3715，其分类学命名为红球菌(Rhodococcus sp.)。Phyllobacterium sp. lxb_9为叶杆菌属，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈乳白色， 不透明，边缘整齐；其16S rDNA的GenBank登录号为GQ249219，序列如SEQ ID NO :4所示； 该菌株于2010年4月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为 CGMCC No. 3716，其分类学命名为叶杆菌(Phyllobacterium sp.)。该四株单菌均对五种高分子量多环芳烃，即苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k] 荧蒽、苯并[a]芘和茚并[l，2，3_cd]芘具有降解作用。包括该四株单菌的混合菌系对这五种PAHs有更好的降解效果，其中 Methylobacterium sp. lxb_3、Burkholderia sp. lxb_5、Rhodococcus sp. lxb_6 禾口 Phyllobacterium sp. lxb_9四株纯菌的混合比例可优选1 2 1 2 1 2 1 2，更优选 1 1 1 1。该、混合菌系的制备方法包括 M Methylobacterium sp. lxb_3、Burkholderiasp. lxb_5、Rhodococcus sp. lxb-6 禾口 Phyllobacterium sp. lxb_9 分别接种至牛肉膏蛋白月东液 体培养至对数期，离心后弃去上清液，加入磷酸盐缓冲液洗涤，再次离心后弃上清液，收获 菌体，然后将四种菌悬液混合制得菌系。该混合菌系在土壤中的最适宜降解条件为温度20 30°C，土壤含水率15% 35%，营养盐比例(C N P)为 100 120 10 1。该混合菌系还有较强的环境适应能力，可用于修复受高分子量PAHs污染的土壤 或水体。
图1为菌系BJHl对土壤中PAHs的降解率。
具体实施例方式实施 歹|J IMethylobacterium sp. lxb~3>Burkholderia sp. lxb-5>Rhodococcussp. lxb-6、Phyllobacterium sp. lxb-9的分离与降解高分子量PAHs的性能现场采集北京焦化厂厂区内某车间附近受PAHs污染较严重处土壤，称取IOg新 鲜土壤样品，加入装有IOOml无机盐液体培养基中，在室温下振荡一周，取IOmL土壤溶液转 接至新鲜的含PAHs的选择性无机盐培养基中。驯化时采用定时定量转接、间歇式逐步提高 PAHs浓度的方法(苯并[a]芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、茚并[l，2，3_cd]芘的初始浓度均为lmg·!/1)，室温下150rpm培养一周，按10%的接种量转接到新鲜的选择 性无机盐培养基中，每转接一次，各PAHs的浓度提高Img · L—1，如此反复5次，最后各PAHs 的浓度提高至5mg · L—1。无机盐培养基(MSM)成分=KH2PO45. 5g、K2HPO4 6. 0g、KCl 2. 0g、MgSO4 · 7H20 0. 2g、Na2SO4 2. 0g、微量金属盐 1. Oml (MnSO4 39. 9mg, ZnSO4 · H2O 42. 8mg, (NH4)MoO24 · 4H20 34. 7mg，蒸馏水1000ml)、琼脂15g(固体培养基)、蒸馏水1000ml、pH7. 0。经过五个阶段的培养驯化，将驯化的最后一阶段的培养液稀释至不同的梯度，涂 布于表面涂有该五种PAHs的选择性无机盐固体培养基平板上，培养后挑取单菌落至牛肉 膏蛋白胨固体平板，经反复划线分离得到多株纯菌，纯菌经过接种至液体培养基中验证 其降解五种高分子量PAHs的能力，最终得到四株高分子量PAHs的降解菌lxb-3、lxb_5、 lxb-6、lxb-9。经过 16S rDNA 鉴定，菌株 lxb_3 属于甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)， lxb-5属于{白克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp. ), lxb_6属于红球菌属(Rhodococcus sp.), lxb-9 属于叶杆菌属(Phyllobacterium sp.)。牛肉膏蛋白胨固体培养基成分牛肉膏3. Og、蛋白胨10. Og.NaCl 5. Og、琼脂15g、 蒸馏水 IOOOml、ρΗ7· O。将 Methylobacterium sp. lxb_3、Burkholderia sp. lxb_5、Rhodococcussp. lxb-6,Phyllobacterium sp. lxb-9分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基培养至对数期，离 心后弃去上清液，加入20ml磷酸盐缓冲液洗涤2次，再次离心后弃去上清液，收获菌体，将 其菌悬液在600纳米的吸光度值(OD6tltl)均调整成为0. 5-1之间的数值，以使四种菌悬液中 的菌浓度达到几乎相同的数量级。此处的浓度并没有限制，将四种菌悬液调整成近似浓度， 仅仅是为了方便菌系的配制。将所得纯菌种的菌悬液分别接种于含苯并[a]芘、苯并[a] 蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、茚并[l，2，3-cd]芘的MSM液体培养基中，接种量为10%， 每个测定设两个重复，同时做对照样只加PAHs不加菌液。培养基中茚并[l，2，3-cd]芘的 初始浓度为2mg · L—1，苯并[a]芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽的初始浓度为 3!^·!^。摇瓶避光振荡培养12天后测试残余PAHs的浓度，计算降解率。降解率测试结果 见表1。将摇瓶中的整瓶样品进行提取残留的多环芳烃，加入等体积的丙酮和二氯甲烷溶 液(体积比为1 1)，用超声波清洗器超声萃取20min，静置分层后用分液漏斗进行分离有 机相，共萃取两次后，合并萃取液并用旋转蒸发仪浓缩，用甲醇定容至lmL，过滤后待HPLC 测定。分析仪器为德国戴安公司U3000液相色谱仪(配有自动进样器)，采用多环芳烃专用 液相色谱分析柱(250mmX4. 6mm, 5 μ m)，流动相为甲醇/水(90 10)，流速为ImL · min—1， 检测波长254nm，柱温30°C，进样体积为20 μ L。表1各菌株对五种高分子量PAHs的12天降解率
权利要求
Methylobacterium sp.lxb 3菌，为甲基杆菌属，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落较小，呈淡粉色，表面光滑不透明，边缘整齐，保藏编号为CGMCCNo.3713。
2.Burkholderia sp. lxb_5菌，为伯克霍尔德氏菌属，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈白 色，半透明，边缘不整齐，不易挑取，保藏编号为CGMCCNo. 3714。
3.Rhodococcus sp. lxb_6菌，为红球菌属，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈红色，边缘整 齐，菌落较大，湿润，保藏编号为CGMCC No. 3715。
4.Phyllobacterium sp. lxb_9菌，为叶杆菌属，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈乳白色， 不透明，边缘整齐，保藏编号为CGMCC No. 3716。
5.一种如权利要求1所述的Methylobacterium sp. lxb-3菌，其特征在于，其菌株的 16S rDNA的序列如SEQ ID NO 1所示。
6.一种如权利要求2所述的Burkholderia sp. lxb-5菌，其特征在于，其菌株的16S rDNA的序列如SEQ ID NO 2所示。
7.一种如权利要求3所述的Rhodococcus sp. lxb-6菌，其特征在于，其菌株的16S rDNA的序列如SEQ ID NO 3所示。
8.一种如权利要求4所述的Phyllobacterium sp. lxb_9菌，其特征在于，其菌株的16S rDNA的序列如SEQ ID NO 4所示。
9.一种高分子量多环芳烃降解菌系，包括如权利要求1至4中的Methylobacterium sp.lxb~3>Burkholderia sp.lxb-5>Rhodococcus sp. Ixb一6 禾口Phyllobacterium sp. Ixb一9 四株纯菌。
10.一种如权利要求9所述的高分子量多环芳烃降解菌系，其特征在于， Methylobacterium sp. lxb_3、Burkholderia sp.lxb_5、Rhodococcus sp. lxb_6 禾口 Phyllobacterium sp. lxb_9四株纯菌的混合比例为1 2 1 2 1 2 1 2，优 选 1 1 1 1。
11.一种如权利要求9所述的高分子量多环芳烃降解菌系的制备方法包括将 Methylobacterium sp. lxb_3、Burkholderia sp. lxb_5、Rhodococcussp. lxb~6 禾口 Phyllobacterium sp. lxb-9分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养至对数期，离心后弃去上清 液，加入磷酸盐缓冲液洗涤，再次离心后弃上清液，收获菌体，然后将四种菌悬液混合制得 菌系。
12.—种如权利要求1至4、9中任一项所述的菌或菌系应用于同时降解五种高分子量 多环芳烃苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘和茚并[l，2，3_cd]芘。
13.一种如权利要求1至4、9中任一项所述的菌或菌系在土壤或废水的生物处理和环 境污染修复的应用。
14.根据权利要求13所述的菌或菌系在降解受污染的土壤的应用，其特征在于，降解 土壤的条件为温度20 30°C，土壤含水率15% 35%，营养盐比例(C N P)为100 120 10 1。
全文摘要
本发明涉及四种高分子量多环芳烃高效降解菌株以及其混合菌系，该四种菌株包括Methylobacterium sp.lxb-3、Burkholderia sp.lxb-5、Rhodococcussp.lxb-6和Phyllobacterium sp.lxb-9四株纯菌，保藏编号分别为CGMCCNo.3713，CGMCC No.3714，CGMCC No.3715，CGMCC No.3716。本发明还涉及该高分子量多环芳烃降解菌系在土壤或废水的生物处理和环境污染修复的应用。利用本发明的菌可实现对五种高分子量PAHs的有效降解，利用该混合菌系可实现对高分子量PAHs的高效降解，并且该菌系在受污染的土壤或水体中可有效实施修复。
文档编号A62D3/02GK101974445SQ20101018798
公开日2011年2月16日 申请日期2010年5月26日 优先权日2010年5月26日
发明者孙寓姣, 李晓斌, 王红旗 申请人:北京师范大学