一株毒死蜱降解菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种毒死蜱降解菌（附图）ErwiniaxishuaiensisSCU-B244T=CGMCCNo.1.12772T=KCTC42022T。通过从蟋蟀体表分离、筛选、生理生化鉴定等工作，确定该菌革兰氏阴性菌，兼性好氧，菌落呈奶油色，氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，细胞主要的脂肪酸为C16:0、C16:1Δ9、C18:1Δ9、C11:03-OH和C14:03-OH，细胞内GC含量为49.3%至49.5%，具有碱性磷酸酶、酯酶（C4）、脂肪酶（C8）、酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和β-葡糖苷酶等酶活性。该菌对毒死蜱的一日降解率为44.64%，可广泛地应用在毒死蜱降解酶的开发和各类生物工程酶制剂的生产领域。【专利附图】
【附图说明】：附图为菌株ErwiniaxishuaiensisSCU-B244T30000倍下扫描电子显微镜照片。
【专利说明】一株毒死蜱降解菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物及其应用领域，具体的说，本发明涉及一种毒死蜱降解肠杆菌及其应用的【技术领域】。
【背景技术】
[0002]有机磷农药由于具有低残留、高效和使用成本低的特点，在农业生产中被广泛使用，这一方面提高了农作物的产量，但与此同时也带来了很多问题。最主要的是农药对环境的污染以及对生态的破坏，这些都直接或者间接地影响到了人类的健康。有研究表明有机磷农药有诱变和致畸性，同时神经和免疫系统疾病也被证明和有机磷农药有关，如何消除有机磷农药对环境和人类的危害，已成为事关人类健康和国民经济发展的问题。最直接的方法是减少有机磷农药的使用，就目前来说，农业生产对有机磷农药还有很高的依赖度，残留农药的降解也就成了另一个有效减少农药危害的途径。传统的物理化学处理方法不仅效率不高，手段有限，同时处理过程中还会产生二次污染，利用生物或者酶制剂来降解污染物的生物修复方法具有无毒、无残留、无二次污染等优点，是一种消除和解毒高浓度的农药残留的一种安全、有效、廉价的方法。
[0003]至今已有许多降解有机磷农药菌被分离、纯化和培养，少数有机磷农药降解基因已得到鉴定和改造。已分离的能降解有机磷农药的微生物包括细菌、真菌、放线菌和藻类等，其中由于细菌由于有种类繁多和易于改造等特点，在农药降解研究中占据很重要地位。
[0004]已经确定的可以降解有机磷农药的微生物包括细菌、真菌、放线菌和藻类，这其中细菌由于代谢途径多样和较强的适应能力，在微生物降解农药领域占有很重要的地位。某些有机磷农药可被多种微生物降解，同时某些微生物也可降解多种有机磷农药。这体现了微生物代谢的多样性，也暗示着某些微生物可用于多种农药的降解开发。
[0005]有机磷农药一般是磷酸、膦酸或氨基磷酸的酯或硫醇衍生物。磷化合物代谢的起始步骤是芳基磷酸键的水解，水解后原化合物的极性增强，磷酸化作用减弱，因此毒性减弱，水解反应也常被认为是解毒反应。
[0006]生物体内存在多种不同的有机磷降解酶，如有机磷水解酶和有机磷酸脱水酶等，在这些有机磷降解酶中，最常见的是磷酸三酯酶，这种酶已在多种微生物体内得到鉴定。目前已经得到鉴定的有机磷降解酶及其基因主要有有机磷水解酶OPH、ADPase, Β_5水解酶、OPDA, HocA, MPD和0ΡΑΑ，其中OPH是研究最多、应用最广的一种有机磷水解酶，同时该酶具有较高的催化效率。
[0007]有机磷降解酶由于酶学特性、底物特异性差异，可以应用在不同的污染环境中。OPH及OPDA可催化的底物范围广泛并且效率极高，因此是至今最有应用前景的有机磷降解酶，相应的基因的克隆与表达可以构建降解谱广、降解彻底的工程菌，为微生物降解农药开辟新途径。有机磷降解菌在生物修复方面的应用已经展开了广泛的研究。Lalithakumari等将甲基对硫磷矿化菌株假单胞菌固定在硅藻钠珠中，48小时降解了 99%甲基对硫磷，而且没有中间代谢物积累。Mulbry等用从蝇毒磷污染的土壤中分离的菌株制成生物过滤柱，7到10天内可将污水中1500mg/L的蝇毒磷降低到0.lmg/L。由此可见降解菌的制剂可以有效去除土壤、蔬菜、污水中的农药。
[0008]采用酶固定化技术制成酶反应器，可用于污水处理、土壤修复等领域。OPH固定在聚合尿烷泡沫上，保存和热稳定性比可溶性酶有了大幅度的提高，储存在25°C 20%的DMSO中，酶的半衰期延长至1500天。同时利用酶的特异性、高效性开发出快速、灵敏的生物传感器，可用在有机磷农药检测领域。
【发明内容】
[0009]针对国内外有关毒死蜱降解菌的研究现状，本发明提供一种新的毒死蜱降解菌。所述的毒死蝶降解菌可利用glycerol、D-xylose、L-sorbose、D-sorbitol、Mehyl- a -D-glucopyranoside、D-celob1se、gent1b1se、D-arabitol 和 potassium5-ketogluconate,这些特征明显区别于已公开报道的其他有效菌种。
[0010]本发明提供一种欧文氏幡蜂菌Erwinia xi shuai ensi s SCU-B244T=CGMCCN0.1.12772T=KCTC 42022t。
[0011]本发明通过以不同的温度、PH值、盐浓度和培养基为富集条件，从长期施加毒死蜱农药农田中取样，分离纯化得到多株菌，经过多级筛选确定了一株毒死蜱降解菌(Mrwiniaxishuaiensis SOJ-B244T),命名为欧文幡蜂菌。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)和韩国典型菌种保藏中心(KCTC)，保藏时间分别为2014年2月19号和2014年2月I日，保藏号分别是CGMCCN0.1.12772τ和KCTC 420221, CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编是100101，KCTC地址为韩国大田市儒城区韩国生物科学和技术研究所，邮编是305-806。该菌为革兰氏阴性菌,兼性好氧,菌落呈奶油色。氧化酶阴性,过氧化氢酶阳性。细胞主要的脂肪酸为C16^C1611A9AC1811 A9、C11:q 3-0H和C14:Q 3-0H，可利用碳源糊精、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、L-阿拉伯糖、D-果糖、D-半乳糖、a -D-葡萄糖、麦芽糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-蜜二糖、β -甲基-D-葡萄糖苷、阿洛酮糖L-棉子糖、D-海藻糖、松二糖、甲基丙酮酸、柠檬酸、甲酸、D-乳糖酸内酯、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖酸、P-羟基苯乙酸、α -酮戊二酸、丙酸、D-葡糖二酸、L -丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酰-L-天门冬氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、肌苷、尿苷、胸腺嘧啶核苷、丙三醇、D, L-α-磷酸甘油、1-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖。
[0012]对该菌株xishuaiensis SQJ-B244T的形态观察、生理生化及培养特性和化学分类均按照《放线菌系统学——方法、原理与实践》进行。其中碳源利用情况采用B1log全自动细菌鉴定系统，采用高效液相法来测定该菌细胞内GC含量，使用2.5%戊二醛固定该菌后，在扫描电镜下观察该菌的形貌(图1)，参考菌株为^nriflia oleae (DSM23398τ)0
[0013]本发明通过DNA的提取，16S rDNA的PCR及测序，同时根据在NCBI山上比对结果和进化树的构建，进一步对该菌的分类地位进行判断。
[0014]米用Sanger 法对xishuaiensis SCU_B244T 的 16SrDNA 测序结果如下(该序列已在NCBI登记，登录号为KF500917)，全长共1398bp:
TGCAGTCGAACGGTAACAGCGCAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGTATCTGCCTGATGGAGGGGGATAACCACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGG
ACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGAACCCAGATGGGATTAGCCAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAAGCGACG
ATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
GGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTA
CTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGCTGGGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACT
CCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGT
CTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCCGGGAACTGCATCTGATACTGGCAGGCTTGAGTCTCGTAGAG
GGGGGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGA
CGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGAT
GTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGTGTGGCTTCCGTAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCC
GCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGA
AGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACCCTGCAGAGATGCAGGGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGC
TGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTCTGTTGC
CAGCACTTCGGGTGGGAACTCAGGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCAT
GGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACC
TCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGACTGGAGTCTGCAACTCGACTCCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATC
AGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGT
AGTAAGCTTAACCTCAG
基于16S rDNA基因构建的系统发育树见图2，从图上可以看出欧文蟋蟀菌份xishuaiensis SCU_B244T 与欧文氏菌的一个有效种 Erwiniaoleae^YSM 23398τ 聚为一个分支，该欧文幡蜂菌xishuaiensis SQJ-B244T与亲缘性最近的菌株iZnrifliaoleaeDSM 23398τ的16S rDNA相似度为95.15%，结合表型、生理生化和基因型比较数据，表明欧文幡蜂菌Erwinia xishuaiensis SQJ-B244T为欧文氏菌属的一个新种。
[0015]通过实施本发明的具体技术指标，可达到以下预期效果。
[0016]本发明的Erwinia xishuaiensis SQJ-B244T为革兰氏阴性菌,兼性好氧,菌落呈奶油色。氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性。PH生长范围为6至9，最适生长盐浓度为1%至2%。该菌对毒死蜱的一日降解率为44.64%，同时该菌具有碱性磷酸酶、酯酶(C4)、脂肪酶(C8)、酸性磷酸酶、β -半乳糖苷酶和β -葡糖苷酶等酶活性，可广泛地应用在毒死蜱降解酶的开发和各类生物工程酶制剂的生产领域。
[0017]【专利附图】
【附图说明】:
图1是菌株份xishuaiensis SCU_B244T30000倍下扫描电子显微镜照片；图2是基于16S rDNA构建的菌株份xishuaiensis SCU_B244T和邻近种系统发育树。
[0018]下面举实施例说明本发明，但是本发明并不限于下述实施例。
【具体实施方式】
[0019]实施例一-.Erwinia xishuaiensis SCU_B244T 的筛选和分离
实验用幡蜂样品为中华幡蜂(Gryllus chinensis)的成虫，多分布于农田，于2012年8月份分批次捕捉自四川成都双流县四川大学江安校区荒地(30° 33’ 38.04”北104° 00’ 20.17”东，海拔481米)。用无菌水将微生物从蟋蟀洗脱后，采用稀释平板法涂布至TSB、查氏、高氏一号、PDA、牛肉膏蛋白胨和虫体无机盐培养基上培养，37°C下培养至可见菌落出现，纯化菌落后进行鉴定。
[0020]菌种描述:
革兰氏阴性菌，兼性好氧，菌落呈奶油色。氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性。pH生长范围为6至9，最适生长盐浓度为1%至2%。该菌具有碱性磷酸酶、酯酶(C4)、脂肪酶(C8)、酸性磷酸酶、半乳糖苷酶和葡糖苷酶等酶活性，细胞主要的脂肪酸为Λ9、C11:0 3-0Η 和 C14:0 3-0Η，细胞内 GC 含量为 49.3% 至 49.5%。
[0021]实施例二-.Erwinia xishuaiensis SCU_B244T 的多相分类鉴定
对该菌株份xishuaiensis SQJ-B244T的碳源利用情况采用B1log全自动细菌鉴定系统，脂肪酸成分测定采用GC-MS分析，酶学特性采用API ZYM试剂条鉴定，产酸实验采用API50CHE试剂条鉴定，参考菌株为份oleaeDSM 23398τ。碳源利用情况采用B1log全自动细菌鉴定系统测定。结果如下:
可利用碳源:糊精、N-乙酸基-D-匍萄糖胺、L-阿拉伯糖、D-果糖、D-半乳糖、a -D-匍萄糖、麦芽糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-蜜二糖、β -甲基-D-葡萄糖苷、阿洛酮糖L-棉子糖、D-海藻糖、松二糖、甲基丙酮酸、柠檬酸、甲酸、D-乳糖酸内酯、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖酸、P-羟基苯乙酸、α-酮戊二酸、丙酸、D-葡糖二酸、L -丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酰-L-天门冬氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、肌苷、尿苷、胸腺嘧啶核苷、丙三醇、D, L-α-磷酸甘油、1-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖。
[0022]具有的酶活性:碱性磷酸酶、酯酶(C4)、脂肪酶(C8)、酸性磷酸酶、β -半乳糖苷酶和葡糖苷酶。
[0023]API50CHE鉴定结果对比
Erwinia xishuaiensis SCU_B244T 的结果:
control -, glycerol+ , erythritol-, D—arabinose—, L—arabinose+、D—ribose +、D—xylose+、L—xylose —、D—ardonitol —、Mehyl- β D—xylopyranoside—、D—galactose+、D—glucose +、D—fructose+、D—mannose+、L—sorbose+、L—rhamnose+、dulcitol-、inositol -、D-mannitol +、D-sorbitol +、Mehyl-a D-mannopyranoside-、Mehyl- a -D-glucopyranoside+、N_acetylglucosamine+、amygdalin—、arbutin +、esculinferric citrate+、salicin+、D—celob1se+、D—maltose+、D—lactose—、D、melib1se +、D-saccharose (sucrose) _、D-trehalose+、inulin-、D-melezitose-、D-raffinose-、amidon(starch)_、glycogen-、xylitol-、gent1b1se+、D-turanose-、D-lyxose-、D—tagatose—、D—fucose—、L—fucose—、D—arabitol—、L—arabitol—、potassium gluconate+、potassium 2-ketogluconate+>potassium 5-ketogluconate+ -,Erwinia oleae DSM 23398T的结果:
control -, glycerol-, erythritol-, D—arabinose—, L—arabinose+、D—ribose+、D—xylose—、L—xylose —、D—ardonitol —、Mehyl- β D—xylopyranoside—、D—galactose+、D—glucose +、D—fructose+、D—mannose+、L—sorbose—、L—rhamnose+、dulcitol-、inositol -、D-mannitol +、D-sorbitol-、Mehyl- a D-mannopyranoside-、Mehyl- a-D-glucopyranoside-、N-acetylglucosamine+、amygdalin-、arbutin +、esculin ferric citrate+、salicin+、D—celob1se—、D—maltose—、D—lactose—、D、melib1se -> D-saccharose (sucrose)-> D-trehalose +、inulin-、D-melezitose-、D-raffinose-> amidon (starch)-、glycogen-、xylitol-、gent1b1se-、D-turanose-、D—lyxose—、D—tagatose—、D-fucose -、L—fucose—、D—arabitol+、L—arabitol—、potassiumgluconate+、potassium 2—ketogluconate+、potassium 5-ketogluconate
[0024]从API50 CHE 结果来看，菌株xishuaiensis SCU_B244T 和最亲近菌种Erwinia oleae DSM 23398T共有11中底物利用不同，结合进化树数据判断该菌为欧文氏菌属的一个新种。
[0025]实施例三:16S rDNA测序及进化树构建
采用SDS法提取细菌总DNA，通过PCR法扩增菌株16S rRNA基因序列，DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。到GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)数据库将各菌株测得的16S rRNA基因部分序列提交注册获得序列号。再在NCBI (Nat1nalCenter for B1technology Informat1n)上进行BLAST比对，找到亲缘关系最近的菌株。通过B1Edit将亲缘性最近的相应菌株进行序列比对，然后在软件MEGA 5.0上使用Neighbor-Joinin(N-J)法构建系统进化树。PCR相应引物、反应体系、条件如下:
弓丨物 PA8: 5’-CCGTCGACGAGCTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和 PBl: 5’-CCCGGGTACCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，反应体系(25 μ L 体系)=Mg2+ 2.5 μ L, ΡΑ8 2.5 μ L, PBl2.5μ L, dNTP 0.75 μ L, H2O 14 μ L, Taq 酶 0.25 μ L，反应条件 95°C预变性 5min，94°C变性45s，50°C退火45s，延伸lmin，重复35个循环，72°C保温lOmin。构建的进化树见图2。
[0026]实施例四:Erwinia xishuaiensis SCU_B244T对毒死蝶降解实验
将菌种接至TSB (深孔板，每孔6 mL)，37°C、140rpm培养，第二天同一时间加毒死蜱(12g/L，l% Tween 80助溶)200 μ L，取样检测毒死蜱含量，第三天同一时间取样，检测毒死蜱含量。毒死蜱含量检测方法:使用石油醚抽提，测抽提液293nm时的吸光度。实验重复三次，结果取平均值，结果为44.64%。
【权利要求】
1.一株毒死蜱降解菌 Erwinia xishuaiensis SCU_B244T=CGMCC N0.1.12772T=KCTC42022τ。
2.如权利要求1所述的毒死蝶降解菌Erwiniaxishuaiensis SQJ-B244T=CGMCCN0.1.12772T=KCTC 42022τ，其特征为革兰氏阴性菌，兼性好氧，菌落呈奶油色，氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，细胞主要的脂肪酸为C16PClf^1A9Xm1 Δ9Χ11:0 3-0H和C14:(l 3_0H，细胞内GC含量为49.3%至49.5%，具有碱性磷酸酶、酯酶(C4)、脂肪酶(C8)、酸性磷酸酶、β -半乳糖苷酶和葡糖苷酶等酶活性。
【文档编号】A62D101/04GK104250626SQ201410269645
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年6月18日 优先权日:2014年6月18日
【发明者】田永强, 刘波, 王磊, 邱鹏, 龙秀锋 申请人:四川大学