专利名称：肝癌细胞特异性内在化短肽及其体外筛选和鉴定的制作方法
技术领域：
本发明涉及肝癌细胞特异性内在化的短肽及其体外筛选和鉴定，属肿瘤细胞特异性内在化短肽的筛选和鉴定的技术领域。
背景技术：
肝癌因其极高的死亡率严重威胁着人类的健康。近年来，随着对肿瘤生物学和细胞表面受体研究的深入，导向治疗显示出良好的治疗效果，并逐步发展成为一个重要的肿瘤治疗领域。导向治疗指利用特异性能作用于肿瘤组织或器官的导向分子作为药物载体，将药物导向肿瘤，有效地提高药物导向的特异性，实现治疗的针对性和安全性。目前普遍采用的导向分子主要是单克隆抗体及其片段，近年来由抗体相关分子构建的导向治疗药物取得了巨大的成功。然而由于单抗分子所具有的分子量大、免疫原性高、肿瘤浸润能力差等缺点，大大阻碍了相关治疗药物在临床治疗领域的发展。
针对单抗分子具有上述这些缺点，越来越多的研究者将目光投向小分子的多肽类靶向分子，由于多肽分子具有分子量小的特点，从根本上解决了免疫原性高和肿瘤浸润能力差的问题，成为目前发展的热点。噬菌体展示技术(phage display technique)是利用基因操作手段，将编码选定多肽的外源DNA片段与丝状噬菌体的外壳蛋白基因进行适当的重组，使重组后的外源DNA片段随同噬菌体的外壳蛋白基因一起被转录和翻译，使外源DNA编码的多肽与噬菌体外壳蛋白形成的融合蛋白表达展示在病毒的表面。该外源肽仍能保留其抗原特异性和生物活性，且融合表达不影响噬菌体的繁殖，因此可对该外源多肽进行体外筛选。
传统的筛选技术通常直接针对肿瘤细胞特异性蛋白或者肿瘤细胞表面进行筛选，所得到的导向分子也是与肿瘤细胞表面相结合，虽然解决了局部提高治疗药物浓度的作用，但是并不能有效地提高治疗药物对肿瘤细胞的进入问题，而大部分药物都需要进入到细胞内部以后才能够最好地发挥作用。因此对具有内在化能力的特异性结合肽的筛选具有十分重要的意义。
用噬菌体展示库筛选内在化抗体，就是通过噬菌体展示库与靶细胞相互作用一段时间，启动内在化途径，通过体外筛选直接筛选出能与细胞表面受体结合并内在化的噬菌体表达短肽。本发明通过体外筛选技术筛选到4种与肝癌细胞BEL-7404特异性结合的噬菌体短肽，并通过有效的方法对噬菌体短肽进行鉴定，鉴定到短肽可以内在化。因此，在肝癌的治疗和诊断中有着潜在的应用价值。
发明内容
本发明的一个目的是公开4种肝癌细胞特异性内在化短肽，其特征在于，所述的短肽的氨基酸结构具有如下序列1.DLNYFTLSSKRE；2.DLNYLTLSSKRE；3.DLNYHARSYKRE；4.NLKLLDSQDWDG。
此类短肽不仅仅具有特异性结合肝癌细胞的能力，还可以通过相关受体的介导有效地进入到细胞内部，可以大大提高肿瘤治疗药物对肝癌的特异性杀伤作用。
本发明的另一个目的是推出一种体外筛选肝癌细胞特异性内在化短肽的方法。用该法筛选到的内在化短肽可将药物定向运输到肝癌细胞中，更好地发挥药物的药理作用。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案。通过噬菌体表面展示肽库与靶细胞的相互作用，启动内在化途径，体外筛选能与细胞表面受体结合的内在化短肽。
现详细说明本发明的技术方案。
一种体外筛选肝癌细胞特异性内在化短肽的方法，其特征在于一、所需材料
噬菌体表面展示肽库随机12肽噬菌体展示文库(Ph.D.12TMPhage Display PeptideLibrary Kit)购自美国New England Biolabs公司，其中噬菌体的滴度为1.5×1013pfu/ml，多样性为2.7×109，宿主菌为E.coli ER2738；细胞人肝癌细胞BEL-7404和正常人肝细胞HL-7702购自上海中科院细胞库；关键试剂枯草杆菌蛋白酶和氯喹购自FLUKA公司；PBS每升溶液中含130mM NaCl，7mM Na2HPO4-12H2O，3mMNaH2PO4，pH 7.5；TBS每升溶液中含50mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5；细胞裂解液2％w/v的去氧胆酸钠，10mMTris-HCl，2mM EDTA，pH 8.0；蛋白酶抑制剂每毫升中含有PMSF 100mM、Aprotinin 15uM、Leupeptin 100μM、Bestatin 100μM、Pepstain A 100μM、E-64 80μM溶解在DMSO中；二、内在化短肽的体外筛选，操作步骤第一步 将10μl上述的肽库加入含100μM氯喹和10％CBS2ml的1640培养基中，室温孵育1小时；第二步向体外培养至80％聚合度的人肝癌细胞BEL-7404的培养瓶内加入2ml含100μM氯喹和10％CBS的1640培养基，37℃孵育30分钟；第三步将经第一步处理的2ml肽库加入经第二步处理的培养瓶内，37℃孵育2小时；第四步将所述的培养瓶放冰上5分钟，后续的操作都在4℃下进行，用2ml含Mg2+和Ca2+的PBS清洗细胞2次，再用2ml PBS清洗细胞6次，每次都是3分钟，再用TBST清洗细胞1～4次，TBST的配方为TBS中加入0.05％v/vTween-20；
第五步加入含有枯草杆菌蛋白酶3mg/ml的TBS与表面结合有噬菌体的肿瘤细胞孵育45分钟，降解与细胞表面结合的噬菌体，用含有0.1％的乙二胺四乙酸二钠溶液使细胞重悬，1500rpm离心10分钟，离心收集得到单细胞悬液，最后加入5ml的含有蛋白酶抑制剂的PBS孵育15分钟，终止酶的活性；第六步对经第五步处理后的溶液进行1500rpm离心，时间为10分钟，收集细胞，用PBS清洗，重悬于200μl的细胞裂解液中，振荡离心管，室温孵育30分钟，加入50μM的MgCl2到混合物中，中和裂解缓冲液中的EDTA并帮助侵染，回收后的溶液留5μl测滴度，200μl保存，其余的噬菌体侵染大肠杆菌扩增并测滴度；第七步为除去能够和正常肝细胞结合的噬菌体，选择聚合度达到80％的生长状态良好的HL-7702，用PBS清洗3次，洗掉未贴壁的细胞，加入第一次筛选的噬菌体肽10μl，内含噬菌体约1011个，温育1小时，吸取上清，所得到的未与正常肝细胞结合的噬菌体就是所需的肝癌细胞特异性内在化噬菌体，放入4℃冰箱保存，测定噬菌体的滴度，至此，第一轮体外筛选完成；整个筛选过程共包括三轮，在第二轮开始时加入第一轮筛选后扩增的噬菌体，而第三轮采用的是第二轮筛选后扩增的噬菌体，第三轮筛选后的噬菌体含有肝癌细胞特异性内在化短肽，从第二轮和第三轮筛选后测滴度的平板上各挑选了20个蓝斑进行测序并鉴定。
本发明的另一个目的是提供一种鉴定肝癌细胞特异性内在化短肽的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案。
一种鉴定肝癌细胞特异性内在化短肽的方法，其特征在于一、所需材料上述的体外筛选得到的噬菌体单克隆，宿主菌为E.coli ER2738；细胞人肝癌细胞BEL-7404、BEL-7402、正常人肝细胞HL-7702、正常人胚肾细胞293购自上海中科院细胞库；
关键试剂兔抗噬菌体M13抗血清由澳大利亚CSIRO动物健康研究所(Australia Animal Health Laboratory)王林发研究员惠赠；HRP-兔抗M13抗体购自Sigma公司；FITC标记的羊抗兔IgG购自上海华美公司；枯草杆菌蛋白酶和氯喹购自FLUKA公司；PBST05PBS中加入0.05％v/vTween-20；PBS-S含0.1％的皂角苷的PBS；PBS-SB含1％w/v的BSA的PBS-S；细胞裂解液50mMTris-HCl，150mMNaCl，0.2g/LNaN3，1g/L SDS，5g/L脱氧胆酸钠；D-Hank’sNaCl 8.00g/L，KCl 0.40g/L，Na2HPO4-12H2O 0.12g/L，KH2PO4 0.06g/L，右旋葡萄糖(D-Glucose)1.00g/L，NaHCO3 0.35g/L；蛋白酶抑制剂每毫升中含有PMSF 100mM、Aprotinin 15μM、Leupeptin 100μM、Bestatin 100μM、Pepstain A 100μM、E-64 80μM溶解在DMSO中；二、肝癌细胞特异性内在化短肽的鉴定方法有以下四步，具体操作步骤第一步 细胞ELISA鉴定噬菌体单克隆与细胞的结合力选择生长状态良好的人肝癌细胞BEL-7404消化下来，记数后将细胞悬液，浓度调至5×105cells/ml，分别加入96孔细胞培养板，细胞板每孔加100μl细胞悬液，37℃细胞培养箱中过夜，使细胞贴壁，D-Hanks缓冲液清洗细胞，无血清培养基培养1小时，每孔加封阻液100μl，封阻液的配方为PBST05中加入4％的脱脂奶粉，37℃封阻1小时，每孔用PBST05洗板，反复3次，每孔加噬菌体单克隆1010个，同样数量的野生型噬菌体作阴性对照，不加噬菌体克隆做空白对照，4℃温育2小时，同上洗板，每孔加兔抗噬菌体抗体100μl，兔抗噬菌体M13抗体用所述的封阻液以1∶1000的重量比稀释，37℃温育1.5小时；洗板，每孔再加HRP标记的羊抗兔IgG抗体100μl，羊抗兔酶标抗体用所述的封阻液以以1∶2500的重量比稀释，37℃温育1小时，洗板，每孔加OPD底物显色液，37℃显色10～15分钟，每孔加酶终止液2M H2SO450μl，终止显色，酶标仪490nm波长读数；第二步竞争ELISA鉴定噬菌体单克隆与细胞的结合力取一瓶生长状态良好的BEL-7404肿瘤细胞，用胰酶消化下来，用PBS清洗几遍，加入适量的蛋白酶抑制剂后放入冰盒内作用1.5小时，使细胞充分裂解，裂解细胞获得的蛋白直接于4℃进行12000rpm高速离心1.5小时，获得的上清即为肿瘤细胞膜蛋白溶液，将抽提的膜蛋白以不同的稀释度1∶2，1∶4，1∶20，1∶50，1∶100，1∶200，4℃过夜包板，取生长状态良好的细胞转到96孔板内，在有膜蛋白的孔内加入噬菌体单克隆，每孔的加入量约为1010个与膜蛋白37℃孵育1小时，取上清加到有细胞的96孔板内，方法与第一步的操作完全相同；第三步免疫荧光检测噬菌体肽的内在化在预先放置有盖玻片的24孔板中每孔加入105个细胞，过夜培养，用D-Hank’s清洗掉未贴壁的细胞，细胞和单克隆都预先与含100uM氯喹的培养基37℃预先孵育30分钟，将噬菌体单克隆加入孔内，37℃作用2小时，用冷的PBST05洗三次，每次5分钟，用含1％BSA和pH2.2的0.1μM甘氨酸-HCL洗2次，每次5分钟，再用冷的PBST05洗三次，每次5分钟，细胞用4％的多聚甲醛37℃固定15分钟，用PBS-S孵育15分钟，增加细胞的渗透性，用PBS-SB封阻15分钟，用含0.1％兔抗噬菌体M13 IgG的PBS-SB 37℃孵育1.5小时，PBST清洗4次，与FITC共轭结合的含羊抗兔抗体IgG的PBS-B以稀释37℃作用1小时，羊抗兔抗体IgG与PBS-B的重量比为1∶30，PBST清洗4次，用缓冲甘油封片，将玻片倒扣在玻璃板上，荧光显微镜检测；第四步 流式细胞仪定量检测噬菌体肽的内在化待小瓶细胞长满，加入109个单克隆到培养瓶内，37℃作用2小时，同时设对照加M13，空白，原库，正常细胞，为阻止进一步内吞，培养瓶放冰上5分钟，倒掉上清，PBST清洗3次，TBST清洗3次，加入含枯草杆菌蛋白酶1.5mg/ml的TBS 1ml，与细胞孵育15分钟，降解细胞表面结合的噬菌体，用滴管将细胞吹打下来，得单细胞悬液，转到道夫管内，1000rpm离心7分钟，去上清，PBST清洗2次，加入4％多聚甲醛100μl，37℃固定15分钟，PBST清洗2次，加含3％BSA和0.1％皂素的PBS，37℃固定30分钟，PBST清洗2次，加入兔抗噬菌体M13抗体IgG，37℃作用1.5小时，兔抗噬菌体M13抗血清用所述的封阻液以1∶1000的重量比稀释，PBST清洗2次，加入FITC标记的羊抗兔IgG抗体，37℃作用1小时，FITC标记的羊抗兔IgG抗体与PBS-B的重量比为1∶30，PBST清洗2次，上流式细胞仪检测荧光强度。
与背景技术相比，本发明具有以下优点特异性高，效果好的特点，尤其是多肽所具有的内在化能力，对于日后对肿瘤药物在癌症部位的有效载运具有十分重要的意义。
图1BEL-7404对噬菌体随机12肽库的筛选和富集。
图2为了鉴定噬菌体单克隆与肝癌细胞BEL-7404的结合力强弱，将噬菌体单克隆与肝癌细胞孵育，通过OD值来检测。实验结果如图2，说明4个单克隆相比M13都与肝癌细胞有很强的结合力，并且1号克隆相比其他的克隆与肝癌细胞的结合能力要更强一些。
图3细胞ELISA鉴定噬菌体单克隆的结果，为了鉴定噬菌体单克隆与肝癌细胞BEL-7404的结合力强弱，将噬菌体单克隆与肝癌细胞孵育，通过OD值来检测。实验结果如图2，说明4个单克隆相比M13都与肝癌细胞有很强的结合力，并且1号克隆相比其他的克隆与肝癌细胞的结合能力要更强一些。
图4图A、D、G、J分别为4种克隆与肝癌细胞BEL-7404孵育的结果，而B、E、H、K分别是4种克隆与正常肝细胞HL-7702孵育的结果C、F是原库和M13野生型噬菌体与肝癌细胞BEL-7404孵育的结果；K、L是1号克隆与肝癌细胞BEL-7402和正常人胚肾细胞293孵育的结果。
图5共4行，每行的三张图片分别是4个克隆与肝癌细胞BEL-7404孵育，加入内在化抑制剂秋水仙素、蔗糖之后的荧光图片。
图6A-F六幅图片分别是噬菌体与肝癌细胞BEL-7404在不同孵育时间(5分钟，10分钟，15分钟，30分钟，1小时，2小时)孵育的结果。
图7不同细胞与1号克隆孵育，通过流式细胞检测荧光强度比较。
图8不同克隆与肝癌细胞BEL-7404孵育结果。
具体实施例方式
在以上的发明内容中，已详细公开了体外筛选和鉴定肝癌细胞特异性内在化短肽的方法的具体操作步骤，这部分的内容就是实施例。为避免行文重复，此处就不再赘述。
权利要求
1.4种肝癌细胞特异性内在化短肽，其特征在于，所述的短肽的氨基酸结构具有如下序列1.DLNYFTLSSKRE；2.DLNYLTLSSKRE；3.DLNYHARSYKRE；4.NLKLLDSQDWDG。
2.一种体外筛选肝癌细胞特异性内在化短肽的方法，所述的肝癌细胞特异性内在化短肽就是权利要求1所述的肝癌细胞特异性内在化短肽，其特征在于一、所需材料噬菌体表面展示肽库随机12肽噬菌体展示文库(Ph.D.12TMPhage Display PeptideLibrary Kit)购自美国New England Biolabs公司，其中噬菌体的滴度为1.5×1013pfu/ml，多样性为2.7×109，宿主菌为E.coli ER2738；细胞人肝癌细胞BEL-7404和正常人肝细胞HL-7702购自上海中科院细胞库；关键试剂枯草杆菌蛋白酶和氯喹购自FLUKA公司；PBS每升溶液中含130mM NaCl，7mM Na2HPO4-12H2O，3mMNaH2PO4，pH 7.5；TBS每升溶液中含50mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5；细胞裂解液2％w/v的去氧胆酸钠，10mMTris-HCl，2mM EDTA，pH 8.0；蛋白酶抑制剂每毫升中含有PMSF 100mM、Aprotinin 15uM、Leupeptin 100μM、Bestatin 100μM、Pepstain A 100μM、E-64 80μM溶解在DMSO中；二、内在化短肽的体外筛选，操作步骤第一步 将10μl上述的肽库加入含100μM氯喹和10％CBS2ml的1640培养基中，室温孵育1小时；第二步 向体外培养至80％聚合度的人肝癌细胞BEL-7404的培养瓶内加入2ml含100μM氯喹和10％CBS的1640培养基，37℃孵育30分钟；第三步 将经第一步处理的2ml肽库加入经第二步处理的培养瓶内，37℃孵育2小时；第四步 将所述的培养瓶放冰上5分钟，后续的操作都在4℃下进行，用2ml含Mg2+和Ca2+的PBS清洗细胞2次，再用2ml PBS清洗细胞6次，每次都是3分钟，再用TBST清洗细胞1～4次，TBST的配方为TBS中加入0.05％v/vTween-20；第五步 加入含有枯草杆菌蛋白酶3mg/ml的TBS与表面结合有噬菌体的肿瘤细胞孵育45分钟，降解与细胞表面结合的噬菌体，用含有0.1％的乙二胺四乙酸二钠溶液使细胞重悬，1500rpm离心10分钟，离心收集得到单细胞悬液，最后加入5ml的含有蛋白酶抑制剂的PBS孵育15分钟，终止酶的活性；第六步 对经第五步处理后的溶液进行1500rpm离心，时间为10分钟，收集细胞，用PBS清洗，重悬于200μl的细胞裂解液中，振荡离心管，室温孵育30分钟，加入50μM的MgCl2到混合物中，中和裂解缓冲液中的EDTA并帮助侵染，回收后的溶液留5μl测滴度，200μl保存，其余的噬菌体侵染大肠杆菌扩增并测滴度；第七步 为除去能够和正常肝细胞结合的噬菌体，选择聚合度达到80％的生长状态良好的HL-7702，用PBS清洗3次，洗掉未贴壁的细胞，加入第一次筛选的噬菌体肽10μl，内含噬菌体约1011个，温育1小时，吸取上清，所得到的未与正常肝细胞结合的噬菌体就是所需的肝癌细胞特异性内在化噬菌体，放入4℃冰箱保存，测定噬菌体的滴度，至此，第一轮体外筛选完成；整个筛选过程共包括三轮，在第二轮开始时加入第一轮筛选后扩增的噬菌体，而第三轮采用的是第二轮筛选后扩增的噬菌体，第三轮筛选后的噬菌体含有肝癌细胞特异性内在化短肽，从第二轮和第三轮筛选后测滴度的平板上各挑选了20个蓝斑进行测序并鉴定。
3.一种鉴定肝癌细胞特异性内在化短肽的方法，其特征在于一、所需材料上述的体外筛选得到的噬菌体单克隆，宿主菌为E.coli ER2738；细胞人肝癌细胞BEL-7404、BEL-7402、正常人肝细胞HL-7702、正常人胚肾细胞293购自上海中科院细胞库；关键试剂兔抗噬菌体M13抗血清由澳大利亚CSIRO动物健康研究所(Australia Animal Health Laboratory)王林发研究员惠赠；HRP-兔抗M13抗体购自Sigma公司；FITC标记的羊抗兔IgG购自上海华美公司；枯草杆菌蛋白酶和氯喹购自FLUKA公司；PBST05PBS中加入0.05％v/vTween-20；PBS-S含0.1％的皂角苷的PBS；PBS-SB含1％w/v的BSA的PBS-S；细胞裂解液50mMTris-HCl，150mMNaCl，0.2g/LNaN3，1g/LSDS，5g/L脱氧胆酸钠；D-Hank’sNaCl 8.00g/L，KCl 0.40g/L，Na2HPO4-12H2O 0.12g/L，KH2PO40.06g/L，右旋葡萄糖(D-Glucose)1.00g/L，NaHCO30.35g/L；蛋白酶抑制剂每毫升中含有PMSF 100mM、Aprotinin 15μM、Leupeptin 100μM、Bestatin 100μM、Pepstain A 100μM、E-64 80μM溶解在DMSO中；二、肝癌细胞特异性内在化短肽的鉴定方法有以下四步，具体操作步骤第一步 细胞ELISA鉴定噬菌体单克隆与细胞的结合力选择生长状态良好的人肝癌细胞BEL-7404消化下来，记数后将细胞悬液，浓度调至5×105cells/ml，分别加入96孔细胞培养板，细胞板每孔加100μl细胞悬液，37℃细胞培养箱中过夜，使细胞贴壁，D-Hanks缓冲液清洗细胞，无血清培养基培养1小时，每孔加封阻液100μl，封阻液的配方为PB ST05中加入4％的脱脂奶粉，37℃封阻1小时，每孔用PBST05洗板，反复3次，每孔加噬菌体单克隆1010个，同样数量的野生型噬菌体作阴性对照，不加噬菌体克隆做空白对照，4℃温育2小时，同上洗板，每孔加兔抗噬菌体抗体100μl，兔抗噬菌体M13抗体用所述的封阻液以1∶1000的重量比稀释，37℃温育1.5小时；洗板，每孔再加HRP标记的羊抗兔IgG抗体100μl，羊抗兔酶标抗体用所述的封阻液以以1∶2500的重量比稀释，37℃温育1小时，洗板，每孔加OPD底物显色液，37℃显色10～15分钟，每孔加酶终止液2M H2SO450μl，终止显色，酶标仪490nm波长读数；第二步 竞争ELISA鉴定噬菌体单克隆与细胞的结合力取一瓶生长状态良好的BEL-7404肿瘤细胞，用胰酶消化下来，用PBS清洗几遍，加入适量的蛋白酶抑制剂后放入冰盒内作用1.5小时，使细胞充分裂解，裂解细胞获得的蛋白直接于4℃进行12000rpm高速离心1.5小时，获得的上清即为肿瘤细胞膜蛋白溶液，将抽提的膜蛋白以不同的稀释度1∶2，1∶4，1∶20，1∶50，1∶100，1∶200，4℃过夜包板，取生长状态良好的细胞转到96孔板内，在有膜蛋白的孔内加入噬菌体单克隆，每孔的加入量约为1010个与膜蛋白37℃孵育1小时，取上清加到有细胞的96孔板内，方法与第一步的操作完全相同；第三步 免疫荧光检测噬菌体肽的内在化在预先放置有盖玻片的24孔板中每孔加入105个细胞，过夜培养，用D-Hank’s清洗掉未贴壁的细胞，细胞和单克隆都预先与含100uM氯喹的培养基37℃预先孵育30分钟，将噬菌体单克隆加入孔内，37℃作用2小时，用冷的PBST05洗三次，每次5分钟，用含1％BSA和pH2.2的0.1μM甘氨酸-HCL洗2次，每次5分钟，再用冷的PBST05洗三次，每次5分钟，细胞用4％的多聚甲醛37℃固定15分钟，用PBS-S孵育15分钟，增加细胞的渗透性，用PBS-SB封阻15分钟，用含0.1％兔抗噬菌体M13 IgG的PBS-SB 37℃孵育1.5小时，PBST清洗4次，与FITC共轭结合的含羊抗兔抗体IgG的PBS-B以稀释37℃作用1小时，羊抗兔抗体IgG与PBS-B的重量比为1∶30，PBST清洗4次，用缓冲甘油封片，将玻片倒扣在玻璃板上，荧光显微镜检测；第四步流式细胞仪定量检测噬菌体肽的内在化待小瓶细胞长满，加入109个单克隆到培养瓶内，37℃作用2小时，同时设对照加M13，空白，原库，正常细胞，为阻止进一步内吞，培养瓶放冰上5分钟，倒掉上清，PBST清洗3次，TBST清洗3次，加入含枯草杆菌蛋白酶1.5mg/ml的TBS 1ml，与细胞孵育15分钟，降解细胞表面结合的噬菌体，用滴管将细胞吹打下来，得单细胞悬液，转到道夫管内，1000rpm离心7分钟，去上清，PBST清洗2次，加入4％多聚甲醛100μl，37℃固定15分钟，PBST清洗2次，加含3％BSA和0.1％皂素的PBS，37℃固定30分钟，PBST清洗2次，加入兔抗噬菌体M 13抗体IgG，37℃作用1.5小时，兔抗噬菌体M 13抗血清用所述的封阻液以1∶1000的重量比稀释，PBST清洗2次，加入FITC标记的羊抗兔IgG抗体，37℃作用1小时，FITC标记的羊抗兔IgG抗体与PBS-B的重量比为1∶30，PBST清洗2次，上流式细胞仪检测荧光强度。
全文摘要
本发明涉及肝癌细胞特异性内在化的短肽以及其体外筛选和鉴定，属肿瘤细胞特异性内在化短肽的筛选和鉴定的技术领域。以肝癌细胞BEL－7404作为筛选靶细胞，对噬菌体展示随机12肽库进行亲和淘选。经3轮淘选，随机挑选20个噬菌斑进行了扩增和测序，推导随机多肽的氨基酸序列。经细胞ELISA、免疫荧光、流式细胞术等方法进一步鉴定噬菌体克隆与肝癌细胞的结合力以及内在化的效果。通过对阳性克隆的测序和序列比较分析，得到4种不同的序列，都有良好的与肝癌细胞的结合力；筛选到的单克隆可内在化进入细胞。通过对噬菌体随机肽库的筛选，得到可与肝癌细胞BEL－7404结合和可内在化的噬菌体短肽，为肝癌的治疗提供进一步的理论基础。
文档编号C40B30/06GK101033251SQ200610148050
公开日2007年9月12日 申请日期2006年12月27日 优先权日2006年12月27日
发明者钱旻, 杜冰, 李晶, 汪磊 申请人:华东师范大学