一种在生物可降解锌表面构建无机微米花嵌合金属-有机复合纳米簇改性功能层的方法与流程

本发明属于生物医用材料表面改性技术领域，尤其涉及一种在生物可降解锌表面构建无机微米花嵌合金属-有机复合纳米簇改性功能层的方法。

背景技术：

锌作为第三代可降解金属，因适中的腐蚀速率及锌在人体中为重要的微量元素而广受关注。可降解锌合金在人体既不会像不锈钢腐蚀速率过慢，也不会像镁合金腐蚀速率过快，从而能够作为一种效果更好的医用可降解金属材料，解决铁基和镁基医用可降解金属材料所面临的问题。此外，在拥有可控腐蚀速率的同时，锌合金还具有良好的生物相容性。

但可降解锌基植入体降解释放过多锌离子造成周围组织和细胞损伤，腐蚀降解产物不稳定，骨整合性能不足等限制其应用。表面改性是解决这些问题的关键技术。然而，锌基金属的表面改性研究处于起步阶段，方法多是借鉴镁/铁改性手段，且都是单一涂层，难以同时兼顾腐蚀降解控制和生物功能性。并且，大多数表面改性方法使用的组分单一，形成的结构简单，在服役过程中达不到理想效果。

技术实现要素：

本发明的目的在于：针对上述现有技术中存在的单一涂层改性难以同时兼顾腐蚀降解控制和生物功能性的问题，提供一种在生物可降解锌表面构建无机微米花嵌合金属-有机复合纳米簇改性功能层的方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种在生物可降解锌表面构建无机微米花嵌合金属-有机复合纳米簇改性功能层的方法，包括以下步骤：

s1.将硝酸锌和有机双膦酸溶液混合，调节ph3.5-4.5，在35-45℃水浴加热反应10-15h；

s2.将s1反应后混合液过滤，弃去滤液，清洗，干燥，得到锌-有机双膦酸纳米颗粒；

s3.将s2所得锌-有机双膦酸纳米颗粒分散到溶剂中，调节ph3.5-4.5，制得锌-有机复合纳米簇悬浮液；

s4.打磨纯锌表面后，在超声条件下用无水乙醇清洗，干燥；

s5.将s4打磨清洗干燥后的锌置于无机磷酸锌溶液中，在35-45℃水浴加热反应0.5-2h，清洗，干燥，得到无机磷酸锌复合的锌；

s6.将s5所得无机磷酸锌复合的锌置于s3所得锌-有机复合纳米簇悬浮液中，在55-65℃水浴加热反应10-15h，清洗，干燥，即得。

本发明根据配位化学原理，首先使锌离子与有机双膦酸分子(本发明使用唑来膦酸分子)反应，锌离子与唑来膦酸分子中咪唑基上的n以及膦酸基团中的氧配位螯合，得到搭载单一有机双膦酸的金属有机复合物；接着，加入的hedp中膦酸基团的氧再与金属有机复合物的活性锌离子结合，得到同时包含hedp和za活化分子的金属-有机复合纳米簇。

金属-有机复合纳米簇表面的hedp与无机磷酸锌预处理层上的锌离子活性位点螯合配位作用以及纳米簇与磷酸锌层的物理吸附作用实现了纳米簇的成功嵌合。在嵌合过程中，hedp起到了一个“桥梁”的作用，将纳米簇和磷酸锌层结合在一起。

进一步地，s1中将15-25g/l六水合硝酸锌与1-3g/l有机双膦酸溶液按照体积比1:1混合。

进一步地，s1中将20g/l六水合硝酸锌与2g/l有机双膦酸溶液按照体积比1:1混合。

进一步地，有机双膦酸溶液为唑来膦酸溶液。

进一步地，s2、s5和s6的清洗和干燥具体为：依次用去离子水和无水乙醇清洗2-5次，然后在60℃下干燥20-30h。

进一步地，s2、s5和s6的清洗和干燥具体为：依次用去离子水和无水乙醇清洗3次，然后在60℃下干燥24h。

进一步地，s3中溶剂为浓度为2g/l的羟基乙叉二膦酸溶液。

进一步地，s3中制得的锌-有机复合纳米簇悬浮液浓度为1-1.5g/l；优选为1.2g/l。

进一步地，s4中用砂纸将纯锌打磨至2000#，然后超声清洗2-5次，每次5min，然后在60℃下干燥20-30h。

进一步地，s4中用砂纸将纯锌打磨至2000#，然后超声清洗3次，每次5min，然后在60℃下干燥24h。

进一步地，s5中无机磷酸锌溶液由10-15g/l六水合硝酸锌溶液、20-25g/l磷酸二氢钠溶液和8-12g/l四水合硝酸钙溶液按照体积比1:1:1混合制得。

进一步地，s5中无机磷酸锌溶液由13g/l六水合硝酸锌溶液、21.5g/l磷酸二氢钠溶液和10g/l四水合硝酸钙溶液按照体积比1:1:1混合制得。

采用上述的方法构建的表面无机微米花嵌合金属-有机复合纳米簇改性功能层的锌。

上述的表面无机微米花嵌合金属-有机复合纳米簇改性功能层的锌在制备医用植入材料方面的应用。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明构建的复合涂层兼顾腐蚀降解控制与促成骨功能化；一方面通过生物活性磷酸锌(znp)，生物活化分子羟基乙叉二膦酸(hedp)和金属有机复合纳米簇的共同作用，实现锌基底的腐蚀降解控制；另一方面，无机磷酸锌形成的生物活性微米花，能够诱导钙磷盐的沉积，促进成骨的作用；金属有机复合纳米簇中的生物活化分子hedp以及唑来膦酸(zoledronicacid，za)均属于双膦酸分子，对成骨细胞有很好的相容性，能促进成骨细胞的黏附与增殖；微米花和纳米簇这种多变的表面拓扑结构，使表面的亲水性增强，表面能增强，提高了表面生物活性，更有利于生理环境中蛋白质吸附，细胞附着、铺展与生长。综上，在多组分和多尺度结构的协同作用下，该发明制备的改性功能层实现了兼顾腐蚀降解控制与提高生物功能性的目的。

本发明的金属-有机复合纳米簇的合成方法，合成了搭载两种生物活性膦酸分子的金属-有机复合纳米簇，其中两种生物活性分子均为具有促成骨黏附及增殖的作用羟基乙叉二膦酸和唑来膦酸，因而使得本发明产品具备促成骨黏附及增殖作用；

本发明构建了多组分改性功能层，包含具有诱导成骨功能的无机磷酸锌以及良好骨相容性的hedp和za分子，这进一步使得本发明产品具有诱导成骨功能和良好的骨相容性；

本发明构建了多尺度结构改性功能层，包含无机微米花以及金属-有机复合纳米簇，造成了表面多变的拓扑结构，提高了表面亲水性及表面能，增强了表面生物活性；

本发明的方法使金属有机纳米簇在服役过程中能缓慢释放双膦酸分子及hedp分子，以达到促进成骨细胞活性的作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为表面改性前后sem照片；

图2为改性功能层及构建所用组分的红外光谱图；

图3为改性前后的电化学表征结果图；

图4为改性前后水接触角及表面能测试图；

图5为改性前后表面钙磷盐沉积结果图；

图6为改性前后成骨细胞直接培养荧光染色图；

图7为成骨细胞直接培养黏附细胞数统计图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本发明较佳的实施例提供一种在生物可降解锌表面构建无机微米花嵌合金属-有机复合纳米簇改性功能层的方法，具体步骤如下：

a、金属-有机复合纳米簇的制备：将20g/lzn(no3)2˙6h2o和2g/lza溶液，利用naoh溶液调节ph至4，在40℃水浴锅中充分搅拌反应12h，过滤得到白色固体，依次用去离子水和无水乙醇清洗3次，然后在60℃下干燥24h。配制2g/l，ph＝4的hedp溶液，将上述得到干燥白色固体超声分散到此溶液中制成1.2g/l金属-有机复合纳米簇悬浊液，备用。

b、将纯锌经砂纸打磨至2000#，在超声条件下用无水乙醇清洗3次，每次5min，干燥备用。

c、将10g/lca(no3)2˙4h2o,13g/lzn(no3)2˙6h2o,21.5g/lnah2po4混合，调节ph至3.1，将上述打磨好的锌片置于溶液中，在40℃水浴锅中反应1h，依次用去离子水和无水乙醇清洗3次，然后在60℃下干燥24h备用。

d、将步骤c预处理锌片加入步骤a的悬浊液中，置于60℃水浴锅中反应12h，依次用去离子水和无水乙醇清洗3次，然后在60℃下干燥24h，即得，记为znp@hedp&moc。对所得样品进行sem观测其表面形貌。

制备的涂层表面形貌如图1所示。可以看到，打磨后的锌片上为整齐平行的划痕。经本方法进行改性后，涂层整体呈现微米级花状结构。其中金属-有机复合纳米簇在花瓣周围均匀分布，呈方块状。

实施例2

本发明较佳的实施例提供一种在生物可降解锌表面构建无机微米花嵌合金属-有机复合纳米簇改性功能层的方法，具体步骤如下：

a、金属-有机复合纳米簇的制备：将18g/lzn(no3)2˙6h2o和1.5g/lza溶液，利用naoh溶液调节ph至4，在40℃水浴锅中充分搅拌反应12h，过滤得到白色固体，依次用去离子水和无水乙醇清洗3次，然后在60℃下干燥24h。配制2g/l，ph＝4的hedp溶液，将上述得到干燥白色固体超声分散到此溶液中制成1.3g/l金属-有机复合纳米簇悬浊液，备用。

b、将纯锌经砂纸打磨至2000#，在超声条件下用无水乙醇清洗3次，每次5min，干燥备用。

c、将9g/lca(no3)2˙4h2o,11g/lzn(no3)2˙6h2o,20.5g/lnah2po4混合，调节ph至3.1，将上述打磨好的锌片置于溶液中，在40℃水浴锅中反应1h，依次用去离子水和无水乙醇清洗3次，然后在60℃下干燥24h备用。

d、将步骤c预处理锌片加入步骤a的悬浊液中，置于60℃水浴锅中反应12h，依次用去离子水和无水乙醇清洗3次，然后在60℃下干燥24h，即得。

实施例3

本发明较佳的实施例提供一种在生物可降解锌表面构建无机微米花嵌合金属-有机复合纳米簇改性功能层的方法，具体步骤如下：

a、金属-有机复合纳米簇的制备：将23g/lzn(no3)2˙6h2o和2.5g/lza溶液，利用naoh溶液调节ph至4，在40℃水浴锅中充分搅拌反应12h，过滤得到白色固体，依次用去离子水和无水乙醇清洗3次，然后在60℃下干燥24h。配制2g/l，ph＝4的hedp溶液，将上述得到干燥白色固体超声分散到此溶液中制成1.1g/l金属-有机复合纳米簇悬浊液，备用。

b、将纯锌经砂纸打磨至2000#，在超声条件下用无水乙醇清洗3次，每次5min，干燥备用。

c、将12g/lca(no3)2˙4h2o,14g/lzn(no3)2˙6h2o,23g/lnah2po4混合，调节ph至3.1，将上述打磨好的锌片置于溶液中，在40℃水浴锅中反应1h，依次用去离子水和无水乙醇清洗3次，然后在60℃下干燥24h备用。

d、将步骤c预处理锌片加入步骤a的悬浊液中，置于60℃水浴锅中反应12h，依次用去离子水和无水乙醇清洗3次，然后在60℃下干燥24h，即得。

实验例1

取涂层表面粉末，锌-唑来膦酸金属有机复合物(moc)，za分子粉末，通过压片法进行红外光谱测试。

红外光谱测试结果如图2。在1315cm^-1处，za、moc、及涂层均出现了c-n的特征峰，来源于za中的咪唑基，表明za存在于锌-唑来膦酸纳米簇及涂层中，进而表明纳米簇成功嵌合到涂层表面。各样品均在1100cm^-1和1000cm^-1处出现p04^3-特征峰，但锌-唑来膦酸纳米簇峰强明显低于za，这应该是zn与za中膦酸基团中羟基氧发生配位所致。

实验例2

将打磨好的锌片及实施例1制得样品用导电银胶接上导线，用硅橡胶进行封样，使涂层面露出。将样品放入以sbf为电解液的三通管中，其中以饱和甘汞电极为参比电极，金属铂为对电极，样品为工作电极，利用im6电化学工作站对样品进行动电位极化曲线测试。样品极化曲线如图3所示。可以看出，涂层改性后样品自腐蚀电位ecorr更正，自腐蚀电流icorr减小，表明涂层可以减缓锌基底腐蚀。

实验例3

a、分别在纯锌和实施例1制得样品表面滴加5μlro水，拍照，测试水接触角；

b、分别在纯锌和实施例1制得样品表面滴加1μl二碘甲烷，测试接触角。

测得的水接触角及表面能如图4所示。可以看出，改性后水接触角为0，这是由于改性功能层表面组分均含亲水膦酸基团；表面能相比于锌明显上升，这是由于表面微米-纳米的多尺度结构使得表面比表面积增加，进而表面能增强，表面生物活性增强。

实验例4

配制饱和磷酸钙溶液：2.32mmnh4h2po4,3.87mmolcacl2,50mmnacl。在25℃条件混合溶液，用50mm调节ph至7.2±0.1。

将实施例1制得样品浸入饱和磷酸钙溶液中10s后拿出，至于80℃真空干燥箱30min进行干燥。重复上述步骤10次后，用蒸馏水清洗样品3次后放入饱和磷酸钙溶液中，在37.5℃条件下静置10h，清洗干燥后备用。

对钙磷盐沉积后样品进行扫描电镜观察，结果如图5。可以看出改性功能层表面几乎全被钙磷盐覆盖，且更加密集、紧实。这主要是改性功能层表面的多组分影响，无机磷酸锌及金属-有机纳米簇表面的hedp活性分子均为cap的沉积提供了充足的活性位点。

实验例5

评价制得涂层得生物相容性。

本实验使用细胞为小鼠前成骨细胞(mc3t3-e1)，购于武汉塞维尔科技有限公司。细胞培养基使用添加10％fbs的dmem(赛默飞世尔仪器有限公司，苏州)。在细胞培养至单层铺满80％左右，即可进行接种实验，具体步骤如下：

(1)实验准备：将实验所需耗材及样品进行灭菌(耗材采用高温高压灭菌，样品进行紫外辐照，正反面各30min)。

(2)在超净工作台，取出细胞单层铺满80％以上的细胞培养瓶，倒去培养基，用生理盐水清洗三次，用吸管吸净后将1ml胰酶均匀滴加至培养瓶中进行消化。待细胞变圆发亮后，加入5ml培养基吹打，防止细胞团聚。随后取出细胞悬液在1200r/min下离心5min，倒去上清液，加入新的培养基得到细胞密度为10000cell/ml的细胞悬液。

(3)接种，用移液枪将细胞悬液滴加到样品表面，每孔1ml，然后放入37.5℃，5％co2的孵箱中培养1，3，5天。

本实验利用鬼笔环肽进行细胞骨架染色，以观察细胞的生长形态；用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)进行细胞核染色观察样品表面细胞黏附数量，染色步骤如下：

1)固定。吸取培养板中的培养基，用pbs清洗3次，加入2.5％戊二醛固定12h；

2)细胞骨架染色。吸出戊二醛固定液，用pbs清洗3遍，加入triton溶液浸泡10min后，再用pbs清洗3次。接着，加入5％bsa溶液浸泡样品60min后清洗3次。最后，吹干样品表面，在避光条件下滴加60μl鬼笔环肽溶液在4℃条件放置12h；

3)细胞核染色。在避光条件下，将样品浸泡在dapi溶液中10s左右即可。

4)通过荧光显微镜观察细胞黏附数量及状态。

成骨细胞直接培养结果如图6-7。由荧光图片可以看出，未改性的纯锌表面细胞培养1天后即发生皱缩死亡，且黏附细胞数量极少，第3、5天细胞直接发生破裂死亡。经过本方法进行表面改性后，培养1，3，5天改性功能层表面的细胞均明显多于纯锌，且细胞第一天即在样品表面展现良好的铺展状态，这是由于表面多尺度结构增强了表面能，进一步增强了表面生物活性。在培养的第三天和第五天，细胞密度明显增加，表明在表面多组分---无机磷酸锌、hedp及za活化分子的共同作用下，明显促进了成骨细胞增殖与生长。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。