一种铂纳米笼免疫探针及其制备方法和在制备电化学免疫传感器中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种贵金属纳米颗粒及其制备方法和在制备免疫探针中的应用，尤其 涉及一种笛纳米笼及其制备方法和在制备免疫探针及电化学免疫传感器中的应用。
【背景技术】
[0002] 癌症是一种致命的疾病，每年，全球范围内因癌症死亡的人数达700万人，我国也 有100万人因此失去生命。癌症患者存活的可能性，很大程度上依赖于癌症的发现时间。 癌症的早期发现和治疗，是癌症患者存活的关键。癌症标记物是癌症发生、存在和发展的标 志（Magdalena Swierczewska, Gang Liu, Seulki Lee,Xiaoyuan Chen,High-sensitivity nanosensors for biomarker detection, Chem. Soc. Rev. , 2011, 41, 2641-2655.)。因 此，癌症标志物的灵敏检测是癌症的早期发现和治疗的关键因素。目前，对癌症标志物 的检测有酶联免疫法、比色法、英光法和表面等离子共振等方法，但送些方法往往存在耗 时、设备昂贵、过程繁琐和灵敏度低等问题。综合考虑上述因素，电化学方法由于具有操 作简单，成本低、灵敏度高等特点，而成为检测癌症标志物最理想的方法之一（Aicheng Qien, San曲amitra Qiatterjee, Qiem. Soc. Rev.,2013, 42, 5425-5438.)。电化学实验是依 靠检测固定在电极上的电化学物质来给出信号的。一般使用夹必型电化学方法检测癌症标 记的工作原理如下；（1)利用电活性物质来标记示踪抗体；(2)通过示踪抗体识别分析物；
[3]利用电活性物质提供的信号确定固定在电极表面的目标生物标记物的浓度。然而，目前 的电化学检测主要集中在单一的肿瘤标志物的检测，但是由于单一一种癌症标志物与癌症 之间的灵敏性和特异性很差，因此没有一种癌症标志物能成为"理想"的癌症筛查工具。与 传统的单祀标免疫分析相比，多祀标免疫分析有着分析时间短、样品体积减小、检测效率提 高、成本降低等优点，因此多祀标的同时检测对于癌症的精确诊断也具有很重要的意义。
[0003] 对于多祀标免疫分析，首要问题是如何将不同的电信号区分开来W及在此基础上 得到较大的电流。在纳米颗粒扩增电化学信号增强电流的过程中，贵金属笛纳米颗粒由于 具有良好的导电性，易于负载抗体W及对过氧化氨的催化性质能够进一步增强电流等优 点。因此在电化学免疫传感器的应用中可W作为良好的载体。
[0004] 本发明通过笛纳米笼为载体，通过先负载抗体，后连接信号物质的方式制备出笛 纳米笼免疫探针。由于笛的价格昂贵，因此纳米笼型结构能够降低了成本，并且笛的催化性 能受其形貌的影响比较大，而立方体形的纳米笼结构比球形的笛颗粒对过氧化氨具有更好 的催化效果，因此其信号扩增的效果更加明显。由于贵金属纳米颗粒对带有氨基、琉基等功 能基的电信号物质有优秀的结合能力，因此，使用笛纳米笼连接峰电位能区分的电信号物 质能够实现两种癌症标记物甚至多种癌症标记物的同时检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一种立方体形的笛纳米笼状颗粒及其制备方法；
[0006] 本发明的目的之二在于提供一种由所述新型笛纳米笼状颗粒制备得到的笛纳米 笼免疫探针；
[0007] 本发明的目的之H在于提供一种由笛纳米笼免疫探针制备得到的电化学免疫传 感器。
[0008] 本发明的的上述目的是通过W下技术手段实现的：
[0009] 本发明的一种立方体形的笛纳米笼状颗粒，其特征在于通过W下方法制备得到：
[0010] (1)将十六烷基H甲基漠化倭（CTAB)的水溶液加热至80-12(TC后，加入氯铅酸水 溶液，然后加入抗坏血酸，反应IO-SOmin后，离必，沉淀用去离子水清洗，然后分散在去离 子水中；
[0011] 似将步骤（1)得到的溶液和CTAB的水溶液混合，加热至80-100。将氯笛酸钟 水溶液加入其中，揽拌10-20小时，产物离必，沉淀去离子水清洗，即得。
[0012] 在本发明中，优选的，步骤（1)所述的十六烷基H甲基漠化倭（CTAB)的水溶液 的浓度为10-25mM，所加入的氯铅酸溶液的浓度为I-IOmM,体积为十六烷基H甲基漠化倭 (CTAB)的水溶液体积的1/20-1/30,所加入的抗坏血酸与氯铅酸的摩尔比为1:0. 1-1。
[0013] 在本发明中，优选的，步骤（2)所加入的CTAB水溶液的浓度为6-25mM，所加入的量 为步骤（1)得到的溶液体积的2-5倍，所加入的氯笛酸钟水溶液的浓度为0.I-IOmM,所加入 的量为步骤（1)得到的溶液体积的1/5-1/2。
[0014] 在本发明中，首先通过步骤（1)得到了铅纳米立方体颗粒，然后通过步骤（2)将铅 纳米立方体颗粒中的铅原子置换为笛原子，从而得到了一种立方体形的纳米笼结构。本发 明方法简单，且制备得到的笛纳米笼状颗粒尺寸均一，实验证明，立方体形的纳米笼结构相 较于球形的笛颗粒对过氧化氨具有更好的催化效果，因此其信号扩增的效果更加明显。因 此使用该笛纳米笼制备的免疫探针制备电化学免疫传感器信号强且稳定、重现性好，且通 过标记峰电位能够区分的电信号物质实现了双祀标的同时检测。
[0015] 因此，进一步的，本发明还提出了所述的笛纳米笼状颗粒在制备笛纳米笼免疫探 针中的应用。
[0016] 本发明的一种笛纳米笼免疫探针，其特征在于通过W下方法制备得到：
[0017] (1)将W上任一项所述的笛纳米笼状颗粒用磯酸缓冲液洗涂、分散；
[0018] (2)室温下，将笛纳米笼状颗粒与抗体混合，离必除去上清液；
[0019] (3)沉淀用磯酸缓冲液洗涂、分散后与电信号物质混合，离必除去上清液；
[0020] (4)沉淀用磯酸缓冲液洗涂，得到的笛纳米笼免疫探针分散到磯酸缓冲液中，于 4°C储存。
[002。 在本发明中，优选的，步骤（1)、似或（4)中所用磯酸缓冲液为0.1M，抑值为 5. 0-8. 0,且含有0.IMKCl的磯酸缓冲液。
[0022] 在本发明中，优选的，所述的电信号物质包括硫堇和琉基二茂铁。
[0023] 进一步的，本发明还提出了所述的笛纳米笼免疫探针在制备电化学免疫传感器中 的应用，优选的，按照本发明所述的方法分别制备偶联两种或多种抗体及峰电位能区分的 两种或多种电信号物质的笛纳米笼免疫探针，将制得的两种或多种笛纳米笼探针固定在电 极的表面，得到能够同时对两种或多种标记物进行检测的电化学免疫传感器。
[0024] 在本发明的具体实施例中，作为范例，给出了一种能够同时实现对肿瘤标志物CEA 和AFP进行检测的电化学免疫传感器，其是通过W下方法制备得到：
[0025] (1)将本发明中所述的笛纳米笼状颗粒用磯酸缓冲液洗涂、分散；
[002引 似室温下，将笛纳米笼状颗粒分别与CEA和AFP抗体混合，离必除去上清液；
[0027] (3)沉淀用PBS洗涂、分散后与分别与硫堇和琉基二茂铁混合，离必除去上清液；
[0028] (4)沉淀用PBS洗涂，得到的笛纳米笼免疫探针分散到磯酸缓冲液中，制得的笛纳 米笼免疫探针于4°C储存；
[0029] (5)通过免疫反应将制得的两种笛纳米笼探针固定在电极的表面，即得。
[0030] 本发明通过将立方体形的笛纳米笼状颗粒分别负载甲胎蛋白（AF巧和癌胚抗原 (CEA)的抗体后，通过分别标记琉基二茂铁和硫堇，制备了两种笛纳米笼免疫探针，通过免 疫反应将制得的两种笛纳米笼探针固定在电极的表面从而得到了一种电化学免疫传感器， 使用该电化学免疫传感器可W实现对癌胚抗原和甲胎蛋白的同时检测，并且具有较低的检 出限、较宽的检测范围和良好的重现性。
[0031] 实验证明；利用笛纳米笼电化学免疫探针同时检测不同浓度的癌胚抗原（CEA)和 甲胎蛋白（AFP)，其检测线性范围分别为0. 05-200ng/mL和0. 03-100ng/mL。检出限分别为 0. 014ng/mL和 0.OlOng/mL。
[0032] 因此，进