本发明属于双孢蘑菇栽培技术领域，具体涉及一种利用双孢蘑菇堆料水浸提液培养双孢蘑菇菌种的方法。
背景技术：
土壤是微生物的大本营，土壤中含有在实验室条件下微生物生长代谢所缺乏的特异因子，因此，通过原位培养的方法，可使“不能培养的微生物”在实验室条件下也能生长。在培养基中添加土壤水溶性提取物，能够提高细菌和放线菌已知基因的表达量，并激活沉默的基因。然而，土壤浸提液对真菌的影响，还未见报道。
双孢蘑菇（Agaricus bisporus）是世界上栽培最广泛、生产量和消费量最大的食用菌，产量约占世界食用菌总产量的3/4。双孢蘑菇母种培养基常用的是马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和加富PDA。栽培种有固体菌种和液体菌种，固体菌种培养基常用谷粒如麦粒或小米粒，液体菌种培养基常用的有加富马铃薯葡萄糖培养基（加富PD）、蔗糖蛋白胨培养基和麦芽浸膏培养基。采用这些培养基制备双孢蘑菇菌种时，菌丝生长慢，长势差，菌种生产周期长。
双孢蘑菇栽培料堆料是用作物秸秆（麦秸、稻秸或玉米秸）和畜禽粪便（鸡粪、牛粪或马粪）等经堆制发酵而成，堆制发酵过程往往经历二次发酵。经过二次发酵的堆料即可接种栽培双孢蘑菇。双孢蘑菇栽培料堆料富含纤维素、半纤维素、木质素、含氮化合物和矿质元素，以及微生物合成的酶和抗生素等。在制备双孢蘑菇菌种的培养基中添加堆料水浸提液，尚未见报道。
技术实现要素：
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种利用双孢蘑菇堆料水浸提液培养双孢蘑菇菌种的方法，其在培养基中添加双孢蘑菇堆料水浸提液，可促进双孢蘑菇菌丝的生长，缩短双孢蘑菇固体菌种和液体菌种的生产周期，提高双孢蘑菇生产的经济效益和社会效益。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用双孢蘑菇堆料水浸提液培养双孢蘑菇菌种的方法，具体为：制备平板菌种选用的固体培养基、制备摇瓶菌种以及液体菌种选用的液体培养基中均含有双孢蘑菇堆料水浸提液。双孢蘑菇堆料水浸提液的添加量为培养基体积的20%，其可以为双孢蘑菇菌丝生长和基因表达提供特异因子。
具体的，所述固体培养基组成为：马铃薯200g、红糖12g、葡萄糖9g、蛋白胨2g、酵母膏1g、KH2PO4 2g、MgSO4∙ 7H2O 1g、VB1 0.01g、琼脂20g、蒸馏水800ml，双孢蘑菇堆料水浸提液200 ml，pH自然；所述液体培养基组成为：马铃薯200g、红糖12g、葡萄糖9g、蛋白胨2g、酵母膏1g、KH2PO4 2g、MgSO4∙ 7H2O 1g、VB1 0.01g、蒸馏水800ml，双孢蘑菇堆料水浸提液200 ml，pH自然。
具体的，所述双孢蘑菇堆料水浸提液经下述步骤制备获得：将经过二次发酵后的双孢蘑菇栽培料堆料置于50-80℃烘箱中烘至恒重，粉碎过40-80目筛，再与堆料重量3-6倍的双蒸水混合后，置于恒温摇床中于23-28℃、150-200 r/min条件下浸提1-3h，离心，取上清液即为双孢蘑菇堆料水浸提液。
双孢蘑菇栽培料的配方可选用本领域的常规配方，并采用本领域常规方法经过二次发酵后获得双孢蘑菇栽培料堆料。如，可参照中国专利申请“一种双孢蘑菇生长菌剂及利用该菌剂的双孢蘑菇栽培方法”（申请号CN201410845464.2）中关于栽培料制备过程的相关步骤进行，此为本领域共知常识，故此不再赘述。
上述利用双孢蘑菇堆料水浸提液培养双孢蘑菇菌种的方法，具体包括如下步骤：
1）制备平板菌种：每平板倒入固体培养基15±5ml，凝固后，在平板中央接种直径0.6±0.2 cm的活化菌块，23-28℃恒温培养至菌丝发满平板，获得平板菌种；
2）制备摇瓶菌种；250 ml三角瓶装入100 ml液体培养基，将平板菌种接种到液体培养基中，23-28℃下先静置24±12 h，然后振荡培养（转速180r/min）7-10 d，此时菌丝生长至旺盛生长（对数生长）的中后期，获得摇瓶菌种；
3）制备液体菌种：250 ml三角瓶装入100 ml液体培养基，然后按10%的接种量接入摇瓶菌种，23-28℃振荡培养（转速180r/min）9-12d，此时菌丝球生物量达到最高，可停止培养，即得到液体菌种。该液体菌种可接种至二次发酵后的双孢蘑菇栽培料堆料中，待发满菌丝后，覆土，常规管理出菇和采收即可。
和现有技术相比，本发明的有益效果：
双孢蘑菇栽培料堆料材料易得，其不仅营养丰富，还含有许多未知的生长促进因子，在培养基中添加双孢蘑菇堆料水浸提液，能够促进双孢蘑菇菌丝的生长和基因表达，显著提高菌丝生长速度和生长量，缩短固体菌种和液体菌种的生产周期，提高双孢蘑菇生产的经济效益和社会效益。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
下述实施例中，所用的二次发酵后的双孢蘑菇栽培料堆料可经下述步骤获得：
1）建堆
栽培料配方为：麦秸与干鸡粪按质量比为5：1，为保证栽培料中养分充足，同时添加占栽培料质量2%的过磷酸钙、饼肥、碳酸钙、尿素、复合肥（以质量比计，过磷酸钙︰饼肥︰碳酸钙︰尿素︰复合肥=1︰2︰1︰1︰1）作为辅料以增加营养，同时添加适量石灰以调节栽培料pH值为7.5。根据栽培料配方，堆制成高1.5-1.8 m、长宽不限的大堆。
栽培料配制过程中需要注意的是：鸡粪使用前要晒干、粉碎，过1厘米规格的筛子。麦秸要求干燥且无霉变，最好是将其切成18~20cm的小段或者进行碾压，以使茎秆变软有利于吸水和发酵。建堆前，干鸡粪预堆7-10天，加水至含水量40-50%，翻堆2-3次；麦秸先预湿2 d。
建堆时，在干净整洁的水泥地面上先铺1层30 cm厚的草料，堆宽2.5 m，长10 m。在草料上面铺1层粪，厚度以盖没住草料层为宜，粪上再铺1层30 cm厚的草料，然后再撒1层粪，依此顺序向上堆叠，当料堆高度达1.6 m时，在最上面盖1层粪，并在上层浇入水。建堆时，过磷酸钙、饼肥、碳酸钙、尿素、复合肥一般在堆料中间的4层时加入（上下两头不加），这样有利于栽培料的充分发酵和吸收。堆料时，应尽量使料堆保持垂直、整齐，以利于保持堆内温度，促进有益微生物的活动。所堆料堆的顶部做成弧形，同时在堆顶覆盖草帘以防日晒。如果遇到下雨天气，应及时盖一层薄膜，以防止雨水淋入料堆内，雨后及时揭膜通气。
2）第一次发酵
依据天气和堆温情况，第一次发酵需13-15天，期间翻堆4次。翻堆的具体时间取决于堆料的温度变化，当料温升到70℃以上不再上升、且保持1～2 d后有下降的趋势时，立即进行翻堆，各次的时间间隔分别为7 d、6 d、5 d。
第一次翻堆时，可补加适量复合肥、过磷酸钙，并补足水分，料堆的干湿度以单手紧握料时，手指间能挤出10滴水为度。以后每次翻堆逐渐减少补加的水分，到第四次翻堆时，料堆的干湿度以单手紧握料时，手指间能挤出1-2滴水为宜。第二次翻堆时加入适量石膏粉和过磷酸钙且适当补水。第三次翻堆后调节pH为7.2～7.8，第四次翻堆后再堆制三天即可散堆入棚。
3）第二次发酵
第一次发酵结束后，将堆料铺于菇棚床架上，堆料厚20±5 cm进行第二次发酵。具体为：保持料温60±5℃条件下，向菇棚通入蒸汽20~24 h；然后通风降温，当料温降到52±5℃时，再维持4~6 d进一步腐化发酵。发酵结束后，开窗通风降至室温即得二次发酵后的双孢蘑菇栽培料堆料。
1 材料与方法
1.1 菌种
双孢蘑菇AS2796，购自河南省农业科学院食用菌工程中心。
1.2 双孢蘑菇堆料水浸提液
所述双孢蘑菇堆料水浸提液经下述步骤制备获得：将上述经过二次发酵后的双孢蘑菇栽培料堆料置于60℃烘箱中烘至恒重，粉碎后过60目筛，再与堆料重量4倍的双蒸水混合后，置于恒温摇床中于25℃、180 r/min条件下浸提2h，离心（5000xg离心20min），取上清液即为双孢蘑菇堆料水浸提液。
双孢蘑菇堆料水浸提液通过孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤，即制得过滤除菌双孢蘑菇堆料水浸提液。
1.3 固体培养基制备
加富PDA：马铃薯200g、红糖12g、葡萄糖9g、蛋白胨2g、酵母膏1g、KH2PO4 2g、MgSO4∙ 7H2O 1g、VB1 0.01g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，pH自然。配制方法如下：
将马铃薯去皮，去芽眼，切成小块放入锅中，加入800ml蒸馏水，煮沸20~30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用8层纱布过滤，取滤汁，加入红糖、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4∙ 7H2O、VB1和琼脂，继续加热至溶；用蒸馏水定容至1000 ml。121℃、30min灭菌。
加富PDA+高温灭菌堆料水浸提液：马铃薯200g、红糖12g、葡萄糖9g、蛋白胨2g、酵母膏1g、KH2PO4 2g、MgSO4∙ 7H2O 1g、VB1 0.01g、琼脂20g、蒸馏水800ml，双孢蘑菇堆料水浸提液200 ml，pH自然。配制方法如下：
马铃薯去皮，去芽眼，切成小块放入锅中，加入600 ml蒸馏水，煮沸20~30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用8层纱布过滤，取滤汁，加入红糖、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4∙ 7H2O、VB1和琼脂，继续加热至溶；先用蒸馏水定容至800 ml，再加入双孢蘑菇堆料水浸提液200 ml；121℃、30min灭菌。
加富PDA+过滤除菌堆料水浸提液：马铃薯200g、红糖12g、葡萄糖9g、蛋白胨2g、酵母膏1g、KH2PO4 2g、MgSO4∙ 7H2O 1g、VB1 0.01g、琼脂20g、蒸馏水800 ml，过滤除菌双孢蘑菇堆料水浸提液200 ml，pH自然。配制方法如下：
马铃薯去皮，去芽眼，切成小块放入锅中，加入600 ml蒸馏水，煮沸20~30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用8层纱布过滤，取滤汁，加入红糖、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4∙ 7H2O、VB1和琼脂，继续加热至溶；先用蒸馏水定容至800 ml，121℃、30min灭菌。使用前再加入过滤除菌双孢蘑菇堆料水浸提液200 ml，混匀。
1.4 液体培养基制备
加富PD：马铃薯200g、红糖12g、葡萄糖9g、蛋白胨2g、酵母膏1g、KH2PO4 2g、MgSO4∙ 7H2O 1g、VB1 0.01g、蒸馏水1000ml，pH自然。配制方法同加富PDA。
加富PD+高温灭菌堆料水浸提液：马铃薯200g、红糖12g、葡萄糖9g、蛋白胨2g、酵母膏1g、KH2PO4 2g、MgSO4∙ 7H2O 1g、VB1 0.01g、蒸馏水800ml，双孢蘑菇堆料水浸提液200 ml，pH自然。配制方法同加富PDA+高温灭菌堆料水浸提液。
加富PD+过滤除菌堆料水浸提液：马铃薯200g、红糖12g、葡萄糖9g、蛋白胨2g、酵母膏1g、KH2PO4 2g、MgSO4∙ 7H2O 1g、VB1 0.01g、蒸馏水800 ml，过滤除菌双孢蘑菇堆料水浸提液200 ml，pH自然。配制方法同加富PDA+过滤除菌堆料水浸提液。
蔗糖蛋白胨培养基：蔗糖30g、蛋白胨10g、KH2PO43g、MgSO4∙ 7H2O 3g、蒸馏水1000ml。
麦芽汁培养基：麦芽浸膏20g、蒸馏水1000ml，pH7.0。
1.5 平板培养
菌种是双孢蘑菇AS2796，购自河南省农业科学院食用菌工程中心。
制备平板菌种：每平板倒入固体培养基15 ml，凝固后，在平板中央接种直径为0.6 cm的活化菌块，每处理重复5个平板，25℃恒温培养至菌丝发满平板，获得平板菌种。
1.6 液体培养
制备摇瓶菌种；250 ml三角瓶装入100 ml液体培养基，将平板菌种用直径0.6 cm的打孔器分割后，取5小块接种到液体培养基中，25℃下先静置24 h，然后25℃、转速180 r/min振荡培养8 d，获得摇瓶菌种。
制备液体菌种：250 ml三角瓶装液体培养基100 ml，按10%的接种量接入培养好的摇瓶菌种。25℃、转速180 r/min，振荡培养10 d。培养结束，测定菌丝生物量、菌丝球密度及菌丝球直径。每个处理重复4个摇瓶。
因本发明主要侧重于考察在制备平板菌种、摇瓶菌种以及液体菌种的培养基中添加双孢蘑菇堆料水浸提液对培养双孢蘑菇菌种的影响，并不涉及后续的栽培，因此并未给出后续的栽培试验数据。
菌丝生物量的测定方法：培养结束后，培养液抽滤，抽滤过程中菌丝体用蒸馏水洗涤多次，将菌丝体于60℃干燥箱中烘至恒重，称量，计算1 ml培养液中菌丝的干重。
菌丝球直径的测定方法：培养结束后，取10 ml培养液于培养皿中，使培养液均匀分散，随机挑取菌丝球20个，成直线排列，测其总长度，重复3 次，取平均值。
菌丝球密度的测定方法：培养结束后，取15ml的培养液，按比例在量筒中加水稀释至50 ml，摇匀后取10 ml，在直径9 cm的培养皿中摊匀，培养皿下垫黑白相间的格纸，用方格计数法计数。
2结果与分析
2.1 平板培养结果
在加富PDA中添加20%（v/v）的双孢蘑菇堆料水浸提液，双孢蘑菇堆料水浸提液不论是高温灭菌，还是过滤除菌，双孢蘑菇菌丝的生长速度均显著高于加富PDA，分别为19.49%和47.76%（p ＜0.01），双孢蘑菇堆料水浸提液过滤除菌后添加于加富PDA中，菌丝的生长速度显著高于堆料水浸提液高温灭菌处理14.76%（p ＜0.05）（表1）。
表1 在平板固体培养基中双孢蘑菇菌丝的生长速度
同列数据不同大写英文字母表示差异极显著（p ＜0.01），
不同小写字母表示差异显著（p ＜ 0.05）。
2.2 液体培养结果
在加富PD中添加20%（v/v）的双孢蘑菇堆料水浸提液，双孢蘑菇堆料水浸提液不论是高温灭菌，还是过滤除菌，双孢蘑菇菌丝生物量显著高于其它三种液体培养基（p ＜0.01）。加富PD+高温灭菌堆料水浸提液的生物量分别比加富PDA、蔗糖蛋白胨培养基和麦芽汁培养基高62.88%、179.01%和224.01%。加富PD+过滤除菌堆料水浸提液的生物量分别比加富PD、蔗糖蛋白胨培养基和麦芽汁培养基高82.16%、212.34%和262.36%。两种均添加双孢蘑菇堆料水浸提液的培养基相比，过滤除菌处理显著高于高温灭菌处理10.58%（p ＜0.01），详见表2。
不同液体培养基摇瓶培养双孢蘑菇，加富PD培养基菌球直径最小，而加富PD+过滤除菌堆料水浸提液培养基菌球直径最大。菌球密度最大的是麦芽汁培养基，加富PD+过滤除菌堆料水浸提液培养基菌球密度最小，详见表2。
表2 液体培养基摇瓶培养双孢蘑菇菌丝的生物量、菌球直径及密度
同列数据不同大写英文字母表示差异极显著（p ＜0.01）。
3 结论
在加富马铃薯葡萄糖培养基中添加20%（v/v）双孢蘑菇堆料水浸提液，可显著提高菌丝生长速度和菌丝生物量，双孢蘑菇堆料水浸提液的过滤除菌处理效果显著优于高温灭菌处理。在加富马铃薯葡萄糖培养基中添加20%（v/v）的过滤除菌堆料水浸提液，平板培养时菌丝生长速度比加富马铃薯葡萄糖培养基提高47.76%。摇瓶培养时，菌丝生物量比加富马铃薯葡萄糖培养基提高82.16%。在培养基中添加双孢蘑菇堆料水浸提液，还有利于菌种接种栽培料后迅速适应环境，快速定殖萌发。