一种功能化离子液体修饰的碳纳米管及其固定化脂肪酶的方法
【专利摘要】本发明提供一种功能化离子液体修饰的碳纳米管及其固定化脂肪酶的方法。本发明通过在碳纳米管表面分别引入带有烷基、羧基、氨基、羟基等官能团的功能化离子液体，与酶分子氨基酸残基发生静电、氢键、疏水、共价等作用，增强载体与酶的结合力，改变酶所处的微环境，从而改善固定化酶的催化性能。本发明将功能性离子液体修饰碳纳米管用于脂肪酶的固定化，是脂肪酶固定化方法的一个创新。
【专利说明】
一种功能化离子液体修饰的碳纳米管及其固定化脂肪酶的方法
技术领域
[0001]本发明属于固定化酶技术和催化剂载体领域，涉及一种功能化离子液体修饰的碳纳米管在脂肪酶固定化中的应用。
【背景技术】
[0002]脂肪酶(EC3.1.1.3)能够催化天然底物进行油脂水解，广泛应用于医药、化工、食品、饲料和能源等行业，成为目前被重点研究的酶催化剂之一。
[0003]由于脂肪酶的化学本质为可溶性的蛋白质，游离的脂肪酶在工业应用中会遇到一系列的问题。如水相体系中游离酶在催化反应后难以分离;在反应过程中催化性能容易受到底物、产物等其它因素的影响;操作条件极端等。固定化酶具有稳定性好、能重复使用、易从反应系统中分离、便于运输和储存、有利于生产的连续化和自动化等优点，因而相比于游离酶具有更广阔的实际应用空间。载体作为固定化酶的一部分，其结构和性能对固定化酶的催化性能有着很大的影响，设计、开发和制备性能更加优异的载体材料已成为固定化酶研究的重点内容。
[0004]碳纳米管是由单层或多层石墨片按一定旋转角度绕中心轴卷曲成的纳米级圆管，具有较大的比表面积、有序的纳米孔道结构、良好的力学/电学/热学性能、突出的化学稳定性、生物相容性和可控的表面官能化修饰等特性，使它在生物医药及催化载体应用方面有着巨大的潜力，作为一种新型高效的酶固定化载体获得了生物、化学、材料、医学等众多领域研究者的广泛关注。现有技术中，专利CN104404027A成功将多种酶分别固定于碳纳米管上。专利CN101329296通过将葡萄糖酶负载在磁性碳纳米管复合材料上，从而制备出生物传感器。
[0005]尽管酶通过物理吸附方式可以直接吸附到碳纳米管上，但酶分子与载体结合力不强，容易导致酶的固定化效率及稳定性降低，而且酶易从载体脱落并污染催化反应产物等。此外，酶固定化后其催化作用由均相转移到多相，由此带来的扩散限制效应、空间位阻、分配效应等对酶的催化特性有很大影响。
[0006]离子液体被称为是“设计者的溶剂”，其结构可调性是离子液体最重要的特性。通过各种结构阴、阳离子的配对，或在阴和/或阳离子中引入不同的官能团从而调整离子液体的化学组成，实现离子液体物化性质的改变，从而得到具有所需性质的功能专一的离子液体，即功能化离子液体。将功能性离子液体修饰碳纳米管用于脂肪酶的固定化，是提高固定化酶的稳定性、催化活性的一个创新方法。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问扩散限制效应、催题在于现有固定化脂肪酶技术的不足，即固定化脂肪酶的稳定性、化活性存在改进的空间。
[0008]为了解决该技术问题，本发明提供了一种功能化离子液体修饰多壁碳纳米管固定化脂肪酶的方法。
[0009]具体的，本发明的技术方案为:
一种功能化离子液体修饰的碳纳米管，其中，纳米管表面存在能与酶氨基酸残基作用结合的来自于功能化离子液体的有机官能团。
[0010]本发明所述的功能化离子液体修饰的碳纳米管，其中，所述功能化离子液体的阳离子为含不同官能团的咪唑类离子。
[0011]本发明所述的功能化离子液体修饰的碳纳米管，其中，所述官能团为烷基、羧基、
羟基或氨基。
[0012]本发明所述的功能化离子液体修饰的碳纳米管，其中，所述的功能化离子液体的阴离子是卤素离子、四氟硼酸根亲水阴离子或六氟磷酸根疏水阴离子。
[0013]本发明所述的功能化离子液体修饰的碳纳米管，其中，所述碳纳米管长度>5um，直径10-20 nm。
[0014]本发明所述的功能化离子液体修饰的碳纳米管，其中，还包括利用含硝酸和硫酸的混酸羧基化处理多壁碳纳米管的步骤。
[0015]本发明还提供了两种不同的利用功能化离子液体修饰碳纳米管的方法。
[0016]一种利用功能化离子液体修饰碳纳米管的方法，其中，具体步骤如下(该方法的原理图见附图1a):
(1)用2.6mol/L的硝酸纯化多壁碳纳米管；
(2)利用含硫酸和硝酸的混酸羧基化处理多壁碳纳米管
(3)分离获得步骤(2)得到的多壁碳纳米管，加入1-(3-氨基丙基)咪唑进行酰氯化反应；
(4 )加入卤代烷烃、含羧基的卤代烷烃、含羟基的卤代烷烃或含氨基的卤代烷烃与步骤
(3)得到的固体进行反应；
(5)将步骤(4)得到的固体与NaBF4或KPF6进行阴离子交换获得利用功能化离子液体修饰碳纳米管；
(6)将步骤(5)获得固体进行洗涤提纯。
[0017]—种利用功能化离子液体修饰碳纳米管的方法，其中，具体步骤如下(该方法的原理图见附图1b):
(1)用2.6mol/L的硝酸纯化多壁碳纳米管；
(2)利用含硫酸和硝酸的混酸羧基化处理多壁碳纳米管；
(3)利用烷基咪唑类化合物与3-溴丙胺氢溴酸盐反应，纯化得氨基官能化离子液体即IL-NH2;
(4)将步骤(2)得到的多壁碳纳米管与步骤(3)得到的IL-NH2进行反应；
(5)将步骤(4)得到的固体与NaBF4或KPf6进行阴离子交换获得利用功能化离子液体修饰碳纳米管；
(6)将步骤(5)获得固体进行洗涤提纯。
[0018]利用上述任一功能化离子液体修饰的碳纳米管固定化脂肪酶的方法，其中，具体的步骤为:将脂肪酶与碳纳米管加入pH=7.0的PBS缓冲液中，在温度30 0C的振荡器中震荡5h，抽滤，得固定化酶。
[0019]本发明所述的方法，其中，所述脂肪酶与碳纳米管的质量比为1:2.5。
[0020]本发明中，所述的脂肪酶为LipozymeCALB L、猪胰脂肪酶或褶皱假丝酵母脂肪酶。
[0021]在本发明的有益效果在于:
1.该碳纳米管改善了脂肪酶在固定化载体上的酶学性质，解决了当前固定化酶领域普遍存在的载体负载量效率低、扩散限制作用、固定化酶活性不够高，而且当表面修饰基团与酶以化学键共价结合时，往往由于酶的三维构像及其柔性受到限制而影响酶活等问题。
[0022]2.本发明使用的载体多壁碳纳米管价格便宜，容易获取。
[0023]3.本发明将功能性离子液体修饰碳纳米管用于脂肪酶的固定化，丰富了固定化脂肪酶的方法。
[0024]4.本发明提供的功能化离子液体修饰的碳纳米管，其表面存在着能与酶氨基酸残基间产生静电、氢键、疏水、共价结合等作用的离子液体有机官能团，既能与酶有效结合改善酶学性质，又不会对酶结构造成大的破坏。
[0025]5.本发明制备的固定化酶粒径较小，长度>5um，直径10-20 nm，在进一步用于各类酶反应器中进行酶催化反应是具备优势。
[0026]6.本发明提供的功能化离子液体修饰的碳纳米管固定化的酶可以通过简单过滤与产物分离并回收且固定化酶表观活性和重复使用效果良好。
【附图说明】
[0027]图1为功能化离子液体合成以及嫁接在碳纳米管表面的原理图；
其中，图(a)为功能化离子液体合成以及嫁接在碳纳米管表面的过程图，其中R为烷基、羧基、羟基或氨基的有机官能团；图(b)为有机官能团为烷基的功能化离子液体修饰的碳纳米管的制备过程图，其中R为甲基、乙基或丁基等烷基。
[0028]图2实施案例I制备的功能化离子液体修饰碳纳米管热重图谱。
[0029]图3温度对实施例1的固定化酶活力的影响图。
[0030]图4实施例1和实施例4固定化酶的操作稳定性图。
[0031]其中，图(a)为实施案例I功能化离子液体修饰碳纳米管固定化酶的操作稳定性图；图(b)为实施案例4功能化离子液体修饰碳纳米管固定化酶的操作稳定性。
【具体实施方式】
[0032]实施例1
(I)碳纳米管纯化及氧化:取Ig原始碳纳米管于2.6M硝酸溶液中回流搅拌24h，静置后，除去上清液，过滤并洗涤，在真空干燥箱中干燥过夜，研磨备用。将1mg纯化碳纳米管加入到40ml浓硝酸和浓硫酸混合液中，超声3h，加水稀释后过滤洗涤至中性，真空干燥过夜，研磨备用，得羧基化碳纳米管(MWCNTs-COOH)。
[0033](2)功能化离子液体修饰碳纳米管固定化酶载体的制备:将一定摩尔比的1-甲基咪唑和3-溴丙胺氢溴酸盐于无水乙醇溶剂中，回流反应24h。反应产物除去溶剂及挥发性的未反应物后用少量水溶解，加入氢氧化钾调节pH至8.0。所得溶液减压蒸馏除去大部分水后真空干燥至恒重，用乙醇一四氢呋喃混合溶剂提取产物，收集滤液减压蒸馏回收溶剂后再真空干燥至恒重，得到黄色粘稠状液体1-( 1-氨基丙基)-3-甲基咪唑溴盐(IL-NH2)。将MWCNTs-COOH、IL-NH2、DCC溶于200ml DMF中，超声 15min后，在45-60°C油浴中搅拌24_36h，过滤洗涤后真空干燥得MWCNTs-1L。
[0034](3)酶固定化:取50ml pH=7.0的I3BS缓冲液加入锥形瓶中，再加入0.5g碳纳米管，取0.2g PPL加入锥形瓶中，在温度30°C的振荡器中震荡5h，抽滤洗涤，得固定化酶。
[0035](4)酶活测定:载体固定化酶水解三乙酸甘油酯乳化液为探针反应。在温度40°C，pH为7.0时，采用酸碱滴定法测定该固定化酶的活力。在100 ml的锥形瓶中加入50 ml的去离子水、2 g三乙酸甘油脂和10 ml的pH值为7.0的磷酸缓冲液，磁力搅拌器强力搅拌10 min使其成为乳浊液。通过PH仪对乳浊液的pH值进行记录，当乳浊液的pH值稳定后，记录为初始PH值。加入0.1 g的多壁碳纳米管固定化脂肪酶，环境温度为40°C。平稳搅拌反应30 min后立即加入4.5 ml的丙酮终止反应。测定溶液pH值记录为终了值，然后用0.05 mol/L的氢氧化钠溶液缓慢将溶液终了值滴定回归PH初始值，记录消耗的氢氧化钠量。
[0036]其中，酶活力单位IU定义为在环境温度为40°C时，每分钟催化三乙酸甘油脂释放Iμπιο?乙酸所需要的酶量。计算公式为:
U=V*50/(30*0.1)=16.67V
其中:V—耗用的NaOH溶液的体积，ml;
50—每毫升NaOH溶液含有的NaOH的微摩尔数；
30一反应时间，min;
0.1一游离酶或固定化酶量，g。
[0037]经测定以离子液体修饰的多壁碳纳米管为载体的固定化酶的酶活是261U/g，每克多壁碳纳米管固定化脂肪酶酶蛋白负载量是0.198g，比未用离子液体修饰载体固定化酶的酶活提高了20%，酶蛋白负载量提高了 15%。其中，图2为制备的本实施例制备的功能化离子液体修饰碳纳米管热重图谱。
[0038]按照本领域考察温度稳定性的常规方法考察了该固定化酶在40-60°C范围内的温度稳定性，结果如图3。未经修饰的碳纳米管固定化酶的最佳反应温度在60°C，本发明所制备的功能化离子液体修饰碳纳米管固定化对的PPL的最佳反应温度在65 °C，而游离酶的最佳反应温度在45°C，可见本发明所制备的固定化载体固定酶，其温度稳定性较之游离酶明显提尚O
[0039]按照本领域考察酶操作稳定性的常规方法考察了该功能化离子液体修饰的碳纳米管和未经修饰的碳纳米管所固定的PPL，结果如图4(a)。由图4(a)可知本发明提供的经功能化离子液体修饰的碳纳米管所固定化的PPL较之未修饰的碳纳米管所固定化的PPL具有优越的操作稳定性，在5次重复使用之后，前者仍保持其初始酶活的49.6%，比后者高了近20%。
[0040]实施例2
I)碳纳米管纯化及氧化:同实施案例I所述。
[0041 ] 2)功能化离子液体修饰碳纳米管固定化酶载体的制备:将一定摩尔比的1-乙基咪唑和3-溴丙胺氢溴酸盐于无水乙醇溶剂中，回流反应24h。反应产物除去溶剂及挥发性的未反应物后用少量水溶解，加入氢氧化钾调节pH至8.0。所得溶液减压蒸馏除去大部分水后真空干燥至恒重，用乙醇一四氢呋喃混合溶剂提取产物，收集滤液减压蒸馏回收溶剂后再真空干燥至恒重，得到黄色粘稠状液体1-( 1-氨基丙基)-3-乙基咪唑溴盐(IL-NH2)。将MWCNTs-COOH、IL-NH2、DCC溶于200ml DMF中，超声 15min后，在45-60°C油浴中搅拌24_36h，过滤洗涤后真空干燥得MWCNT-1L。
[0042]3)酶的固定化:取50ml pH=7.0的I3BS缓冲液加入锥形瓶中，再加入0.5g修饰后的碳纳米管，取0.2g PPL加入锥形瓶中，在温度30 0C的振荡器中震荡5h，抽滤洗涤得固定化酶。
[0043]4)酶活测定:酶活测定方法同实施例1。经测定以离子液体修饰的多壁碳纳米管为载体的固定化酶的酶活是213U/g，每克多壁碳纳米管固定化酶酶蛋白负载量是0.160g，比未用离子液体修饰载体固定化酶的酶活提高了 16%，酶蛋白负载量提高了 13%。
[0044]实施例3
I)碳纳米管纯化及氧化:同实施案例I所述。
[0045]2)功能化离子液体修饰碳纳米管固定化酶载体的制备:将一定摩尔比的1-丁基咪唑和3-溴丙胺氢溴酸盐于无水乙醇溶剂中，回流反应24h。反应产物除去溶剂及挥发性的未反应物后用少量水溶解，加入氢氧化钾调节pH至8.0。所得溶液减压蒸馏除去大部分水后真空干燥至恒重，用乙醇一四氢呋喃混合溶剂提取产物，收集滤液减压蒸馏回收溶剂后再真空干燥至恒重，得到黄色粘稠状液体1-(1-氨基丙基)-3-丁基咪唑溴盐(IL-NH2)。将MWCNTs-COOH、IL-NH2、DCC溶于200ml DMF中，超声 15min后，在45-60°C油浴中搅拌24_36h，洗涤过滤后60-80 °C真空干燥得产物，将得到的产物与NaBF4在水中搅拌48h，过滤洗涤后真空干燥得MWCNT-1L。
[0046]3)酶固定化:取50ml pH=7.0的PBS缓冲液加入锥形瓶中，再加入0.1g碳纳米管，取3ml Lipozyme CALB L加入锥形瓶中，在温度30°C的振荡器中震荡5h，抽滤洗涤得固定化酶。
[0047]4)酶活测定:酶活测定方法同实施例1。经测定以离子液体修饰的多壁碳纳米管为载体的固定化Lipozyme CALB L的酶活是4268U/g，每克多壁碳纳米管固定化脂肪酶酶蛋白负载量是0.06g，比未用离子液体修饰载体固定化酶的酶活提高了 16%，酶蛋白负载量提高了 15%。
[0048]实施例4
I)碳纳米管纯化及氧化:同实施案例I所述。
[0049]2)功能化离子液体修饰碳纳米管固定化酶载体的制备:取500mg丽CNTs-COOH于150ml氯化亚砜中搅拌回流24-30h，用无水THF洗涤过滤，真空干燥得MWCNTs-COCl。将MWCNTs-COCl与过量1-(3-氨基丙基)咪唑在120°C反应24-30h，用无水THF、1N HCl、饱和NaHCO3、水和乙醇洗涤过滤，真空干燥得产物。接着引入官能团物质氯乙酸，然后加入NaBF4进行离子交换，用水洗涤过滤，干燥得MWCNTs-1L。
[0050]3)酶的固定化:取50ml pH=7.0的PBS缓冲液加入锥形瓶中，再加入0.1g碳纳米管，取3ml Lipozyme CALB L加入锥形瓶中，在温度30°C的振荡器中震荡5h，抽滤洗涤得固定化酶。
[0051]4)酶活测定:酶活测定方法同实施例1。经测定以离子液体修饰的多壁碳纳米管为载体的固定化酶的酶活是5038U/g，每克多壁碳纳米管固定化脂肪酶酶蛋白负载量是
0.083g，比未用离子液体修饰载体固定化酶的酶活提高了 55%，酶蛋白负载量提高了 18%。
[0052]按照本领域考察酶操作稳定性的常规方法考察了该功能化离子液体修饰的碳纳米管和未经修饰的碳纳米管所固定的Lipozyme CALB L，结果如图4(b)。由图4(b)可知本发明提供的经功能化离子液体修饰的碳纳米管所固定化的PPL较之未修饰的碳纳米管所固定化的PPL具有优越的操作稳定性，在5次重复使用之后，前者仍保持其初始酶活的84%，而后者仅保持其初始酶活的50%。
[0053]实施例5
I)碳纳米管纯化及氧化:同实施案例I所述。
[0054]2)功能化离子液体修饰碳纳米管固定化酶载体的制备:取500mg MWCNTs-COOH于150ml氯化亚砜中搅拌回流24-30h，用无水THF洗涤过滤，真空干燥得MWCNTs-COCl。将MWCNTs-COCl与过量1-(3-氨基丙基)咪唑在120°C反应24-30h，用无水THF、1N HCl、饱和NaHCO3、水和乙醇洗涤过滤，真空干燥得产物。接着引入官能团物质溴乙醇，然后加入KPF6进行离子交换，得到MWCNTs-1L。
[0055]3)酶的固定化:取50ml pH=7.0的PBS缓冲液加入锥形瓶中，再加入0.5g碳纳米管，取0.2g CRL加入锥形瓶中，在温度30°C的振荡器中震荡5h，抽滤洗涤得固定化酶。
[0056]4)酶活测定:酶活测定方法同实施例1。经测定以离子液体修饰的多壁碳纳米管为载体的固定化酶的酶活是30U/mg，每克多壁碳纳米管固定化脂肪酶酶蛋白负载量是
0.052g，比未用离子液体修饰载体固定化酶的酶活提高了 20%，酶蛋白负载量提高了 8%。
[0057]实施例6
I)碳纳米管纯化及氧化:同实施案例I所述。
[0058]2)功能化离子液体修饰碳纳米管固定化酶载体的制备:取500mg MWCNTs-COOH于150ml氯化亚砜中搅拌回流24-30h，用无水THF洗涤过滤，真空干燥得MWCNTs-COCl。将MWCNTs-COCl与过量1-(3-氨基丙基)咪唑在120°C反应24-30h，用无水THF、1N HCl、饱和NaHCO3、水和乙醇洗涤过滤，真空干燥得产物。接着引入官能团物质氯乙胺，然后加入KPF6进行离子交换，得到MWCNTs-1L。
[0059]3)酶的固定化:取50ml pH=7.0的PBS缓冲液加入锥形瓶中，再加入0.5g碳纳米管，取0.2g CRL加入锥形瓶中，在温度30°C的振荡器中震荡5h，抽滤洗涤得固定化酶。
[0060]4)酶活测定:酶活测定方法同实施例1。经测定以离子液体修饰的多壁碳纳米管为载体的固定化酶的酶活是62U/mg，每克多壁碳纳米管固定化脂肪酶酶蛋白负载量是0.095g，比未用离子液体修饰载体固定化酶的酶活提高了 39%，酶蛋白负载量提高了 17%。
【主权项】
1.一种功能化离子液体修饰的碳纳米管，其特征在于，纳米管表面存在能与酶氨基酸残基作用结合的来自于功能化离子液体的有机官能团。2.根据权利要求1所述功能化离子液体修饰的碳纳米管，其特征在于，所述功能化离子液体的阳离子为含不同官能团的咪唑类离子。3.根据权利要求2所述功能化离子液体修饰的碳纳米管，其特征在于所述官能团为烷基、羧基、羟基或氨基。4.根据权利要求1所述功能化离子液体修饰的碳纳米管，其特征在于，所述的功能化离子液体的阴离子是卤素离子、四氟硼酸根亲水阴离子或六氟磷酸根疏水阴离子。5.根据权利要求1所述所述功能化离子液体修饰的碳纳米管，其特征在于，所述碳纳米管长度>5um，直径10-20 nm。6.根据权利要求5所述功能化离子液体修饰的碳纳米管，其特征在于，还包括利用含硝酸和硫酸的混酸羧基化处理多壁碳纳米管的步骤。7.一种利用功能化离子液体修饰碳纳米管的方法，其特征在于，具体步骤如下: (1)用2.6mol/L的硝酸纯化多壁碳纳米管； (2)利用含硫酸和硝酸的混酸羧基化处理多壁碳纳米管； (3)分离获得步骤(2)得到的多壁碳纳米管，加入1-(3-氨基丙基)咪唑进行酰氯化反应； (4 )加入卤代烷烃、含羧基的卤代烷烃、含羟基的卤代烷烃或含氨基的卤代烷烃与步骤(3)得到的固体进行反应； (5)将步骤(4)得到的固体与NaBF4或KPF6进行阴离子交换获得利用功能化离子液体修饰碳纳米管； (6)将步骤(5)获得固体进行洗涤提纯。8.一种利用功能化离子液体修饰碳纳米管的方法，其特征在于，具体步骤如下: (1)用2.6mol/L的硝酸纯化多壁碳纳米管； (2)利用含硫酸和硝酸的混酸羧基化处理多壁碳纳米管； (3)利用烷基咪唑类化合物与3-溴丙胺氢溴酸盐反应，纯化得氨基官能化离子液体即IL-NH2; (4)将步骤(2)得到的多壁碳纳米管与步骤(3)得到的IL-NH2进行反应； (5)将步骤(4)得到的固体与NaBF4或KPF6进行阴离子交换获得利用功能化离子液体修饰碳纳米管； (6)将步骤(5)获得固体进行洗涤提纯。9.利用上述任一功能化离子液体修饰的碳纳米管固定化脂肪酶的方法，其特征在于，具体的步骤为:将脂肪酶与碳纳米管加入pH=7.0的PBS缓冲液中，在温度30°C的振荡器中震荡5h，抽滤，得固定化酶。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶与碳纳米管的质量比为1:.2.5
【文档编号】B82Y40/00GK105836731SQ201610310527
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】胡燚, 万晓梅, 黄和, 相欣然, 陈虹月
【申请人】南京工业大学