包含木质纤维素生物质发酵过程糖浆的土壤调理组合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种在木质纤维素生物质发酵过程中所产生的糖浆，其用作土壤调理物质的粘结剂，以使得农用组合物易于处理和施用。所述糖浆使粉末状土壤调理物质诸如石灰和石膏粘结以形成丸粒或颗粒。
【专利说明】
包含木质纤维素生物质发酵过程糖浆的土壤调理组合物
[00011 本申请要求2014年5月20日提交的美国临时申请62/000639和2013年10月10日提 交的申请61/889061的权益，所述申请全文各自以引用方式并入。
技术领域
[0002] 本发明涉及土壤调理剂领域。更具体地，将木质纤维素糖浆在农用组合物中用作 粘结剂。木质纤维素糖浆是木质纤维素生物质发酵过程的联产品。
【背景技术】
[0003] 土壤调理剂用于改善土壤的质量以改善植物生长和收率。期望土壤调理剂以易于 分散于土壤的状态施用。因此土壤调理剂的活性成分通常为精细研磨或粉末形式。通常将 调理成分与粘结剂结合以形成易于处理、运输以及分散于施用部位的丸粒。
[0004] 土壤调理剂的示例包括含有碳酸钙的石灰和其它矿物质（包括镁），以及石膏（水 合硫酸钙）。石灰降低土壤酸性，这改善植物生长。石膏改善土壤排水并促进植物生长。
[0005] 与土壤调理剂组合结合的粘结剂的示例为木质素磺酸盐（或木质素亚硫酸盐;磺 化木质素）。木质素磺酸盐是用于由木浆造纸的亚硫酸盐方法的副产品。在该过程期间，木 材中的木质素与纤维素分离并且被磺化。所得的磺化木质素副产品为粉末状物质的有效粘 结剂。W0201426048公开了用于生产肥料的方法，其中制得石膏和粘结剂诸如木质素磺酸盐 的丸粒。US20140030369公开了包含木质素磺酸盐的土壤改良组合物。
[0006] 在将木质纤维素生物质用作用于发酵的碳源的纤维素乙醇方法中，通常将来自蒸 馏塔(啤酒塔)的全塔馏物分离为固体(湿饼或滤饼)和液体(稀塔馏物)馏分。使稀塔馏物通 过蒸发器以产生糖浆。滤饼和糖浆是纤维素乙醇方法的联产品。可燃烧具有至少约40%固 体的糖浆，如US20120102823中所公开，由此提供能量。也可燃烧滤饼以提供能量。
[0007] 仍然需要易于获自可再生资源的另外的材料，其可在土壤调理剂中用作粘结剂。
【发明内容】
[0008] 本发明提供农用组合物，其混合由最初利用木质纤维素生物质的发酵过程产生的 糖浆与至少一种土壤调理物质。本发明的糖浆的物理特性类似于以上所述的木质素磺酸盐 物质，但是其不需要磺化并且由环境友好的过程制得。
[0009] 因此，本发明提供了农用组合物，其包含：
[0010] a)木质纤维素糖浆;和
[0011] b)至少一种土壤调理物质。
[0012] 在一个实施方案中，所述糖浆是由木质纤维素生物质制备醇的过程的联产品。
[0013] 在另一个实施方案中，所述糖浆包含：
[0014] a)约40 %至约70 %的固体；
[0015] b)约10g/l至约30g/l的乙酰胺;和
[0016] c)至少约40g/l的糖；
[0017]其中所述纤维素糖浆具有约lg/cm3至约2g/cm3的密度和在100°F(38°C)
[0018] 下小于500SSU的粘度。
[0019] 在另一方面，本发明提供一种用于制备农用组合物的方法，该方法包括使木质纤 维素糖浆与至少一种土壤调理物质结合，其中产生包含糖浆与调理物质的丸粒或颗粒。
[0020] 在又一方面，本发明提供一种用于调理土壤的方法，该方法包括将以上所述农用 组合物施用于土壤。
【具体实施方式】
[0021] 为了高度有效，通常将土壤调理物质制备为可分散并渗透到其所施用的土壤中的 粉末状物质。然而，为了便于处理和施用，将粉末状物质与粘结剂结合以形成丸粒或颗粒。 由采用木质纤维素生物质的发酵过程制得的糖浆可用作粉末状土壤调理物质的粘结剂。
[0022] 以下定义和缩写用于权利要求和说明书的解释。
[0023] 如本文所用，术语"包含"、"包括"、"具有"或"含有"，或者其任何其它变型旨在包 括非排他性的包括。例如，包含元素列表的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅 限于那些元素，但可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制 品或设备固有的元素。此外，除非明确指明相反，"或"是指包含性的"或"而非排他性的 "或"。例如，条件A或B满足下列任一项:A为真实的(或存在的)且B为虚假的（或不存在的），A 为虚假的(或不存在的)且B为真实的(或存在的），以及A和B均为真实的(或存在的）。
[0024] 在本发明的元素或组分前的不定冠词"一个"和"一种"旨在为有关所述元素或组 分的实例（即出现)数量的非限制性。因此，应将"一个"或"一种"理解为包括一个或至少一 个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
[0025] 如本文所用，术语"发明"或"本发明"是非限制性术语，并且不旨在意指本发明的 任何单独实施方案，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施方案。
[0026] 如本文所用，用术语"约"修饰本发明的成分或反应物的量时是指数值量的变化， 它们可能发生在例如，典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序中； 这些程序中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异 中；等。术语"约"还涵盖由于对于起因于特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同 的量。无论是否由术语"约"来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施方案中，术语 "约"指在报告数值的10%以内，优选地在报告数值的5%以内。
[0027] 术语"可发酵糖"是指在发酵过程中能被微生物用作碳源的低聚糖和单糖。
[0028] 术语"木质纤维素"是指包含木质素和纤维素两者的组合物。木质纤维素材料也可 包含半纤维素。
[0029] 术语"纤维素"是指包含纤维素和附加组分(包括半纤维素)的组合物。
[0030] 术语"糖化"是指由多糖产生可发酵糖。
[0031] 术语"经预处理的生物质"是指在糖化之前已经过预处理的生物质。预处理可为物 理的、热的或化学方法的形式以及它们的组合。
[0032] 术语"丁醇"是指异丁醇、1-丁醇、2-丁醇、或它们的组合。
[0033] 术语"木质纤维素生物质"是指任何木质纤维素材料，并且包括含有纤维素、半纤 维素、木质素、淀粉、寡糖和/或单糖的材料。生物质也可包含附加组分诸如蛋白质和/或脂 质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包含来源于多于一种来源的混合物；例如，生 物质可包含玉米棒和玉米秸杆的混合物，或草和叶片的混合物。木质纤维素生物质包括但 不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸的淤渣、庭院垃 圾、木材和林业垃圾。生物质的示例包括但不限于玉米棒、作物残余物诸如玉米皮、玉米秸 杆、草(包括细叶芒）、小麦秸杆、大麦秸杆、干草、稻杆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱植物材 料、大豆植物材料、由谷物的研磨或由生产过程中使用谷物获得的组分(诸如DDGS:含可溶 物的干酒糟）、木质材料诸如树、枝、根、木片、锯末、灌木和灌丛、叶、蔬菜、水果、花、棕榈空 果串和能源甘蔗。
[0034] 术语"能源甘蔗"是指培育用于产生能量的甘蔗。其因纤维百分比高于糖而被选 择。
[0035] 术语"木质纤维素生物质水解产物"是指木质纤维素生物质糖化产生的产物。生物 质也可在糖化前进行预处理或预加工。
[0036] 术语"木质纤维素生物质水解产物发酵液"是指包含产物的发酵液，所述产物得自 包含木质纤维素生物质水解产物的培养基中的生物催化剂生长和生产。所述发酵液包含木 质纤维素生物质水解产物的成分，所述成分为没有被生物催化剂消耗的，以及生物催化剂 本身和生物催化剂产生的产品。
[0037] 术语"浆料"是指不溶解的材料和液体的混合物。浆料还可包含高水平的溶解固 体。浆料的示例包括糖化液、发酵液和塔馏物。
[0038] 术语"全塔馏物"是指蒸馏的塔底物。所述全塔馏物包含高沸腾物和蒸馏进料流的 任何固体。全塔馏物是枯竭的发酵液的类型。
[0039] 术语"稀塔馏物"是指来自全塔馏物、发酵液、或产物枯竭的发酵液的固体/液体分 离的液体镏分。
[0040] 术语"糖衆"指浓缩的产物，其由稀塔馏物去除水而产生，一般来讲为蒸发。
[0041] 术语"目标产物"是指任何由发酵中的微生物生产宿主细胞生成的产物。目标产物 可为宿主细胞中遗传工程的酶的途径的产物或可由内源性途径产生。典型的目标产物包括 但不限于:酸、醇、烷烃、烯烃、芳烃、醛、酮、生物聚合物、蛋白质、肽、氨基酸、维生素、抗生素 和药物。
[0042] 术语"发酵"是指广义地使用生物催化剂来产生目标产物。通常生物催化剂在发酵 液中利用发酵液中的碳源生长，并且通过其代谢产生目标产物。
[0043] "固体"是指可溶固体和不可溶固体。来自木质纤维素发酵过程的固体包含用于制 备水解产物培养基的木质纤维素生物质的残余物。
[0044] 本文"挥发物"是指在引入热的过程中将较大程度气化的组分。通过确定严格受控 条件下由加热至950°C所引起的重量损失来测量本文挥发物含量(如在ASTM D-3175中）。典 型的挥发物包括但不限于氢气、氧气、氮气、乙酸以及一些碳和硫。
[0045] 本文"固定碳"是指通过将水分百分比、灰分百分比、和挥发物百分比相加，然后用 100减去该百分比得到的计算百分比。
[0046] "灰分"是根据ASTM D-3174,在受控条件下燃烧后剩余的残余物的重量。
[0047]如木质纤维素糖浆组合物中所提及的"糖"意指单糖和可溶性低聚糖的总和。
[0048]本文"土壤调理物质"是指改善土壤的物理特性的物质，其可包括为植物提供营养 的能力。
[0049] 本发明的农用组合物包含木质纤维素糖浆和至少一种土壤调理物质。
[0050] 木质纤维素糖浆的制备和组合物
[0051] 本发明的木质纤维素糖浆作为来自于使用木质纤维素生物质的过程的联产品而 产生，所述木质纤维素生物质作为可用作生物催化剂的碳源的可发酵糖的来源。生物催化 剂在发酵过程中利用糖产生目标产物。
[0052]为了从木质纤维素生物质产生可发酵糖，对生物质进行处理以释放糖诸如来自于 生物质多糖的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。本领域技术人员可用任何已知的方法处理木质纤 维素生物质，在水解产物中产生可发酵糖。通常，所述生物质使用物理的、热的和/或化学的 处理进行预处理，并酶解糖化。热-化学预处理方法包括蒸汽喷发或使生物质溶胀以释放糖 的方法(参见例如W02010113129;W02010113130)。也可以采用化学糖化。用于预处理生物质 的物理处理包括但不限于磨削、研磨和切割。诸如这些的物理处理可用于在进一步化学处 理前减小粒度。化学处理包括碱处理诸如用强碱（氨或NaOH)或酸处理（US8545633; W02012103220)。在一个实施方案中，用氨处理生物质（US 7932063;US 7781191;US 7998713 ;US7915017)。这些处理从生物质释放聚合糖。低氨预处理是特别有用的，其中生物 质与包含氨的水溶液接触，形成生物质-氨水混合物，其中氨的浓度足够保持生物质-氨水 混合物的碱性pH，但相对于生物质的干重小于约12重量％，并且相对于生物质-氨水混合物 的重量，生物质的干重为至少约15重量％的固体，如US 7，932,063所公开的，其以引用方式 并入本文。
[0053]将聚合糖转化为单糖的糖化可以通过酶处理或化学处理进行。在一个方面，使经 预处理的生物质与糖化酶聚生体在合适的条件下接触，以产生可发酵糖。在糖化之前，可使 经预处理的生物质达到期望的含水量并对其进行处理以改变PH、组合物或温度使得糖化酶 聚生体中的酶将有活性。可通过添加固体或液体形式的酸改变pH。另选地，可利用可从发酵 中回收的二氧化碳(C0 2)来降低pH。例如，如果存在足够的液体，可从发酵罐中收集C02并将 其进料到闪蒸槽中的预处理产物顶部空间或起泡通过经预处理的生物质，同时监控PH，直 至达到所需的pH。可使温度达到下文提到的与糖化酶活性相容的温度。通常，合适的条件可 包括约40 °C至50 °C的温度以及约4.8至5.8的pH。
[0054]纤维素或木质纤维素生物质的酶促糖化通常利用酶组合物或共混物来降解纤维 素和/或半纤维素并且产生包含糖诸如例如葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的水解产物。糖化酶参 见 LyncUL.R.等人（"Microbiol .Mol .Biol .Rev.，66:506-577,2002)。使用至少一种酶，并且 通常使用糖化酶共混物，其包含一种或多种糖苷酶。糖苷酶水解二糖、低聚糖和多糖的醚 键，并且存在于广义"水解酶"（EC 3.)的酶分类EC 3.2.1 .x(Enzyme Nomenclature 1992， Academic Press，San Diego，CA，以及增补1 (1993)、增补2( 1994)中、增补3( 1995、增补4 (1997)和增补5[分别在Eur·J·Biochem·，223:l-5，1994 ;Eur·J·Biochem·，232:l-6，1995; Eur .J.Biochem.，237:1-5，1996 ;Eur · J.Biochem.，250:1-6，1997;以及Eur · J.Biochem."， 264:610-6501999中])中。可用于糖化的糖苷酶可通过它们水解的生物质组分进行分类。可 用于糖化的糖苷酶可包括纤维素水解糖苷酶(例如，纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖 酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶）、半纤维素水解糖苷酶（例如，木聚糖酶、内切木聚糖 酶、外切木聚糖酶、木聚糖苷酶、阿拉伯糖基木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡 糖醛酸酶)和淀粉水解糖苷酶(例如，淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖 苷酶、异淀粉酶）。此外，将其它活性物质加入糖化酶聚生体(诸如肽酶(EC 3.4.xy)、脂肪酶 (EC 3.1.1.X和3.1.4.X)、木质素酶(EC 1.11.1.X)或阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73))中以促进 从生物质的其它组分中释放多糖可为有用的。本领域熟知生产多糖水解酶的微生物常常表 现出某种活性，诸如降解纤维素的能力，该活性由具有不同底物特异性的若干种酶或一组 酶催化。因此，来自微生物的"纤维素酶"可包括一组酶、该组酶中的一种或多种酶或所有 酶，它们都可有助于纤维素降解活性。取决于获取酶时利用的纯化方案，商业或非商业酶制 剂(诸如纤维素酶)可包括多种酶。对于糖化有用的许多糖基水解酶和它们的组合物公开于 TO 2011/038019中。用于糖化的另外的酶包括例如糖基水解酶，其水解两个或更多个碳水 化合物之间的糖苷键，或碳水化合物与非碳水化合物部分之间的糖苷键。
[0055]糖化酶可商购获得。此类酶包括例如Spezyme" CP纤维素酶、Multifec.r木聚糖 酶、Acc.eleras.ef& 1500、Accdlerasel!DUET、.以及 Accellemse?Tr i〇TM(Dupont?/ Genencor'',Wi lmington，DE)，以及Novozyme_188(诺维信，2880Bagsvaerd，丹麦 (Novozymes，2880Bagsvaerd，Denmark))。此外，糖化酶可以是未经纯化的并以细胞提取物 或全细胞制剂的形式提供。可使用已经工程化以表达一种或多种糖化酶的重组微生物来制 备所述酶。例如，可用于经预处理的纤维素类生物质的糖化的H3A蛋白质制剂是由里氏木霉 (Trichoderma reesei)的遗传工程菌株生产的酶的未纯化的制剂，其包括纤维素酶和半纤 维素酶的组合，并且描述于W0 2011/038019中，该文献以引用方式并入本文。
[0056]可采用化学糖化处理并且其对于本领域的技术人员是已知的，诸如用无机酸包括 HC1 和 H2SO4 处理（US5580389;TO2011002660)。
[0057]通过木质纤维素生物质的糖化来释放糖诸如葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，并且这些 单糖提供用于生物催化剂(用于发酵过程)的碳水化合物源。糖存在于用作发酵培养基的生 物质水解产物中。发酵培养基可仅由水解产物构成，或可包含水解产物之外的组分，诸如山 梨醇或甘露糖醇，最终浓度为约5mM，如US 7，629，156中所述，其以引用方式并入本文。生物 质水解产物通常占发酵培养基的至少约50%。通常发酵液的终体积的约10%是包含生物催 化剂的种菌。
[0058]在发酵罐中发酵包含水解产物的培养基，所述发酵罐为容纳水解产物发酵培养基 和至少一种生物催化剂并且具有阀门、通气孔、和/或用于管理发酵过程的端口的任何容 器。
[0059] 天然地或通过基因工程利用葡萄糖且优选地还利用木糖生产目标产物的任何生 物催化剂可用于木质纤维素生物质制成的生物质水解产物中可发酵糖的发酵。可通过发酵 生产的目标产物包括例如酸、醇、烷烃、稀烃、芳烃、醛、酮、生物聚合物、蛋白质、肽、氨基酸、 维生素、抗生素和药物。醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、丁 二醇、甘油、赤藓醇、木糖醇、甘露糖醇和山梨醇。酸可包括乙酸、甲酸、乳酸、丙酸、3-羟基丙 酸、丁酸、葡萄糖酸、衣康酸、柠檬酸、琥珀酸、3-羟基丙酸、富马酸、马来酸和乙酰丙酸。氨基 酸可包括谷氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨 酸。附加的目标产物包括甲烷、乙烯、丙酮和工业酶。
[0060] 生物质水解产物中糖转化为目标产物的发酵可通过一个或多个能够在包含生物 质水解产物的培养基中生长的合适的生物催化剂在一步或多步发酵过程中进行。生物催化 剂可以是选自细菌、丝状真菌和酵母的微生物。生物催化剂可为野生型微生物或重组微生 物，并且可包括例如属于埃希氏菌属(￡8(：1161'；[(31113)、发酵单胞菌属(271]1011101^8)、酵母属 (Saccharomyces)、假丝酵母属（Candida)、毕赤酵母属（Pichia)、链霉菌属 (Streptomyces)、芽胞杆菌属（Bacillus)、乳酸杆菌属（Lactobacillus)和梭菌属 (Clostridiuma)的生物体。通常，生物催化剂的典型示例包括重组大肠杆菌(Escherichia coli)、运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis)、嗜热脂肪芽胞杆菌（Bacillus stearothermophilus)、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、嗜热梭菌（Clostridia 1：1161'1]10。61111111)、高温产氢菌（1'1161'1]10&11&61'0&&(^61'；[111118&(^11&1'0171：；[(311111)、以及树干毕赤 酵母(Pichia stipitis)。为生长良好和在木质纤维素生物质水解产物发酵液中有高的产 物产量，可选择或工程化生物催化剂以具有对生物质水解产物中存在的抑制剂诸如乙酸盐 的更高的耐受性。例如，生物催化剂可产生作为目标产物的乙醇，诸如通过运动发酵单胞菌 产生乙醇，如在US 8,247,208中所描述，其以引用方式并入本文。
[0061] 发酵在适用于所用特定生物催化剂的条件下进行。可对条件诸如PH、温度、氧含量 和混合进行调节。用于酵母和细菌生物催化剂的发酵的条件在本领域中是已知的。
[0062] 此外，糖化和发酵可在同一容器中同时发生，这称为同步糖化和发酵(SSF)。此外， 在称为HSF(混合糖化和发酵)的过程中，在糖化和发酵并发的时间段之前可发生局部糖化。
[0063] 对于较大规模的发酵，通常较少的生物催化剂培养物首先生长，其称为种子培养 物。将种子培养物作为种菌添加至发酵培养基中，通常在约2%至约20%的终体积的范围 内。
[0064] 通常通过生物催化剂发酵产生包含由生物催化剂制得的目标产物的发酵液。例 如，在乙醇方法中，发酵液可为包含约6%至约10%乙醇的发酵醪。除目标产物之外，发酵液 还包含水、溶质和固体，它们得自水解产物培养基以及得自水解产物培养基中糖的生物催 化剂代谢。通常使目标产物与发酵液分离，产生枯竭的发酵液(可称为全塔馏物）。例如，当 乙醇为产物时，通常使用啤酒塔蒸馏发酵液，以产生乙醇产物流和全塔馏物。蒸馏可使用本 领域技术人员已知的任何条件，包括在大气压或减压下。使馏出的乙醇进一步通过精馏塔 和分子筛以回收乙醇产物。可另选地在随后步骤中去除目标产物，诸如在分离发酵液之后 从固体或液体镏分中去除。
[0065] 木质纤维素生物质发酵过程的糖浆联产品由发酵液或枯竭的发酵液制得。制备糖 浆的示例在US20120102823中公开，其以引用方式并入本文。发酵液或枯竭的发酵液，诸如 全塔馏物，分离为固体和液体流，其中液体流被称为稀塔馏物。可使用多种过滤装置，诸如 带式过滤器、压带机、螺杆式压缩机、转鼓过滤器、碟式过滤器、Nutsche过滤器、压力过滤机 和离心过滤器。可通过诸如施用真空、压力或离心力辅助过滤。为了提高过滤的效率可使用 热处理，如在共同拥有的和共同未决的US20120178976中所公开，其以引用方式并入本文。
[0066] 在对木质纤维素生物质水解产物发酵液或枯竭的发酵液进行液体/固体分离后， 固体部分或滤饼(也称为湿饼)可以燃烧以为生产过程提供能量。所述滤饼可在燃烧前干 燥，诸如空气干燥，以降低水分。
[0067] 在对木质纤维素生物质水解产物发酵液进行液体/固体分离后，去除产物流。例 如，液体流可萃取或蒸馏以产生产物流，诸如蒸馏产生乙醇产物流和剩余液体。
[0068] 液体镏分通过蒸发而进一步纯化以产生能回收的水和糖浆。在蒸发之前，液体镏 分的一部分可回收作为涡流使用，其可添加到过程中需要水的任何一点，诸如在预处理、糖 化或生物催化剂种子制备中。蒸发可在任何蒸发系统中进行，诸如降膜、升膜、压力环流、板 式或机械和热蒸汽再压缩系统。蒸发可为连续的或分批的，并可用多效蒸发器。蒸发的水可 循环用于木质纤维素生物质水解产物发酵总体过程。
[0069] 蒸发后剩余的物质是糖浆，其为本发明的木质纤维素糖浆。在一个实施方案中，木 质纤维素糖浆组合物包含约40%至约60 %固体或约40%至约70%固体（可具有约40%、 45%、50%、55%、60%、65%或70%固体），约1(^/1至3(^/1乙酰胺，至少约4(^/1的糖，约 lg/cm3至约2g/cm3的密度，以及在100°F(38°C)下小于500SSU的粘度。"SSU"是以秒计的赛波 特通用粘度(Burger VL.，Encycl · Ind.Chem.Anal · (1966)，第3卷，768-74)。可调制蒸发程 度来实现期望的固含量。当用于制备用于糖化的生物质的预处理过程是使用氨的过程时， 木质纤维素糖衆包含至少约5g/1的氨。
[0070] 土壤调理物质
[0071]将土壤调理物质与本发明的木质纤维素糖浆结合来产生本发明的农用组合物。土 壤调理物质是这样一种物质：在将其施用于土壤时改善土壤的性质，使得植物生长和收率 中的至少一者增大。可改善的土壤性质包括但不限于PH、排水、提供植物营养素、土壤结构、 阳离子交换量和保水率。任何可混合的土壤调理物质可用于本发明。通常，使用的土壤调理 物质为颗粒物，并且为粉末状、尘状或颗粒状。在一个实施方案中，土壤调理物质为粉末形 式。
[0072]在各种实施方案中，附加燃料组分为石灰或石膏。用于土壤应用的石灰通常为由 碳酸钙制得的粉碎或研磨的石灰石。白垩是石灰石的一种形式，其为软质白色多孔的沉积 岩。白云石石灰是一种包含碳酸钙和碳酸镁的石灰类型。石灰呈碱性并且用于中和酸性土 壤并且添加钙，并且可添加镁(如果使用白云石石灰的话）。石膏为水合硫酸钙。石膏除去土 壤的钠并且用钙对其进行替换从而降低土壤的盐度，并且通过与粘土中的盐竞争来化学松 动粘土从而改善排水和植物根部的生长。
[0073] 农用组合物
[0074]本发明的农用组合物包含本文所述的木质纤维素糖浆和土壤调理物质，如上所 述。使木质纤维素糖浆与土壤调理物质以其中糖浆用作土壤调理物质的粘结剂的量结合， 土壤调理物质通常为粉碎或粉末状的。在各种实施方案中，糖浆按糖浆与土壤调理物质的 最终结合的重量计为约2%至约20%。糖浆可为总合重量的约2%、3%、4%、5%、6%、7%、 8%、9%、10%、11 %、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或 20%。在各种实施方 案中，糖浆为糖浆与土壤调理物质的最终组合的约2%至20%，或约2%至10%，并且土壤调 理物质为石灰、石膏、或它们的组合。
[0075]在用于制备农用组合物的本发明方法中，使木质纤维素糖浆与土壤调理物质以约 1:50至约1:5的比率结合。木质纤维素糖浆与土壤调理物质的比率可为约1:50至1:6.7,或 约1:50至1:10。木质纤维素糖浆与土壤调理物质的组合形成便于处理的固体物质。可成形 为各种形状，诸如丸粒、颗粒、不规则形状等。在一个实施方案中，在转鼓旋转时，在转鼓中 将糖浆喷洒到土壤调理物质上。在一个实施方案中，对木质纤维素糖浆和土壤调理物质组 合物进行干燥。另选的处理可包括诸如加热、压缩、挤出、粒化、模塑和/或干燥这些处理。
[0076] 农用组合物的用途
[0077]可通过本领域技术人员已知的任何方法将本发明的农用组合物施用于土壤。例 如，诸如对于草地护理或农田，可通过使用任何尺寸的常规撒肥机进行撒布来施用农用组 合物。农用组合物可在种植前耕入土壤中，在种植后进行施用，和/或在生长季节期间进行 周期性地施用。通常在施用前进行土壤测试以确定待施用于土壤的农用组合物的特定类型 和量。
[0078] 实施例
[0079] 本发明将在以下的实施例中进一步阐述。应该理解，这些实施例尽管说明了本发 明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技 术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的实质和范围内的前提下，可对本 发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。
[0080] 所用缩写的含义如下："S"是指秒，"min"是指分钟，"h"或"hr"是指小时，"μΓ或"μ Γ是指微升，"mL"或"ml"是指毫升，"L"或Τ是指升，"m"是指米，"nm"是指纳米，"mm"是指 毫米，"cm"是指厘米，"μπι"是指微米，"mM"是指毫摩尔每升，"M"是指摩尔，"mmol"是指毫摩 尔，Viole"是指微摩尔，"g"是指克，"yg"是指微克，"mg"是指毫克，"kg"是指千克，"rpm"是 指每分钟转数，"C"是指摄氏度，"ppm"是指份每一百万份，"cP"是厘泊，"g/Γ意指克每升， "SSU"是以秒计的赛波特通用粘度，"wt%"是指重量％。
[0081] 一般方法:
[0082] 糖化酶
[0083] Accellerase?1500(A1500)和 Mllltifect? 木聚糖酶购自 Danisco U.S.Inc.， Genencor，International(Rochester，NY)〇
[0084] 纤维素酶和半纤维素酶生产菌株
[0085] 菌株229:里氏木霉菌株，来源于RL-P37(Sheir_Neiss and Montenecourt，1984， Appl.Microbiol.Biotechnol. 20:46-53)通过诱变和对高纤维素酶产量的选择，采用PEG介 导转化法与β-葡糖苷酶表达盒（cbhl启动子，里氏木霉β-葡糖苷酶1基因，cbhl终止子和 amdS标记）和内切木聚糖酶表达盒（cbhl启动子，里氏木霉xyn3和cbhl终止子）共转化 (Penttila等人，1987，Gene 61(2) :155-64)。众多的转化体被分离出来并检验β-葡糖苷酶 和内切木聚糖酶产量。一个转化体，称为里氏木霉菌株229,被用于本文所述的某些研究中。 [0086] 菌株Η3Α:里氏木霉菌株229采用电穿孔法，与β-木糖苷酶Fv3A表达盒（cbhl启动 子，Fv3A基因 ，cbh 1终止子和alsR标记）、β-木糖苷酶Fv43D表达盒(egl 1启动子，Fv43D基因， 原生Fv43D终止子）以及Fv51Aa-阿拉伯呋喃糖酶表达盒(egll启动子，Fv51A基因，Fv51A原 生终止子)共转化。转化体在包含氯嘧磺隆的Voge 1 s琼脂平板上选择。许多转化体被分离出 来并检验木糖苷酶和L-a-阿拉伯呋喃糖酶产量。里氏木霉整合表达菌株H3A被分离出来， 其重组表达里氏木霉β-葡糖苷酶1、里氏木霉xyn3、Fv3A、Fv51A、以及Fv43D。
[0087]在菌株H3A发酵期间产生的细胞外蛋白通过离心从细胞群中分离出来，通过经由 1;[111口0^101^分子截留分子量膜进行的膜超滤进行浓缩，并将口!1调节至4.8。使用 Weichse 1 baum和Gorna 11修改的改性的缩二脲方法测定总蛋白，该方法使用牛血清白蛋白 作为校准物（Weichselbaum，1960，Amer.J.Clin.Path· 16:40;Gornall 等人， 1949J.Biol.Chem 177:752)。这种H3A细胞外蛋白制剂本文称为H3A蛋白，它用作组合纤维 素酶和半纤维素酶制剂，在SSF期间影响络合碳水化合物水解。
[0088] 生物催化剂和种菌制剂
[0089] 用于发酵的运动发酵单胞菌菌株的起源
[0090] 木质纤维素生物质水解产物发酵液可采用另选的生物催化剂产生。以下描述了示 例性菌株。作为替代方案，菌株ZW658，保藏号为ATCC#PTA-7858，可用于制备处理用的木质 纤维素生物质水解产物发酵液。
[0091] 运动发酵单胞菌菌株ZW705产自菌株ZW801-4,其采用US 8 247 208所述的方法， 其以引用方式并入本文，在此简要重述。运动发酵单胞菌菌株ZW801-4的培养物生长在如下 的胁迫条件下。ZW801-4是运动发酵单胞菌的重组的木糖利用菌株，其描述于US 7,741， 119，其以引用方式并入本文。菌株ZW801-4来源于菌株ZW800，菌株ZW800来源于菌株ZW658， 它们均描述于US 7，741，119中。ZW658通过经由序贯转座事件将两个操纵子(PgapxylAB和 Pgaptaltkt)整合到ZW1(ATCC#31821)基因组中，然后通过包含木糖的选择培养基改型进行 构建，所述操纵子包含四个编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的木糖利用 基因。ZW658以ATCC#PTA-7858保藏。在ZW658中，使用宿主介导的基因双交换同源重组和作 为选择性标记的奇放线菌素抗性使编码葡萄糖-果糖氧化还原酶的基因插入失活以产生 ZW800。使用Cre重组酶，通过位点特异性重组移除由ΙοχΡ位点界定的奇放线菌素抗性标记 以产生ZW801-4。
[0092] ZW801-4的连续培养在250ml搅拌的、pH和温度受控的发酵罐（Sixfors; Bottmingen，Switzer land)中进行。发酵基础培养基是5g/L酵母提取物，15mM磷酸铵，lg/L 硫酸镁，10mM山梨醇，50g/L木糖和50g/L葡萄糖。通过在97天中逐渐提高加到上述连续培养 基中的乙酸铵浓度，同时保持通过特定稀释速率测得的确定生长速率来影响在高浓度乙酸 和氨的存在下的适应生长。将乙酸铵浓度提升至160mM。通过加入磷酸铵至在连续培养139 天的末期最终总铵离子浓度为210mM来实现铵离子浓度的进一步提高。通过接种单菌落并 扩增一个选择的菌落来从适应种群中分离菌株ZW705。
[0093] 菌株AR3 7-31产自菌株ZW705,通过进一步改型在玉米棒水解产物培养基中生长， 如U. S. 8，476，048所公开的，其以引用方式并入本文。ZW705生长于恒浊器中（US 6，686， 194;Heurisko USA，Inc ·Newark，DE)，其为连续流动培养装置，其中培养物中的细胞浓度通 过控制培养基到培养物的流动而保持恒定，使得培养物的浊度保持在指定的狭窄限制内。 培养物在连续培养装置中可利用两种培养基生长，一种为静息培养基(培养基A)，一种为刺 激培养基(培养基B)。培养物生长在生长室中的静息培养基上到浊度设定点，然后以设定的 稀释速率进行稀释以保持细胞密度。通过每10分钟加入一次限定体积的培养基来进行稀 释。当恒浊器进入培养基刺激模式时，基于在前一次培养基添加后返回设定点的速率选择 加入刺激培养基或静息培养基。生长室中培养基的稳态浓度为培养基A和培养基B的混合； 根据从各个培养基提取的速率决定两种培养基的比例，其为设定的稀释速率以允许保持设 定的细胞密度。代表生长室中种群的细胞样品以每周的间隔从恒浊器外流液中回收(在捕 获室）。所述细胞样品在MRM3G6培养基上生长一次并在-80°C作为甘油原液保存。
[0094] ZW705生长至一个任意浊度设定点，其表明培养物使用了输入培养基中存在的全 部葡萄糖和大约一半的木糖，以在设定的稀释速率下满足细胞密度设定点。使用静息培养 基以及刺激培养基，静息培养基为50%的HYAc/YE和50 %的MRM3G6.5X4.5NH4Acl2.3，刺激 培养基为HYAc/YEj周后分离的菌株用于另一轮恒浊器改型，使用HYAc/YE作为静息培养基 以及HYAc/YE加9重量％乙醇作为刺激培养基。菌株AR3 7-31在2周后分离，在水解产物培养 基中鉴定为一个具有提尚木糖和匍甸糖利用率以及提尚的乙醇广量的菌株。通过序列分 析，发现AR3 7-31在运动发酵单胞菌基因组开放阅读框中有一个突变，所述开放阅读框编 码具有膜转运蛋白性质的蛋白，并注释为编码镰刀菌酸抗性蛋白。
[0095] 培养基
[0096] 每升MRM3包含:酵母提取物（10g)、KH2P〇4 (2g)和MgS〇4 · 7H20 (1 g)。
[0097] MRM3G6包含的是MRM3，其包含60g/L葡萄糖。
[0098] MRM3G6 · 5X4 · 5NH4Ac 12 · 3是包含 65g/L 葡萄糖、45g/L 木糖、12 · 3g/L 乙酸铵的 MRM3。
[0099] HYAc/YE包含芯水解产物，固体通过离心从其去除并过滤灭菌，其包含68g//L葡萄 糖，46g/L木糖和5g/L乙酸盐，补充有6.2g/L乙酸铵和0.5 %酵母提取物，调节至pH5.8。 [0100] 木质纤维素生物质处理和发酵
[0101] 将玉米秸杆研磨至3/8〃（0.95〇11)。在140°(：下用14%順3和65%固体预处理6011^11。 在47°C和pH 5.3下用7.8mg/g葡聚糖+木聚糖的酶聚生体糖化96小时。糖化酶为在如上所述 里氏木霉菌株H3A中表达的纤维素酶和半纤维素酶的混合物。所得的水解产物用于发酵。将 10mM山梨醇添加至水解产物中以制备发酵培养基，并将pH调节至5.8。
[0102] 对于种子，使第一冷冻菌株运动发酵单胞菌AR3 7-31原液在33°C下于MRM3G6 (10g/L BBL酵母提取物、2g/L KH2P〇4、lg/L MgS〇4*7H20、60g/L葡萄糖)上生长8小时而不摇 动，作为再生培养基。用再生培养基接种MRM3G10培养基（如同MRM3G6但具有100g/L葡萄 糖），并在摇动下于33°C孵育14-16小时。生长为1.5至3.1的OD600。使用整个培养基来接种种 子发酵罐至约0.05的初始OD 600。
[0103] 在lOg/1 酵母提取物、2g/L KH2P〇4、5g/L MgS〇4*7H20、10mM山梨醇和 150g/L葡萄糖 中进行种子发酵。在33°C和pH 5.5下进行种子发酵。在首次观察到葡萄糖减少至小于50g/L 后收获种子，使用YSI 2700SELECT?生物化学分析仪（YSI Life Sciences;Yellow Springs，0H)测定葡萄糖。
[0104] 在发酵罐中，将种子添加至水解产物培养基中。使发酵在30°c-33°c下进行48-72 小时。
[0105] 木质纤维素糖衆
[0106] 蒸馏发酵液以回收乙醇并过滤剩余的全塔馏物。使液体镏分通过蒸发器以除去塔 顶水，并且产生糖浆。
[0107] 实施例1
[0108] 由研磨的石灰石和木质纤维素糖浆制备石灰石丸粒
[0109] 将开采自采石场(Weeping Water，Nebraska)的生石灰石碾磨成细粉并且气动地 进料至转鼓中。在转鼓旋转时，将由木质纤维素生物质乙醇制备过程制得的糖浆(参见一般 方法)喷入到填充有经研磨石灰石的转鼓中。按照经研磨石灰石和糖浆的总重量的2重量％ 至10重量％来使用糖浆制备批次。将所得混合物进料至干燥器中并使所得丸粒冷却并硬 化。使石灰石粉末在所得固体丸粒中保持在一起，几乎没有粉状物质。
[0110] 实施例2
[0111] 由研磨的石膏和木质纤维素糖浆制备石膏丸粒
[0112]将开采自采石场(Fort Dodge，ΙΑ)的生石灰石碾磨成细粉并且气动地进料至转鼓 中。在转鼓旋转时，将由木质纤维素生物质乙醇制备过程制得的糖浆(参见一般方法)喷入 到填充有经研磨石膏的转鼓中。按照经研磨石膏和糖浆的总重量的2重量％至10重量％来 使用糖浆制备批次。将所得混合物进料至干燥器中并使所得丸粒冷却并硬化。使石膏粉末 在所得固体丸粒中保持在一起，几乎没有粉状物质。
【主权项】
1. 一种农用组合物，所述农用组合物包含： a) 木质纤维素糖浆;和 b) 至少一种土壤调理物质。2. 根据权利要求1所述的农用组合物，其中所述糖浆是由木质纤维素生物质制备醇的 过程的联产品。3. 根据权利要求1所述的农用组合物，其中所述糖浆包含： a) 约40 %至约70 %的固体； b) 约10g/l至约30g/l的乙酰胺;和 c) 至少约40g/l的糖； 其中所述纤维素糖衆具有约lg/cm3至约2g/cm3的密度和在100°F(38°C )下小于500SSU 的粘度。4. 根据权利要求2所述的农用组合物，其中所述由纤维素生物质制备醇的过程使用氨 来预处理所述木质纤维素生物质，并且所述糖浆包含至少约5g/l的氨。5. 根据权利要求2所述的农用组合物，其中所述木质纤维素生物质选自玉米棒、玉米秸 杆、草、小麦秸杆、大麦秸杆、干草、稻杆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱植物材料、大豆植物材 料、木本植物、蔬菜、水果、花、棕榈空果串、以及能源甘蔗。6. 根据权利要求1所述的农用组合物，其中所述至少一种土壤调理物质选自石灰、石 膏、以及它们的组合。7. 根据权利要求1所述的农用组合物，其中所述至少一种土壤调理物质为粉末形式。8. 根据权利要求1所述的农用组合物，其中所述糖浆按所述组合物的重量计为约2%至 约 20 %。9. 根据权利要求1所述的农用组合物，其中所述组合物为丸粒或颗粒形式。10. -种用于制备农用组合物的方法，所述方法包括使根据权利要求1所述的木质纤维 素糖浆与至少一种土壤调理物质结合，其中产生包含所述糖浆和所述调理物质的丸粒或颗 粒。11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述糖浆是由木质纤维素生物质制备醇的过程 的联广品。12. 根据权利要求10所述的方法，其中所述糖浆包含： a) 约40 %至约70 %的固体； b) 约10g/l至约30g/l的乙酰胺;和 c) 至少约40g/l的糖； 其中所述纤维素糖衆具有约lg/cm3至约2g/cm3的密度和在100°F(38°C )下小于500SSU 的粘度。13. 根据权利要求10所述的方法，其中所述土壤调理物质选自石灰、石膏、或它们的组 合。14. 根据权利要求10所述的方法，其中在转鼓中将所述糖浆喷洒到所述土壤调理物质 上。15. 根据权利要求10所述的方法，其中对所述丸粒或颗粒进行干燥。16. 根据权利要求10所述的方法，其中以约1:50至约1:5的比率使所述木质纤维素糖浆 与所述土壤调理物质结合。17.-种用于调理土壤的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的农用组合物施用 于土壤。
【文档编号】C05G3/00GK105980336SQ201480067310
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2014年10月10日
【发明人】S.W.奥格勒, S.C.维拉卡斯, D.W.伍德
【申请人】纳幕尔杜邦公司