专利名称：藏红花的提取物具有改善脑机能的功能的制作方法
痴呆症是高龄人口增加、社会面临最大的问题之一。现在世界上约有痴呆症患者500多万人。痴呆症主要是脑血管的梗塞和脑细胞死亡，导致不可逆记忆，认识、判断的脑机能障碍。在临床表现为早期仅是健忘，以后是进行性智力缺损和人格障碍。病理表现脑神经回路的障碍和神经细胞死。神经细胞与一般细胞不同，成熟的细胞不能分裂再生，神经细胞一旦死亡则不能再生，目前临床尚无特效的治疗方法。因脑神经死后不能再生，脑神经障碍治疗的对策，应以予防用药为主。特别是成人40岁以后，有初期症状时(易健忘等)应开始使用予防用药。
近年发达的国家投入大量人工费用用于开发抗痴呆症药。市场上多是化学合成药剂，但长期间用药后会有各种付作用和耐药性。本发明在数十种中药中筛选，目的是发现改善脑神经功能植物提取药物和予防药。研究用动物学习试验和电击性损伤和胚胎神经的再生试验、作了大量动物试验和神经细胞试验。发现了这一无付作用、有改善脑神经功能和修复脑神经的重要作用。
本发明用天然植物藏红又称番红花，(Crocus Sativus L.，英文名saffron)。藏红花属菖蒲科多年草本植物。每年10月至11月开花。产地在欧洲、印度和中国。中国的藏红花的资源主要在中国的西北、西南部。中国是藏红花重要的产地之一。藏红花的应用在欧洲的史书、我国的[汉书]和[本草纲目]中已有记载。公元前1700年西班牙的史书上记载藏红花作为医药品、化妆品、及染料等方面使用。在14世纪欧洲作为万能药使用。中国传统医学在13世纪已有记载。藏红花是治疗妇科病中药如月经不调及产后引起的不安、恍惚、忧郁等病。但藏红花不能用于妊娠期间。藏红花长期以来在中药方面用于妇科病、药膳，也在食品香味料、着色料、等药食品及观赏用。但作为抗痴呆药品尚未被人知。
藏红花成本相当高，1公斤藏红花的原料大约要采集用40万株植物、产量极低。现日本藏红花年约产500kg，输入藏红花约1600kg，中国的藏红花主要把原料出口。日本的约理记载欧洲产的藏红花有小毒。日本利用我国的大量的原料，分离提取有效成分，损失了我国的大量的重要资源。
本发明目的是使用藏红花的雌蕊用酒精油抽出的藏红花素的有效成分为脑机能改善剂。用于予防，治疗痴呆症及脑神经的障碍。
1)藏红花素提取是采集藏红花第一天开花的雌蕊，用50％的酒精(酒精∶纯水＝1∶1)经一夜浸泡，滤出液体，同样方法进行反复3次，以后将液体进行低温干燥、用生理盐水溶解后使用。可对脑神经血管性患进行治疗。提取藏红花的成分用第二天后开花的雌蕊也有作用，但有効活性成分较低。单用藏红花(原料)则无此项功能。藏红花的雄蕊也无此项功能。
2)分子式中的物质是提取物主要成分为藏红花素，(C44H64O24)。也含有以下的组合物，如crocetin，crocetin dimethylester，等成分。一般式中R1与R2的组合物的有効成分可为神经细胞分化的促进剂。
3)藏红花素主要是植物色素为食品着色料，也在抗氧化剂等方面上使用，没有付作用。
4)藏红花素可改善对脑代谢异常引起的脑记忆減退和脑机能障碍。如抗老年性痴呆症、抗健忘症、抗痴呆、抗阿尔海黙氏病及巴金森氏综合症的药物。本发明的化合物及组合物含有活性的物质，在医药方面可使用在抗忧郁、抗不安剂、抗痴呆剂；也可以用在抗炎症剂、抗过敏剂、抗喘息剂、肝保护剂、利尿剂等方面。
5)藏红花素对酒精的过剩摄取引起的学习记忆障碍有効果。
6)藏红花素对学习记忆的密接关系的海马细胞长期增强的抑制作用有改善効果。作为脑机能改善剂的成分Crocetin对海马长期增强抑制作用有依存性用量的改善的効果。
7)藏红花素对电击性的产生的记忆固定及记忆再现障碍有改善効果。
8)藏红花素与amygdalin杏仁的抽出物的有効成分并用是安全性高，具有脑神经细胞保护作用的脑机能改善剂。
9)藏红花素是神经细胞分化促进剂。还可应用在神经细胞保护剂和末梢神经障碍的治疗。
10)藏红花素与人参的抽出物的有効成分并用是安全性高，具有脑神经细胞保护作用的脑机能改善剂。
11)藏红花素与大蒜的提取物并用是安全性高，具有脑神经细胞的保护作用的脑机能改善剂并有抗老年性痴呆的作用。
12)藏红花的水的提取物，持有香味，不产生混浊，可作为藏红花的饮料。
13)藏红花的溶媒的提取物含有酸化防止剂的成分。
14)藏红花素可在医药与食品上应用。医药方面有多种制药方式可制成散剂、颗粒、片剂、糖衣片、注射等剂型。投药途径既可经口投药、非经口投药或吸药、鼻腔内吸入、也可经直投药、局部投药也可皮下注射、脑室注射、静脉注射、筋肉注射等方式。用量，一般一日5-500mg/kg体重的范围以内。通常1日1-5回投药。但正确的使用量，应视患者的年龄、体重、症状、投药方法等考虑，如前记范围内所決定。
15)藏红花素在食品应用方面可制作成，糖、果冻、点心、饮料等。
实施例1提取方法干燥雌蕊藏红花100g，用30-100％的酒精，一夜浸泡，滤出液体、反复操作3回，经过浓缩干燥，用生理盐水溶解后使用。100g的原料用50％的酒精、在500ml液体中一夜浸泡，反复操作3回，最多可得藏红花素33g的提取物。
实施例2在试验中投与酒精和藏红花素进行评价通过step thought(ST)和step down(SD)回避学习试验、测定动物对能对新环境的学习能力。
1)对小白鼠被动的回避学习効果的试验Step Thought(ST)学习实验装置由明室和暗室连结(小原医科产业制Model PA-M1)构成。其装置导入小白鼠由明室后进入暗室，入时暗室有36V的电击的装置。动物由明室动物进入暗室，受到电击后。测定受到电击后到为止缓解的反应时间。
第1日的试验前30分，和第二日试验前30分给小白鼠经口投与藏红花素。此外投与酒精后10分投与藏红花素。对受到电击的时间反应时间进行测定。反应时间超过44秒以上除外试验。试验在第二日后再行试验。根据反应时间用5分的时间。第二日的再次试验，对反应的时间，和末进入暗室的个体数，及学习个体数进行评价。
2)小白鼠step down(SD)回避学习试验利用「台上是安全的场所」的逆试验试验台用(10×15×40cm)装置。SD方法是小白鼠对新环境的记忆学习过程的体验。试验用台上与台下相連的实验装置，台上安全，台下有电压60V的装置。第一日使小白鼠在试验台上探索，受到电击在5分以内进行测定。第二日再次试验。试验进行3分，在此时间内对小白鼠降到台下的回数和末降到台下的小白鼠进行测定。加用藏红花素后测定动物对新环境学习记忆的有无后进行评价。
3)给试验小白鼠投与酒精和藏红花素；进行ST和SD试验小白鼠投与藏红花素和30％酒精，以小白鼠受动回避学习为指标，判断酒精性惹起作用的効果。同时用藏红花抽出的藏红花，将小白鼠用酒精灌入促使酒精中毒，产生药物性健忘，测定藏红花素的对酒精过剩的効果。
抽出藏红花素对单独记忆获得的作用，30％-40％酒精投与记忆获得的试验。各组用12匹用小白鼠实验进行，所得实验結果，用Mann-Whitney’sUtest进行有意差的统计学核定。还对ST学习个体数(％)用Chi-squsaretest状况和对SD失败数Duncan’s multiple test的有意差的统計学検定。(
图1)用藏红花素对单独记忆获得的ST试验反应时间的图表。(图2)用藏红花素对单独记忆获得的ST试验学习个体数的图表。(图3)末使用藏红花素对单独记忆获得的SD试验失败数的图表。(图4)使用藏红花素对单独记忆获得作用SD试验学习个体数的图表。以上图1，4，LT是第一日获得試行，TT是第二日再现试行，Scop(scopolamine)，※P＜0.05 vs.对照组，※※P＜0.01 vs.对照组。(图5)投与30％酒精后对使用藏红花素的ST试验反应时间的图表。(图6)投与30％酒精后对使用藏红花素的ST试验学习个体数的图表。(图7)投与30％酒精后、末使用藏红花素的SD试验失败的图表。(图8)投与30％酒精后对使用藏红花素的SD试验学习个体数时的图表。以上图5 8，LT为第一日获得试行，TT为第二日再现试行，scop为加用scopolamine，※P＜0.05 vs对照组，※※P＜0.01 vs对照组，#P＜0.05 vs单独用酒精。(图9)投与40％酒精后对使用藏红花素作用的ST试验反应时间的图表。(图10)投与40％酒精后对使用藏红花素的ST试验学习个体数的图表。(图11)是投与40％酒精后末用藏红花素的SD试验失败数的图表。(图12)是投与40％酒精后对使用藏红花素的SD试验学习个体数的图表。以上图9 12，LT第一日获得試行，TT第二日再现试行，Scop＝scopolamine，※P＜0.05 vs对照组，※※P＜0.01 vs对照组，#P＜0.05 vs酒精单独，##P＜0.01 vs单独投与酒精。
酒精经口投与长期增强抑制効果高频度刺激适用30分前经口投与藏红花素溶液在10分后以10ml/kg投与30％酒精。结果藏红花素可改善酒精投与后的记忆再现障碍。
大白鼠海马长期增强効果试验用8-9周令雄性Wistar系大白鼠，用Urethan-Chloralose麻醉，经口将聚己稀的胃管插入后，用脑固定装置器将脑固定。通过双极电极，在嗅内皮质贯通纤维对海马长期增强进行每30秒间隔0.8m秒的电刺激，用60Hz-30频度诱发，同时在海马齿状回的颗粒细胞层细胞外进行电位记录。刺激强度，以最大刺激约50％进行反应设定，诱发电位安定后，投用藏红花素溶液。高频度刺激诱发电位后进行60分间记录，诱发电位的增强率进行计算。高频度刺激适用后，用59分到60分止计算面积(AUC)和积分。后进行Duncans’multiple rangetest有意差的检定。
(图13)是●250mg/kg的藏红花素经口投与、△藏红花素以250mg/kg+30％酒精经口投与、○单独投与30％酒精的結果。
(图14)※※P＜0.01 vs为对照组，##P＜0.01 vs酒精单独投与为对照组(n＝9)、30％酒精单独(n＝8)抽出藏红花素125mg/kg经口投与+30％酒精10ml/kg、(n＝5)藏红花素250mg/kg+30％酒精10ml/kg经口投与(n＝11)。酒精侧脑室投与长期增强抑制効果高频度刺激适应后30分前经口投与藏红花素，20分后测定，对侧侧脑室投与的結果(投与量30％酒精5μl)。
(图15)●是250mg/kg的藏红花素经口投与、△藏红花素250mg/kg+30％酒精经口投与、○单独投与30％酒精的結果。
(图16)※※P＜0.01 vs是对照组，##P＜0.01是酒精单独对照组、(n＝5)。##P＜0.01 vs酒精单独投与、对照组(n＝9)、30％酒精单独(n＝8)、藏红花素250mg/kg经口投与+30％酒精10ml/kg经口投与(n＝5)、藏红花素500mg/kg经口投与+30％酒精10ml/kg经口投与(n＝11)。
結果藏红花素可改善电击后记忆固定的再现障碍、可改善酒精(经口，静脉，脑室内投与的海马抑制、可改善酒精(经口，静脉，脑室内投与的对海马抑制。实施例3动物急性毒性试验急性毒性经口投与Wistar雄性大白鼠试验，以3000mg/kg口服(为有効量的1000倍)无一例死亡，动物可自然摄食，证明藏红花中的藏红花素是没有付作用或极少有付作用的脑机能的改善剂。实施例4
1)脑神经细胞再生试验和修复试验用激光刀切断胚胎脑神经细胞，造成脑机械性损伤模型，研究藏红花素的修复作用和机能。后添加藏红花素，可对胚胎神经细胞进行评价。评价方法1)脑神经细胞突起的数量，2)轴索的长度，3)树状突起的长度，4)轴索的分枝数量，5)轴索周边的分枝的长度，6)激光切断点的神经细胞体近处的分枝长，7)神经细胞体的数量，8)细胞体相关的突起长度。
2)方法脑神经细胞单离和培养方法。用妊娠18日的Wistar系大白鼠的胎儿的脑组织。动物用乙醚麻醉、用无菌方法将脑取出，分离海马组织后进行细切。用0.25％ trypsin含Magnesium，Calcium freephosphate-buffered saline(PBS)，酶处理后，37℃，20分共2回，用酶液和等容的马血清加入使trypsin失活，远心1200rpm，5分使组织分离。单离的细胞在灭菌mesu(φ＝43μm)2枚上进行细胞过沪。用0.3nigrosine染色计算活细胞数。将单离细胞用培养液A液(加10％牛胎児血清)，细胞浓度调整为2500 cells/ml，用24小时37℃培养后；用无血清培养液B液交换24小时培养、(AB液均含Eagle’s MEM Nissui7.24mg/ml glucose 8.20mg/ml L glutamine 0.29mg/ml NaHCO3 1.70mg/mlsodium pyruvate 99.00mg/ml，human transferrin 5.00μg/ml bovineinsulin 5.00μg/ml progesterone 20.00nM，transferrin，insulin，progesterone)。以上两种方法培养分两组；一是poly-L-lysine conting35mm dish培养和切片上培养(2500 cells/cm2)。
3)神经观察在培养液B交換24小时后，用ACAS work station选择有突起形成的神经细胞，其位置用电脑记录。在药物添加前，添加后，24小时及48小时以后将同一细胞进行摄影和记录，测定。各组选择细胞各用25、30个，48小时后再测定为生存细胞。
4)ACAS(adherent cell analysis system)470 Work Station ACAS由用电脑，显微镜，激光系统3个部位构成。电脑付加的显微镜进行观察和记录及控制视野。激光系统(488nm)搭载，激光强度部分测定神经细胞损伤和修复的程度。
5)用培养液B交換后24小时选择细胞，摄影后，将神经突起成长部位用円錐基部激光刀切断。激光强度用40mW，AOM为35％。切断后马上进行药物添加，24及48小时后同一细胞的摄影，直接摄影后测定形态参数。本实验将48小时后死亡细胞除外。(图17)由细胞体始到激光刀止的轴索长度(□对照，■用药后效果)(图18)切断点开始的再生轴索的长度。(图19)激光切断点再生部分的分枝长。(图20)切断点开始的细胞体近处的分枝数量。(图21)激光切断点的神经细胞体近处的分枝长。(图22)一个细胞相当的树状突起的数量。(图23)一个神经细胞的树状突起的在无添加和添加藏红花素物质后48小时后的像片。(图24)神经细胞的轴索切断后在添加藏红花素物质后24，48，72小时后的轴索的长度的像片。
权利要求
1 从天然植物藏红花当日开花抽出的雌蕊，用50％的酒精浸泡后提取，浓缩干燥，其有効成分主要为藏红花素。
2 权利要求1的提取方法及藏红花素的化学结构(下图)、也包含以下任何一个化学形式的组合物，crocetin，crocetin dimethylester，crocose和croconic acid，藏红花素，藏红花醛，藏红花酸等是脑机能的改善剂。
3 藏红花素有改善脑机能的作用、可用于痴呆症，健忘症的治疗。
4 权利要求2可以对记忆学习密切的关连的海马长期增强的抑制进行改善。
5 权利要求2有改善脑血管循环障碍及脑机能的作用，可治疗痴呆症，改善脑梗塞后遗症，也有提高学习能力和记忆力等作用。
6 要求2中的成分含有神经营养因子样的活性，可促进胚胎神经的可塑性成长，促进神经突起与分枝的形成及促进神经回路形成，有神经再生修复的作用，可以作为脑机能障碍的予防用药及治疗用药。
7 权利要求2予防摄取过多酒精过多而导致记忆低下的作用。
8 权利要求2有改善外伤引起的记忆固定及记忆再现障碍的効果。
9 权利要求2的成分安全性强，没有付作用或极少有付作用及耐药性，给药方式有多种，可口服、静脉、肌肉注射及侧脑室给药。
全文摘要
用植物藏红花(又称番红花)的当日开花的雌蕊,在50%酒精提取的有效成分为藏红花素等物质具有抗痴呆症、抗健忘症及改善脑机能的作用,对记忆学习的密接关系的海马长期增强的，效果。藏红花素也有神经营养因子样的作用。可以修复脑神经的损伤。藏红花素的安全性强,没有副作用或极少有副作用和耐药性。给药方式有多种,可口服、静脉注射、肌肉注射及侧脑室给药。
文档编号C07C67/00GK1347868SQ0013043
公开日2002年5月8日 申请日期2000年10月8日 优先权日2000年10月8日
发明者程锦雁 申请人:程锦雁