专利名称：微生物补料分批培养生产肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及在含培养基(含有有机碳源、氮源和无机盐)的生物反应器中，通过微生物补料分批培养生产重组肽的方法。该培养通过波动补料添加有机碳源和/或通过搅拌速度的波动变化，例如以方波(square)方式或正弦波(sinus)方式来进行。该有机碳源优选葡萄糖，该重组肽优选生长激素。
背景人重组蛋白已经成为重要的药物。重组DNA技术和大规模生产的结合已使那些不可能或因过于昂贵而无法从天然来源获得的蛋白的生产成为可能。例如，通过重组DNA技术，人生长激素(hGH)、免疫干扰素、组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)和人胰岛素现在都有市售。
然而，在大规模生物生产中，生物体要暴露在不断改变的环境中并要对此作出反应。已发现，当增加反应器大小时，重组蛋白生产方面的差异。例如Riesenberg D等(应用微生物生物技术，1990，3477-82)表明，当培养体积由15L增加到250L时，人干扰素α1的数量减少一倍。
当生物生产按比例扩大时，可能在微环境，例如浓度和梯度，方面会有差异。由于几何和工艺参数的改变以及进料位置的选择，预计会出现底物(例如在限制补料(补料分批)中添加的碳源，用于pH滴定的氨水和氧气)的浓度梯度。大部分生物体会对快速环境变化作出反应并可以在几秒或更少的时间内改变它们的新陈代谢。
以前已经研究了在发酵罐中，脉冲添加葡萄糖和波动葡萄糖浓度对产量和表达的影响。
脉冲添加葡萄糖，即当培养达到稳定期时，在几秒钟之内添加葡萄糖会极大并非常迅速地诱导gapA基因的表达(Gschaedler，Anne等，生物技术生物工程，1999，63(6)712-720)。
已经有人研究了在发酵罐中波动葡萄糖浓度对生物量产量和醋酸盐形成的影响。结论是，当在发酵罐中对大规模培养和小规模培养进行比较时发现，细胞对葡萄糖波动的反应引起了较低的生物量产量和较高的醋酸形成(Bylund，F等，生物生产工程，1999，20(5)377-389)。
在补料分批培养期间，在恰当的时间间隔内(使得在两个连续的脉冲之间可以有明显的饥饿期)脉冲添加生长底物(葡萄糖)对稳定质粒和增加蛋白生产有正向效果(Cheng，Chinyuan等，生物技术生物工程，1997，56(1)23-31)。在约6小时的间隔内，重复进行脉冲添加4-5次。结果表明，此阶段性葡萄糖饥饿补料策略可以保持稳定的携带质粒的细胞比例和保持重组蛋白的稳定的比生产率。相反，在补料分批培养期间，没有葡萄糖饥饿，携带质粒细胞的比例和比生产率将持续下降，从而极大地减少产品产量并限制培养有效操作的持续时间。
Wang，Zhengjun等(生物技术生物工程，1993，42(1)95-102)已经表明，在YPD(富营养复合培养基)分批培养的末期，葡萄糖脉冲有利于残留胞质转化酶的运输。
美国专利5912133公开了一种补料分批培养法，其中碳源浓度保持在5g/L以下的低水平并且至少在两次补料中添加了碳源。在第一次补料之后及在第二次补料之前，碳源应该用尽。
在细胞培养器中，使用周期性变化的外部磁场并产生搅拌运动也是已知的方法。(DD271850)。从而使导入的材料能够分布均匀以防局部浓度过高造成损害。
没有一个报告公开过有机碳源以方波方式或正弦波方式重复的波动，其特征在于振幅和频率。相反，从现有技术我们可以得出这样的结论，在两个连续补料之间，应该有个明显的饥饿期(Cheng等)，或葡萄糖脉冲仅应该在分批培养末期进行(Wang等)。
达到高细胞密度的最常用技术是葡萄糖限制的补料分批培养。在补料分批生产过程中，所有的培养基组份(除了例如碳源)就象在分批生产过程中的那样都过量。以底物溶液(经常是葡萄糖)向生物反应器中补料，其速率确保该底物成份是生长限制。该底物限制可以控制生长速率和糖的摄入。通过限制糖的摄入并因此限制反应速率，可以避免工程局限性，例如过量散热和氧气限制。葡萄糖摄入可被分成三个反应，用于合成代谢的葡萄糖、用来维持细胞的日常需要的葡萄糖消耗和用于生长的葡萄糖消耗。最后两个反应的产率接近1.07go2g-1sugar。因此生长速率控制可用于控制与生长关联的氧气消耗和热生成。此外，底物限制可用来进行代谢控制，由此可避免溢流(overflow)代谢(即如在大肠杆菌中的乙酸盐的形成)和代谢副产物抑制。在面包业的酵母生产过程中，整个加工过程都使用糖限制以避免导致过量乙醇产生的溢流代谢(George等，生物生产工程，1998，18135-142)。以同样的方法避免了大肠杆菌抑制性乙酸盐的生成(参考例如Lee，S.Y.，生物技术趋势，1996，1498-105)。
在重组蛋白的生产中，氧转移和溶氧张力对产品的产量和质量都是非常重要的(参照例如Bhattacharya和Dubey，微生物酶学技术，1997，20355-360)。因此，当在大肠杆菌中设计高细胞密度生产时，补料分批生产通常是第一选择。附1为操作模式图2为按标准计算的rhGH的百分量。图3为rhGH突变体的百分量。
本发明我们非常惊讶地发现，在补料分批培养中，当葡萄糖补料以波动补料和/或搅拌速度的方式改变时，可以提高rhGH的质量和产量(即减少不想要的产品)。此处所用的波动这个词可被描述为脉冲或进行上下移动。
本发明涉及在含培养基(含有有机碳源、氮源和无机盐)的生物反应器中通过微生物补料分批培养生产重组肽的方法。这也包括复合培养培养基。
按此表述，微生物培养是指生物学宿主，例如细菌、酵母或动物细胞，的培养。
该培养通过以波动补料添加有机碳源和/或通过搅拌速度的波动变化来进行。该波动补料和/或搅拌速度的波动变化可在整个培养过程中或在重组蛋白诱导后的生产阶段进行。该波动补料可以是方波方式的或正弦波方式的。在波动期不应该有饥饿产生。添加的葡萄糖为细胞所消耗，但是要直到完全饥饿的时候才被细胞所消耗。在此过程中，该碳源永远都不应该被耗尽，并且在培养过程中也不需要测量其浓度。在培养过程中，细胞浓度应该很高，优选10g/L以上，更优选20g/L以上，更更优选为50g/L以上。无论如何，应该保持有氧条件。
本实验中，生物量浓度在40g/L这个级别。
有机碳源优选葡萄糖，重组肽优选生长激素。
本领域的技术人员可以很容易地测定出每种蛋白、培养类型、培养基等的波动曲线的周期时间。波动时间的周期可以是，例如此处所举例的那样短至1分钟，但长至5、10、30分钟或更长的周期也在本发明的范围之内。
此幅度可在约±5％到±100％之间变化，例如±20、±30、±40、±50或±60％，其也可由本领域技术人员轻松测定。
波动周期可由恒定葡萄糖添加或恒定搅拌速度的周期所阻断。
此处的葡萄糖添加是以方波函数来加以阐述的。正弦波函数特别适合于搅拌速度。而且，也可以在正弦波和方波之间变换。
按本发明所述，碳源和氧气的浓度分别随补料和搅拌的波动按比例变化。
已利用在有氧补料分批培养方法中生产人重组生长激素(rhGH)作为模式系统，具体研究了底物补料对由大肠杆菌产生的重组蛋白的质量的影响。
我们的发明及该发现在Bylund、Castan、Mikkola、Veide和Larsson；生物技术与生物工程，2000，69(2)119-128一文中得到了进一步的印证。
材料与方法生物体和培养基大肠杆菌(W3110)(含有编码人重组生长激素和抗生素抗性的pBR衍生质粒)被用于此培养。该rhGH形式为由191个氨基酸组成的、有两个分子内二硫键的22kDa蛋白。该蛋白被分泌到周质并在那形成二硫键。
在葡萄糖无机盐培养基中进行培养。所用的培养基Forsberg G等，生物化学杂志，1997，27212430-12438一文中有述(稍有修饰)。
培养基成份和蒸馏水一起在生物反应器中于121℃灭菌。灭菌之后，分别加入灭过菌的硫酸镁、微量元素和抗生素。Breox可在需要进行泡沫控制时加入。补料液的葡萄糖浓度为590g/l。
培养过程与生物反应器从种子罐中将指数生长的细胞转入生产生物反应器。接种体积为最终总体积的10％。转移步骤之后立即开始进行葡萄糖的补料。补料方案由三个不同的阶段组成首先为指数补料期；然后当达到估计的生物反应器的最大通氧能力时，补料转为恒定速率；最后在诱导时补料速率降为其最大值的80％。
葡萄糖添加以方波函数进行，其与标准补料相叠加，如
图1所示。
将温度和pH控制到接近大肠杆菌生长的最适值。
所有的培养均在151 CF 3000 Chemap-Fermenter(瑞士)搅拌罐反应器(STR)中进行，起始体积7L。在补料期期间体积增加至9L。
分析方法5ml细胞悬液离心后，获得的菌体部分进行抽提，得到用于产品分析的样品。该抽提方法将周质部分的蛋白释放出来。离心在+4℃、5000rpm进行，离心15分钟。抽提缓冲液(/L)由Tris-HCl，0.9837g；Tris-base，0.4551g；EDTAx2H20，0.372g组成。rhGH的纯度和量由疏水作用层析(HIC)进行测定。HIC以TSK苯基5PW柱(Tosoh Haas)进行。四种不同的rhGH突变体被逐渐下降的盐梯度分离开，并以紫外线在230hm处检出(des-Phel)-rhGH(LMW)、rhGH、(三硫化合物Cys182-Cys189)-rhGH和缺失142/143-rhGH(缺失突变体)。
结果结果如图2和3所示。
在图1-3中，rhGH由以下方法产生(a)标准方法，(b)振幅为标准值的±30％和频率为1分钟的方波方式的葡萄糖补料，(c)标准的葡萄糖补料，但其搅拌分布图(以800-1200rpm的速率)为振幅±20％和频率1分钟的方波。
图2表明了用不同方法制备rhGH时，rhGH的量。
从该实验中我们可以清楚地看到，当以波动补料及搅拌速度波动变化的形式添加葡萄糖时，rhGH的量要高的多。
图3表明了rhGH 22kDa总量的百分比，即在使用(a)、(b)和(c)的方法时正确形式的rhGH(黑色)和缺失突变体(白色)的量。我们可以看出，当葡萄糖被以波动补料及搅拌速度波动变化的形式添加时，正确形式的rhGH(即22kDa)的产量更高。
结论葡萄糖补料策略或搅拌分布方式的最优化(使用方波或正弦波波动)在与有机原料未以波动补料的形式补加时相比，具有更高的蛋白产量、在更高的水平上避免蛋白水解及由此的纯化更容易进行的优点。
权利要求
1.在含有有机碳源、氮源和无机盐的培养基的生物反应器中，通过微生物补料分批培养生产重组肽的方法，其中该培养通过波动补料添加有机碳源和/或通过搅拌速度的波动变化来进行。
2.权利要求1所述的方法，其中该有机碳源为葡萄糖。
3.权利要求1或2所述的方法，其中该微生物为大肠杆菌。
4.权利要求1到3中任何一项所述的方法，其中该波动补料为方波方式。
5.权利要求1到3中任何一项所述的方法，其中该波动补料为正弦波方式。
6.权利要求1到5中任何一项所述的方法，其中该重组肽为生长激素。
7.权利要求1到6中任何一项所述的方法，其中该重组肽为人生长激素。
全文摘要
本发明涉及在含培养基(含有有机碳源、氮源和无机盐)的生物反应器中，通过微生物补料分批培养生产重组肽的方法。该培养通过波动补料添加有机碳源和/或通过搅拌速度的波动变化(例如，以方波方式或正弦波方式)来进行。该有机碳源优选葡萄糖，该重组肽优选生长激素。
文档编号C07K14/615GK1409755SQ0081688
公开日2003年4月9日 申请日期2000年11月29日 优先权日1999年12月9日
发明者A·卡斯唐 申请人:法马西雅公司