专利名称：重组 trail 包含体蛋白的工业化提取、复性和纯化方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体发明涉及一种重组TRAIL包含体的工业化提取、复性及其纯化方法。
背景技术：
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand，简称TRAIL)是新近发现的TNF家族成员之一，又称凋亡素二配体(apoptotin 2 ligand，Apo-2L)。1996年，Pitti首先分离和鉴定了TRAIL及其诱导的凋亡，发现人TRAIL基因定位于染色体3q26，分子量为32.5kD，等电点7.63，是由281个氨基酸组成的蛋白质，在转染的细胞株中以II型跨膜蛋白的形式表达在细胞表面，称膜结合型TRAIL。可溶性部分为第114-281位氨基酸，分子量为24kD左右，约在48kD处形成二聚体，三聚体大约为66kD。其发挥功能的部位主要位于胞外，生物学活性形式是具有亮氨酸拉链三聚体结构的膜结合形式或是带有交联抗体的重组蛋白。
TRAIL能够选择性诱导肿瘤细胞凋亡而末发现明显的毒副作用，在肿瘤的治疗中具有良好的前景。Walczak和Ashkenazi等人的预临床研究在鼠和猴子身上取得了良好的治疗效果。无论是TRAIL单独治疗还是与化疗药物合用，均取得了与细胞株一致的结果，引起肿瘤的退化，生长变慢，甚至出现肿瘤消失现象，没有严重的副作用。随着研究的深入，人们发现TRAIL在病毒诱导的细胞凋亡和一些肿瘤病毒抑制细胞凋亡的过程中起到重要的作用，也在抗病毒免疫和肿瘤药物治疗的过程中扮演重要的角色。
重组DNA技术的发展使许多稀有的人源药物蛋白的大规模生产成为可能。这些蛋白中许多天然形式是非糖基化的，而且非糖基化蛋白比起糖基化蛋白已显示出更卓越的医疗优势。因此，医疗上许多重要的蛋白都由大肠杆菌生产。第二军医大学王梁华等人利用大肠杆菌表达重组人TRAIL已经取得成功，并对其进行了发酵和可溶性部分的初步分离纯化研究(第二军医大学学报，2001；23(3)248-251)。然而，大肠杆菌体系表达的重组蛋白通常是以没有活性的包含体的形式产生的，使这些没有活性的包含体复性成为有活性的形式是世界性的技术难题。采用大肠杆菌作为表达体系常见的生产工艺路线为大肠杆菌发酵→包含体洗涤→包含体复性→目的产物纯化，其中包含体复性通常在实验室中采用0.01-0.1mg/ml以下的低蛋白浓度条件下完成，其结果是复性效率低，生产成本高，难以放大形成生产规模。北京大学基础医学院王新娟等人(北京医科大学学报，2000；32(5)387-390)对人TRAIL在大肠杆菌中的克隆表达及其生物活性作了初步研究，并对包含体进行了初步的复性，但并未对其复性结果进行结构上的鉴定，复性是否完全和收率并未做任何说明，且只限于实验室方法。从基因工程产业化发展的角度看，目前包含体复性生产技术急需研究的问题是如何在高蛋白浓度和工业化生产规模时，实现高效复性；换句话说产业部门希望有关的工程技术人员提供一种简便的TRAIL包含体的工业化提取方法，以及在高蛋白浓度的条件下，实现工业化的高效复性与纯化方法，以推动基因工程的发展和肿瘤医药工业的技术进步。
发明内容
本发明的目的在于满足生物医药产业的发展需要，该法利用表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(简称TRAIL)的重组大肠杆菌菌体为原料，提供一种重组TRAIL包含体的工业化提取、复性与纯化的方法，可获得纯度大于95％的可溶性活性蛋白，收率可达40％以上，从而有效地推动生物医药产业的发展和肿瘤治疗技术的进步。
本发明的构思是这样的众所周知，在利用基因重组大肠杆菌发酵表达TRAIL蛋白的过程中，其可溶性部分一般不足20％，大部分的TRAIL以无活性的包含体形式存在于破菌后的细胞碎片中，如果不将包含体复性成有活性的可溶性蛋白将会造成资源的极大浪费，进而影响重组TRAIL基因工程药物的研发。因此如何将无活性的包含体复性成有活性的可溶性蛋白已成了相关技术人员的当务之急。
本发明首先构思了一种大规模破壁提取法，先用洗涤的方法来处理菌体，然后将洗净的菌体置于缓冲液中，泵入高压匀浆机中，通过匀浆机将菌体予以破碎，使菌体内部的TRAIL包含体全部释放出来，然后通过离心分离得到TRAIL包含体粗品，再将TRAIL包含体粗品用合适的洗涤剂进行多步洗涤处理，除去杂质，提取得到纯度大于80％的TRAIL包含体，这样不仅为后续的复性与纯化过程带来极大的方便，而且有利于工业化生产。
其次，将上述洗涤后的TRAIL包含体用高效变性剂溶解成均一的溶解液，然后在含有促折叠组分的缓冲液中，用稀释复性法实现最终的高浓度(1mg/ml)复性，获得具有生物活性的可溶性TRAIL蛋白溶液，这样不仅可以有效地减少在复性过程中聚集体的产生，而且大大提高了复性的效率，有利于工业化生产。
最后，将上述所得的TRAIL复性液(即具有生物活性的可溶性TRAIL蛋白溶液的简称，下同)进一步进行多步层析纯化与超滤浓缩，获得纯度＞95％的活性TRAIL产品。
按照上述构思实现本发明的技术方案阐述如下1、基因工程菌的来源E.coli K802由第二军医大学保藏，重组质粒pBV-TRAIL由第二军医大学构建。利用工程菌(指一种重组的大肠杆菌)进行发酵系公知技术，故描述从略。将发酵后菌体作为本发明的原料。
2、从菌体中提取重组TRAIL包含体的方法，主要包括如下二个步骤(1)从菌体中提取重组TRAIL包含体粗品首先将菌体用pH＝7.0的PBS(含有0.15mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，浓度通常为50mmol/L)缓冲液洗涤除去菌体中夹带的未利用完的培养基组分等杂质；再重置于pH＝7.0-8.0的PBS缓冲液中，在固液比为1∶3-5的条件下，搅拌成均一的浆液，泵入高压匀浆机中进行菌体破碎，使TRAIL包含体从菌体中充分释放出来，继而通过离心分离得到TRAIL包含体粗品；(2)将TRAIL包含体粗品进行除杂处理，提取纯度＞80％的TRAIL包含体首先将TRAIL包含体粗品用pH＝7.0-8.0的PBS缓冲液广泛洗涤2-3次，再用含有DTT及NaCl的洗涤液A洗涤，最后用含有尿素及TritonX-100的洗涤液B洗涤，除去杂质后，离心分离后获得纯度大于80％的TRAIL包含体。其中所说的洗涤液A是一类含有1-10mmol/L DTT及0.5-1mol/L NaCl的pH＝7.0-8.0的磷酸盐缓冲液；所说的洗涤液B是一类含有2-8mol/L尿素及0.5-3％(v/v)TritonX-100的pH＝7.0-8.0的磷酸盐缓冲液。
3、TRAIL包含体的复性和提纯方法主要包括如下两个步骤(1)首先将上述纯度大于80％的TRAIL包含体用缓冲液配制的高效变性剂进行溶解，得到均一的变性溶解液，变性溶解液的蛋白浓度为3-10mg/ml，然后在含有促折叠组分的缓冲剂保护下，用稀释法进行复性，获得具有生物活性的可溶性TRAIL蛋白溶液，最后用两步透析法除去残留的变性剂，得到TRAIL复性液。
其中所说的变性剂是一类含有8.5-9.5mol/L的尿素及5-30mMmol/L DTT的pH为7.5-8.5的50mmol/L Tris缓冲液(用盐酸调节)，或者是一类含有4.5-7.5mol/L的盐酸胍及5-30mmol/L DTT的pH为7.5-8.5的50mmol/L Tris碱缓冲液，或者是一类含有2-3mol/L尿素的pH为11.5-12.5(用NaOH调节的)的2mol/L的Tris溶液中的一种；其中以4.5-7.5mol/L的盐酸胍及5-30mmol/L DTT的pH为7.5-8.5的50mmol/L Tris碱缓冲液最佳。
其中所说的复性液中含有促折叠组分的稀释法复性包括如下两种较佳的方式①间歇式流加稀释法所用的复性液为一类含有如下促折叠组分即含0.4-1mol/L L-Arg，0.5-1mol/L尿素，2-5mmol/L DTT，0.1-0.5mmol/L ZnSO4和0.3-0.8mol/L NaCl的pH为7.0-8.0的20-100mmol/L的Tris缓冲液，每次流加浓度为100-200mg/L，间隔时间为40-90min，最终浓度达0.8-1.0mg/ml，同时于4℃下缓慢搅拌6-10h；然后通过两步透析除去多余的变性剂，透析后离心除去复性过程中聚集的不溶性蛋白，得到TRAIL复性液再经超滤浓缩得浓缩复性蛋白溶液，其中可溶性蛋白浓度可达到1mg/ml，供下一步处理。
②连续流加稀释法其中复性溶液的组成同间歇式流加稀释法，但复性溶液的流加速度以恒速方式进行，流加速率为0.3-6ml/min，最终浓度达0.8-1.0mg/ml，同时于4℃下缓慢搅拌，至流加结束后继续搅拌0.5-1.0小时，然后通过同①的透析、离心及浓缩处理，供下一步使用。
其中所说的两步透析法分别指；第一步透析时用的透析液为含有0.5-1.0mol/L尿素、0.3mol/L NaCl与1mmol/L DTT的pH为7.4的浓度为20mmol/L的Tris缓冲液，至少透析6h；第二步透析时用的透析液除尿素浓度为0.1-0.5mol/L外，其余同第一步，至少透析6h；通过两步透析可以缓慢除去残余的变性剂，有利于复性完全。
(2)将通过超滤浓缩所得的TRAIL复性液，上样于Ni金属亲和层析柱进行层析分离，该柱先照常规用平衡缓冲液平衡5个体积，平衡缓冲液为含有0.3M NaCl的pH＝7.5的磷酸盐缓冲液，洗脱时先用含有20-40mmol/L咪唑的平衡缓冲液洗脱杂蛋白，再用含有60-100mmol/L的咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，洗脱所得的目标蛋白组分再上离子交换柱或分子筛进行层析，层析柱按照常规事先用平衡缓冲液平衡5个体积。离子交换所用的平衡缓冲液为pH＝7.0的20mmol/L磷酸盐缓冲液，用0.1-1molNaCl梯度洗脱目标蛋白。分子筛柱所用的平衡缓冲液与洗脱缓冲液均为含有0.5molNaCl的pH为7.0的50mmol/L磷酸盐缓冲液。经RP-HPLC和SDS-PAGE分析，收集含有高纯度目标蛋白的组分，收率达40％以上。
具体实施例方式
下面通过具体实施例进一步阐明本发明的内容，但这些实施例并不限制本发明的保护范围。
实施例1纯度≥80％TRAIL包含体的提取取湿菌体2.0kg，用pH＝7.0的PBS(含有0.15mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，浓度通常为50mmol/L)缓冲液洗涤除去菌体中夹带的未利用完的培养基组分等杂质，离心并弃上清液，再重置于pH＝7.0-8.0的PBS缓冲液中，在固液比为1∶3-5的条件下，搅拌成均一的浆液，泵入高压匀浆机中进行菌体破碎，使TRAIL包含体从菌体中充分释放出来，继而通过离心分离得到湿的TRAIL包含体粗品0.8kg，其中含水量为70-80％。
将上述湿包含体粗品0.8kg，先用pH＝7.0-8.0的PBS缓冲液广泛洗涤2-3次，再用含有2mmolDTT及1molNaCl的pH＝7.0-8.0的磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤液耗量为12-15升；最后用含有8mol尿素及0.5％TritonX-100的pH＝7.0-8.0的磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤液耗量为8-10升，除去杂质后，离心分离后获得纯度大于80％的TRAIL包含体0.15kg。
实施例2用连续流加稀释复性的方法进行复性取纯度为80％的TRAIL包含体0.15kg，用含有6mol/L的盐酸胍及30mmol/LDTT的pH为7.5的50mmol/L Tris缓冲液(用盐酸调节)3升进行溶解，得到均一的变性溶解液，总蛋白浓度约为12.5g/L，其中含TRAIL蛋白约为10g/L。
将上述的变性溶解液，采用连续流加稀释法进行复性，所用的复性液为含有0.5mol/L L-Arg，0.5mol/L尿素，2mmol/L DTT，0.2mmol/L ZnSO4和0.5mol/L NaCl的pH为7.5的50mmol/L的Tris缓冲液27L，置于一50L的带搅拌的反应釜中进行复性，其流加速率为5ml/min(指变性溶解液的流加速率)，流加时间为10.5小时左右，最终浓度为1mg/ml(或1g/L，部分蛋白发生聚集)，4℃下缓慢搅拌至流加结束后0.5小时以上(即搅拌时间达11小时左右)，搅拌转速10-30转/分，获得一种含有生物活性的TRAIL蛋白水溶液，其生物活性用MTT法检测或用与TNF活性检测方法相似的结晶紫法来检测，下同。
将上述所得的含有生物活性蛋白的水溶液，置于盛有透析液的贮槽中进行二步透析，缓慢除去残留变性剂。其中所说的含有生物活性TRAIL蛋白的水溶液可分别装于一批透析袋中，每个透析袋的有效容积为1-5升，截留分子量为6-8kD，然后一起置于盛有透析液的贮槽中，每步至少透析6h；其中第一步透析时用的透析液为含有0.5mol/L尿素、0.3mol/L NaCl与1mmol/L DTT的pH为7.4的浓度为20mmol/L的Tris缓冲液；第二步透析时用的透析液除尿素浓度为0.1mol/L外，其余同第一步；为了提高透析速率，可用立式自吸离心泵将透析液循环流动；为了减少透析袋的移动(搬运)，透析贮槽可只设一个，用泵来输送变更透析液；为了保护透析袋搬运时的安全，在透析袋的外部设置网状结构的编织袋。
实施例3用间歇流加稀释复性法进行复性除了流加方式采用间歇式流加外，其余部分方法、组分及步骤均同实施例2。间歇式流加稀释复性时，每次变性溶液的流加浓度控制在100-200mg/L，即相当于每次加入27L的复性液中的变性溶解液量为0.5升，每间隔90min加料一次，(累计间歇式流加操作耗时7.5h)，整个操作在4℃下缓慢搅拌10h左右。最后获得“TRAIL复性液”备用。顺便指出流加速度慢一些或每次流加量少一些，即复性时间稍长一些，一般来说有利于复性质量的提高，产业部门可以根据自身条件和要求作出选择。
实施例4纯度≥95％的活性TRAIL蛋白产品的制备取实施例2或3所得的“TRAIL复性液”40升(透析后体积变大)，先经离心分离除去复性过程中可能出现的少量聚集的不溶性蛋白(再溶解重新利用)，获得相应的澄清液，再进行超滤浓缩，得浓缩TRAIL复性液3升，总蛋白浓度为7.6g/L，其中含TRAIL蛋白为6.6g/L。
将上述浓缩后TRAIL复性液3L，上样于4L的Ni金属亲和层析柱，填料为Qiagen公司生产的。该柱事先按照常规用平衡缓冲液平衡5个体积，平衡缓冲液为含有0.3molNaCl的pH＝7.5的磷酸盐缓冲液，用含有20mmol/L咪唑的平衡缓冲液洗脱杂蛋白，再用含有80mmol/L的咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，目标蛋白收率可达85％。洗脱所得的目标蛋白组分再上离子交换柱，填料为Pharmacia公司生产的CM-Sepharose，该柱按照常规先用pH＝7.0的20mmol/L磷酸盐缓冲液平衡5个体积，再用0.1-1molNaCl线性梯度洗脱目标蛋白，梯度时间为20min。经RP-HPLC和SDS-PAGE分析，收集含有高纯度目标蛋白的组分，该步目标蛋白收率可达75％，最后获得纯度为95％的活性TRAIL蛋白产品13.2g，收率达44％(以变性溶解后总TRAIL蛋白量计算)，未达标的过柱组分则返回系统中循环纯化回收。洗脱所得的目标蛋白组分也可以上分子筛柱进行洗脱提纯，产业部可按照本发明公开的内容自行作出选择。
由上可见本发明的方法，不仅使资源得到了良好的利用，而且推动了基因工程药物的工业化发展和促进肿瘤药物研发的技术进步。
权利要求
1.一种重组TRAIL包含体蛋白的工业化提取、复性和纯化方法，该法利用表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(简称TRAIL)的重组大肠杆菌菌体为原料，其特征在于，其中所说的提取方法主要包括如下二个步骤(1)从菌体中提取重组TRAIL包含体粗品首先将菌体用pH＝7.0的PBS缓冲液(含有0.15molNaCl的磷酸盐缓冲液)洗涤除去菌体中夹带的未消耗完的培养基组分等杂质；再重置于pH＝7.0-8.0的PBS缓冲液中，在固液比为1∶3-5的条件下，搅拌成均一的浆液，泵入匀浆机中进行菌体破碎，使TRAIL包含体从菌体中充分释放出来，继而通过离心分离得到TRAIL包含体粗品；(2)将TRAIL包含体粗品进行洗涤除杂质，提取获得纯度＞80％的TRAIL包含体首先将TRAIL包含体粗品用pH＝7.0-8.0的PBS缓冲液广泛洗涤2-3次，再用含有DTT及NaCl的洗涤液A洗涤，最后用含有尿素及TritonX-100的洗涤液B洗涤，离心分离后获得纯度大于80％的TRAIL包含体；其中所述的复性和提纯方法主要包括如下两个步骤(1)先将上述纯度大于80％的TRAIL包含体用缓冲液配制的高效变性剂进行溶解，得到均一的变性溶解液，变性溶解液的蛋白浓度为3-10mg/ml，然后在含有促折叠组分的缓冲剂保护下，用稀释法进行复性，获得具有生物活性的可溶性TRAIL蛋白溶液，最后用两步透析法除去残留的变性剂，得到TRAIL复性液；(2)TRAIL复性液的层析纯化与超滤浓缩获得纯度＞95％的活性TRAIL产品，先将上述所得的TRAIL复性液先行超滤浓缩再上柱于Ni金属亲和层析柱进行层析分离，用咪唑溶液浓度梯度洗脱，洗脱所得的目标蛋白组分再上离子交换柱或分子筛柱进行层析，用洗脱液洗脱，分步收集组分，经RP-HPLC和SDS-PAGE分析，收集达标的组分，产品收率达40％以上。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于其中所说的洗涤液A是一类含有1-10mmol/L DTT及0.5-1mol/L NaCl的pH＝7.0-8.0的磷酸盐缓冲液；所说的洗涤液B是一类含有2-8mol/L尿素及0.5-3％(v/v)TritonX-100的pH＝7.0-8.0的磷酸盐缓冲液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所说的变性剂是一类含有8.5-9.5mol/L的尿素及5-30mmol/L DTT的pH为7.5-8.5的50mmol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液(用盐酸调节)，或者是一类含有4.5-7.5mol/L的盐酸胍及5-30mmol/L DTT的pH为7.5-8.5的50mmol/L Tris缓冲液，或者是一类含有2-3mol/L尿素的pH为11.5-12.5的2mol/L的Tris溶液中的一种。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所说的稀释法复性用如下两种方法之一进行(1)间歇式流加稀释法其中复性溶液为一类含有0.4-1mol/L L-Arg，0.5-1mol/L尿素，2-5mmol/L DTT，0.1-0.5mmol/L ZnSO4和0.3-0.8mol/LNaCl的pH为7.0-8.0的20-100mmol/L的Tris缓冲液，每次流加浓度为100-200mg/L，间隔时间为45-90min，最终浓度达0.8-1.0mg/ml，同时于4℃下缓慢搅拌6-10h；(2)连续流加稀释法其中复性溶液的组成同间歇式流加稀释法，但复性溶液的流加速度以恒速方式进行，流加速率为0.05-0.1ml/s，最终浓度达0.8-1.0mg/ml，同时于4℃下缓慢搅拌，至流加结束后继续搅拌0.5-1.0小时。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所说的两步透析法所用的透析液分别为(1)第一步透析时所用的透析液为一类含有0.5-1.0mol/L尿素、0.3mol/LNaCl与1mmol/L DTT的pH为7.4的浓度为20mmol/L的Tris缓冲液，至少透析6h；(2)第二步透析时所用的透析液除尿素浓度为0.1-0.5mol/L外，其余同上，至少透析6h。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所说TRAIL复性液经超滤浓缩上Ni金属亲和层析柱，进行梯度洗脱层析分离时，平衡缓冲液为含有0.3molNaCl的pH＝7.5的磷酸盐缓冲液，洗脱时先用含有20-40mmol/L咪唑的平衡缓冲液洗脱杂蛋白，再用含有60-100mmol/L的咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于用咪唑溶液梯度洗脱所得的目标组分再上离子交换柱或分子筛柱进行洗脱分离时，所用的缓冲液与洗脱液分别为离子交换所用的平衡缓冲液为pH＝7.0的20mmol/L磷酸盐缓冲液，用0.1-1molNaCl梯度洗脱目标蛋白；分子筛柱所用的平衡缓冲液与洗脱缓冲液均为含有0.5mol NaCl的pH为7.0的50mmol/L磷酸盐缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种重组TRAIL包含体蛋白的工业化提取、复性与纯化方法。该法利用表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(简称TRAIL)的重组大肠杆菌菌体为原料，先进行破碎、洗涤等预处理提取获得纯度＞80％的TRAIL包含体；然后将上述包含体用变性剂进行溶解，得到变性溶解液；再将上述所得的包含体变性溶解液用稀释法进行复性，再用两步透析法除去残留的变性剂，得到含有TRAIL活性蛋白的复性液，最后将上述复性液经超滤浓缩，上柱层析分离等步骤，收集合格的洗脱液，即得本发明的目标产物，一种具有与可溶性表达蛋白活性相近的复性重组TRAIL蛋白，其得率可达40％以上。
文档编号C07K1/00GK1473843SQ0314181
公开日2004年2月11日 申请日期2003年7月24日 优先权日2003年7月24日
发明者沈亚领, 魏东芝, 夏小霞 申请人:华东理工大学, 上海恰尔生物技术有限公司