专利名称：从黄芪中提取黄芪总黄酮和总甙的方法
技术领域：
本发明涉及中草药有效成分的提取，特别是从黄芪中提取黄芪总黄酮和总甙的方法。
背景技术：
黄芪黄酮类化合物(I)和皂甙类化合物(II)都是黄芪中的有效的化学成分，皂甙类化合物有降压，抗炎，镇静，镇痛，提高血浆cAMP含量，促进小鼠再生肝DNA合成和提高小鼠淋巴器官的反应免疫功能等作用。异黄酮类化合物生理活性显著，有扩张冠状动脉，增加冠状流量、及降低心肌耗氧的作用。药理上具有发汗，解热，解痉等作用。黄芪属豆科植物，豆科植物中的异黄酮还有雌性激素，抗氧化和溶血以及抗胆固醇和血脂，抑菌，抑酶等活性。
R1-O-葡萄糖，OH，H；R2H；R3H，OH；R4OH，H；R5-O-葡萄糖 I-R1＝2，3-O-diacetyl-β-D-xylopyranosyl；R2＝β-D-xylopyranosyl；II-R1＝2-O-acetyl-β-D-xylopyranosyl；R2＝β-D-xylopyranosyl；III-R1＝R2＝2，3，4-triacetyl-β-D-xylopyranosyl；IV-R1＝2，3-O-diacetyl-β-D-xylopyranosyl中药有效成分的提取、分离是实现中药现代化的关键步骤，如何在尊重中医药传统的基础上，完成中药有效成分的提取分离，也是困惑广大医药工作者的问题。树脂法在中草药化学成分的提取分离方面确实显示出独特的优势。其有机溶剂消耗少、工艺简单灵活、生产成本较低。通过不同的树脂选择可以达到在最大限度地富集已知有效成分、摒弃已知无效成分的同时保留了未知成分，这较其它的分离方法更符合中医药特色。黄芪(Astragalus mongholicus Bunge)属豆科植物，为常用中药，具有解表退热、生津止渴的功效。黄酮类似物及皂甙是黄芪中的两种有效成分。目前国内外都开展了从黄芪中提取总黄酮及皂甙的研究。对黄酮的研究仅限于对黄芪中黄酮及其类似物的含量及其结构的研究。所涉及的提取方法是层析方法(孙晖，刘玉斌等，黄芪地上越冬枯枝中黄芪总黄酮和总皂甙的含量测定，农业工程学报，2000，16(5)，117)无法用于生产。
对黄芪皂甙的提取方法，闫巧娟等报道了[黄芪皂甙的提取分离方法，中国农业大学报，2000，5(6)，61]水提法；醇提法；萃取法；树脂吸附法和超临界CO2法。这些方法的目的都是为了从黄芪中提取皂甙，然而这些方法在提取黄芪皂甙的同时也能将黄酮等物质同时提取出来。所示的方法并没有进一步将皂甙类化合物与黄酮类化合物分离的过程。所以该方法并不完善，提取纯度也不高，并且浪费资源。
江亚强等[树脂吸附法提取黄芪皂甙，中国农业大学学报，2000，5(6)，66]给出了用树脂法提取黄芪皂甙，其技术特征是首先用乙醇提取皂甙，浓缩后加水溶解，然后过柱，再用乙醇洗脱。该技术同上述所示技术存在同样的问题。除此之外，齐宗韶等公开了[黄芪化学成分的研究概况，中草药，1987，18(5)，41]的皂甙结构显示，皂甙类化合物易溶于乙醇而难溶于水，所以该技术首先用乙醇提取皂甙。然而浓缩后用水溶解很难保证皂甙类化合物进水中，过柱后用乙醇洗脱，溶剂的使用似有相互矛盾之处。
中国专利CN1330082A[韩鲁佳，闫巧娟等，黄芪多糖和黄芪皂甙的提取分离方法]所公开的技术同样存在上述的问题。
上述文献虽然报道了较为详细的方法，但同样也没有一个将黄酮类化合物和皂甙类化合物进行分离的过程。
发明内容
本发明的目的是提供一种从黄芪中提取黄芪总黄酮和总甙的方法。本发明是用于黄芪总黄酮和总甙的分离提纯的方法，该方法工艺简单、成本低、损失小、产品质量高。该树脂结构稳定，抗污染能力强，易于再生，对黄芪总黄酮和总甙有很高的选择性，将黄芪黄酮类化合物及皂甙类化合物同时从黄芪中分离出来，然后进一步将两类化合物分离。
本发明包括以下步骤1)用粉碎机将干黄芪根茎原料打成粗粉末或切成2-3cm短杆放入容器，加入有机溶剂， 在-10～70℃回流1～10h提取，或加入水提取；投料比为原料有机溶剂＝1∶1～20。所述的有机溶剂是烃类，醇类，醚类，酯类，酮类，卤代烷等所有有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙醇、丙酮、丁酮、乙醚、四氢呋喃或它们的混合。
2)将上述提取液过滤，冷却至室温，静置2-15天，有蔗糖析出，蔗糖析出量为黄芪重量的1％-15％。蔗糖内含有少量黄芪多糖，黄酮类和皂甙类及其他黄芪成分，所以黄芪蔗糖也是一种很好的保健品。
经上述提取过程，那些可溶于乙醇等有机溶剂的物质，如黄酮类，皂甙类及其他少量物可大部分进入有机溶剂溶液中。
3)将去除蔗糖的提取液加入10-200％的水，加水的范围最好是10-30％。
4)吸附分离，将上述溶液通过吸附分离柱，吸附树脂可以使用H-107或其它各种吸附树脂和吸附材料，最好是三柱联用(见图1)。流速3-5mL/min，或更大范围，可根据具体情况确定。吸附效果见图2。
5)解析以丙酮，丁酮，等其它有机溶剂为解析试剂(包括醇类，酮类，醚类，卤代烷等有机试剂)，在室温和其它适宜的温度进行解析，或40～70℃乙醇，或40～100℃水，或水与有机溶剂的混合液。流速为0.2-0.6mL/min，或其它更大范围，可根据其它具体情况确定。解析液用量为2-6倍的树脂体积或更大的用量。解析效果见图36)离子交换，将解析液通过阴离子交联树脂柱，流速为0.2-0.6mL/min，黄酮类物质留在树脂柱上，甙类化合物存在于流出液中，从而将两种物质分开。浓缩流出液得甙类化合物。
7)用1-10％的NaOH水溶液将黄酮类化合物解析下来。解析效果见图4。
8)将离子交换柱的解析液用盐酸或硫酸酸化后，分去水层，水洗数遍即可得黄酮类物质。
除可以使用乙醇作解析液外，其他有机溶剂，如丙酮、丁酮、丙醇等均可作为解析液。解析液还包括40-100℃水。上述的所有有机溶剂的混合液及它们与水的混合液也都可以作为解析液。
本发明解析过程可在解析液的冰点至沸点之间进行(室温到50℃最好)，解析液的用量是2倍至6倍的树脂体积为宜，或更多。速度在0.2～0.6mL/min进行为宜，或其它速度。皂甙及黄酮类物质将被解析下来。然后树脂柱过水，将解析液替换净后，树脂柱可继续使用。
离子交换过程是将黄酮类化合物与皂甙类化合物分开。其原理是黄酮类化合物含有活泼的酚羟基，该基团显有酸性，故可用强碱离子交换树脂进行交换，而皂甙类化合物不含有可供交换的活性基团，故可用离子交换树脂将它们分开。交换机理如下
注为简化表达式，上述的黄酮类化合物只以其中一种为代表。
解析液过柱后，黄酮类物质留在柱上，皂甙类化合物存在于流出液中。此步所用树脂包含一切阴离子交换树脂。离子交换树脂使用前除去低聚物，并再用1-10％NaOH水溶液处理，水洗至中性。
解析交换柱是用1-10％NaOH水溶液通过离子交换柱，黄酮类化合物被解析下来，存在于解析液中。
交换柱用去离子水洗至中性，继续使用。
将上述方法得到的皂甙及黄酮类物质用乙醇溶解后，去掉沉淀后的清液，挥发掉乙醇可得到精制品。
采用H-107树脂，将H-107树脂在脂肪提取器中用丙酮提取24小时，以去除低聚物。然后将树脂填加到吸附柱中，以适当速度流出蒸馏水，换掉丙酮后即可使用。
吸附柱的设计，除单柱使用外，多柱联用为佳，最好为3个吸附柱同时使用，这样可取得最好的提取效果。如图1所示。提取液首先顺次进入图1-1所示的3个吸附柱模型，当第三个吸附柱开始泄漏后，开始解析第一个柱，解析完毕后可以重新使用。当第一个柱解析时，B柱变为第一柱，并接入一新柱(D)，以后依此类推。如图1-2所示。
本发明用于黄芪总黄酮和总甙的分离提纯的方法，工艺简单、成本低、损失小、产品质量高，无环境污染。多柱联用提高了提取的效率，避免了有效成分的损失。本发明使用的树脂结构稳定，抗污染能力，易于再生，对黄芪总黄酮和总甙有很高的选择性，将黄芪黄酮类化合物及皂甙类化合物同时从黄芪中分离出来，然后进一步将两类化合物分离。
图1.三柱联用示意图。
图2.吸附效果曲线。
图3.黄酮类及皂甙类化合物在吸附柱上的解析效果。
图4.黄酮类化合物在离子交换柱上的解析效果。
具体实施例方式
实施例在5000ml三口瓶内，放入用粉碎机将干700g黄芪根茎切成的2-3cm短杆，加入3500mL95％的乙醇，在70℃回流提取1.5h。放出提取液2500ml。将上述提取液过滤，冷却至室温，静置5天，有蔗糖析出，过滤，将去除蔗糖的提取液加入400mL水。过H-107树脂柱，流速4mL/min。
吸附平衡后，用丙酮在30℃，以0.4mL/min的速度进行解析，解析液用量为5倍的树脂体积；将解析液通过D-208强碱阴离子交换树脂(南开大学化工厂生产)柱，流速为0.4mL/min，黄酮类物质留在树脂柱上，甙类化合物存在于流出液中，从而将两种物质分开，在50℃挥发掉溶剂，得甙类化合物；用5％的NaOH水溶液将黄酮类化合物解析下来，流速为0.4mL/min，解析液用量为4倍的树脂体积，解析效果见图4。
将离子交换柱的解析液用20％盐酸酸化至pH＝3，分去水层，水洗至pH＝6，即可得黄酮类物质。
吸附结果绘于图2中。
树脂在使用前的处理方法将H-107树脂在脂肪提取器中用丙酮提取24小时，以去除低聚物。然后将树脂填加到吸附柱中，以4mL/min流出蒸馏水，换掉丙酮后装入吸附树脂柱(图1，三柱联用)，每柱装有70mL H-107吸附树脂(所用H-107树脂已商品化，南开大学化工厂生产)。当C柱开始泄漏后，撤下A柱进行解析。再另加一柱(D)，从B柱进料，B柱变为第一柱。A柱解析完毕以后，继续使用，从后边进入系统，如同D柱一样。所以每柱都可长期循环使用。
含量测定。
标准物的准备。山东东瀛植物油厂生产的纯度为50％的大豆异黄酮样品，反复提纯3次，液相色谱分析96.9％为标准物。
标准曲线的绘制。将上述标准物用乙醇配制浓度为0.075g/L的溶液，以此浓度为A，再分别配制0.8A，0.6A，0.4A，和0.2A的溶液，绘制标准曲线y＝11.8x+0.008。
吸附效果分析从图2中的A曲线可知，大约在第9个积分出现泄漏，第26个积分的含量为2.4g/L，远远低于提取液的5.12g/L的浓度，说明树脂柱还没有达到吸附平衡。合并26个积分的溶液过B柱，从图2的B的曲线可知，在第14个积分开始出现泄漏，而第25积分的浓度只有1.2g/L，合并25个积分液过C柱，曲线C显示24个积分几乎没有泄漏。三柱联用保证了吸附物没有遗失。
将上述方法得到的皂甙及黄酮类物质放入50mL锥形瓶内用少量95％的乙醇溶解后，静置，将清液倒入准确称量的小称量瓶内，锥形瓶用少量酒精洗3遍，将清液倒入称量瓶内，挥发掉酒精即得到精制的皂甙及黄酮类化合物。收率见表1表1皂甙及黄酮类物质的小试收率
实施例2操作步骤同实施例1，结果见表2。
表2皂甙及黄酮类物质的中试收率
权利要求
1.一种从黄芪中提取黄芪总黄酮和总甙的方法，其特征在于它包括下述步骤1)用粉碎机将黄芪根茎原料打成粗粉末或切成2-3cm短杆放入容器，加入有机溶剂，在-10～70℃下回流1～10h提取，或水浸提取；投料比为原料∶溶剂＝1∶1～20；2)将上述提取液过滤，冷却至室温，静置2-15天，有蔗糖析出；3)除去蔗糖后的提取液加入10-200％的水；4)吸附分离，将上述溶液通过吸附树脂分离柱，流速3-5mL/min；5)用有机溶剂作为解析液在室温下至50℃进行解析，或40-100℃水解析，或水与有机溶剂的混合液解析，流速为0.2-0.6mL/min，解析液用量为2-6倍的树脂体积；6)离子交换，将解析液通过阴离子交换树脂柱，流速为0.2-0.6mL/min，黄酮类物质留在树脂柱上，甙类化合物存在于流出液中；在40～80℃下浓缩流出液，得甙类化合物；7)用1-10％的NaOH水溶液将黄酮类化合物解析下来，流速为0.2-0.6mL/min，解析液用量为2-6倍的树脂体积；8)将离子交换的解析液用盐酸或硫酸酸化到pH≤5，不再沉出物质为止，分去水层，水洗至pH＝5～7，即可得黄酮类物质。
2.按照权利要求1所述的从黄芪中提取黄芪总黄酮和总甙的方法，其特征在于所述的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙醇、丙酮、丁酮、乙醚、四氢呋喃或它们的混合。
3.按照权利要求2所述的从黄芪中提取黄芪总黄酮和总甙的方法，其特征在于所述的有机溶剂是60～95％的乙醇。
4.按照权利要求1所述的从黄芪中提取黄芪总黄酮和总甙的方法，其特征在于在过吸附柱之前静置除糖，蔗糖析出量为黄芪重量的1％-15％。
5.按照权利要求1所述的从黄芪中提取黄芪总黄酮和总甙的方法，其特征在于所述的除去蔗糖的提取液加入水10-30％。
6.按照权利要求1所述的从黄芪中提取黄芪总黄酮和总甙的方法，其特征在于所述的吸附树脂分离柱的有机溶剂解析液是乙醇、丙酮、丁酮或丙醇，或40-100℃水。
7.按照权利要求6所述的从黄芪中提取黄芪总黄酮和总甙的方法，其特征在于所述的解析液是丙酮，丁酮或40～70℃乙醇。
8.按照权利要求1所述的从黄芪中提取黄芪总黄酮和总甙的方法，其特征在于所述的吸附树脂为H-107吸附树脂。
9.按照权利要求1所述的从黄芪中提取黄芪总黄酮和总甙的方法，其特征在于所用离子交换树脂是强碱离子交换树脂。
10.权利要求1所述的从黄芪中提取黄芪总黄酮和总甙的方法的吸附树脂分离柱是采用三柱联用。
全文摘要
本发明涉及中草药有效成分的提取，特别是从黄芪中提取黄芪总黄酮和总甙的方法。本发明是经过用有机溶剂提取，使用吸附树脂富集总黄酮和总甙，再用离子交换树脂将二者分开，工艺简单、成本低、损失小、产品质量高，无环境污染。多柱联用提高了提取的效率，避免了有效成分的损失。本发明使用的树脂结构稳定，抗污染能力，易于再生，对黄芪总黄酮和总甙有很高的选择性，将黄芪黄酮类化合物及皂甙类化合物同时从黄芪中分离出来，然后进一步将两类化合物分离。
文档编号C07G3/00GK1560069SQ20041001873
公开日2005年1月5日 申请日期2004年3月11日 优先权日2004年3月11日
发明者栗方星, 范文宏, 刘遵峰, 刘雪萍, 卜显和 申请人:南开大学