专利名称：一类2，3，5－三取代－4－噻唑烷酮化合物及其药理用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，更具体地涉及新的一类2，3，5-三取代-4-噻唑烷酮化合物、它们的制备工艺及作为SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制剂和抗SARS-CoV病毒药物在预防和治疗SARS病毒感染中的应用。
背景技术：
SASR病毒是一种传染性强、生存强、致死率高的新型病毒，2003年全球共有8千人感染，死亡人数达7百多人。世界卫生组织(WHO)正式确认SARS冠状病毒是传染性非典型肺炎的病因。基因组测序和生物信息学分析表明，SARS-CoV病毒主要含有以下功能蛋白聚合酶、穿刺(Spike，S)糖蛋白、小信封(E)蛋白、基质(M)蛋白、核衣壳(N)蛋白以及类3C(3CL)蛋白酶。理论上这些蛋白质均可以作为抗SARS-CoV病毒药物设计和筛选靶标，但3CL蛋白酶作为靶标进行药物设计和筛选尤其独特的优势(1)根据其他冠状病毒3CL蛋白酶功能推测，SARS-CoV病毒的3CL蛋白酶在病毒的复制过程中起重要作用；(2)许多现有的针对其他病毒的3CL蛋白酶抑制剂可以直接尝试抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的活性和抗SARS-CoV病毒的测试；(3)3CL蛋白酶非常容易表达，可以在短期内获得蛋白质进行药物筛选；(4)SARS-CoV病毒3CL蛋白酶与人冠状病毒和遗传性肠胃炎病毒的主蛋白酶(Main Proteinase，Mpro)有较高的序列同源性，SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的晶体结构已被测定，可进行基于其结构进行抑制剂的设计。
本发明利用计算机药物设计、有机化学合成、蛋白结合和抗SARS病毒感染EV6细胞实验，发现一类2，3，5-三取代-4-噻唑烷酮化合物的结构和制备方法，并确定作为治疗和/或预防SARS病毒感染的用途。
发明内容
本发明的一个目的是提供一类2，3，5-三取代-4-噻唑烷酮化合物。
本发明的另一个目的是提供2，3，5-三取代-4-噻唑烷酮化合物的制备工艺。
本发明的再一个目的是提供2，3，5-三取代-4-噻唑烷酮化合物的药理用途。
本发明涉及用非典型肺炎冠状病毒(SARS-CoV)3CL蛋白酶(3CLPro)为靶标设计一类2，3，5-三取代-4-噻唑烷酮化合物的结构和制备方法，以及在分子和细胞水平筛选药物，还涉及该类化合物作为SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制剂和抗SARS-CoV病毒药物用于治疗和/或预防SARS病毒感染。
本发明一类化学结构如通式所示的2，3，5-三取代-4-噻唑烷酮类化合物 其中R和R1各自独立地选自氢、C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烃基、C3-C7环烃基、Ar、芳烷基和5-7元杂环基；Ar选自苯基或取代的苯基、萘基或取代萘基和联苯基或取代联苯基，取代基可以是1-4个选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、羟基、C1-C4烷氧基、C1-C4不饱和烃氧基、羧基、酯基、C1-C6羧基烷氧基、C1-C6酯基烷氧基、C1-C6羧基烷基、C1-C6酯基烷基、氰基、硝基、氨基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、巯基、C1-C4酰基的基团；所述芳烷基中的芳基选自上述Ar基团；所述杂环基含有1-3个选自氧、硫、氮的杂原子，并可任选地被苯基并合和/或被一个或多个选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、酯基、C1-C6羧基烷氧基、C1-C6酯基烷氧基、C1-C6羧基烷基、C1-C6酯基烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4不饱和烃氧基、巯基、C1-C4酰基、Ar的基团所取代。
通式I所示2，3，5-三取代-4-噻唑烷酮类化合物、其顺反异构体或其可用药盐或水合物可用于制备治疗和/或预防SARS病毒感染的药物。
本发明所述2，3，5-三取代-4-噻唑烷酮类化合物的制备方法如下a.异硫氰酸酯R-NCS(1)与胺R1-NH2(2)反应生成相应的N，N′-二取代硫脲(3)将异硫氰酸酯R-NCS滴加到R1-NH2的甲苯溶液中，加毕，室温搅拌30分钟。滤出白色固体，加甲醇洗涤，干燥，得N，N′-二取代硫脲。
b.N，N′-二取代硫脲(3)与氯乙酸反应生成相应的2-R基亚胺基-3-R1基-4-噻唑烷酮(4)将N，N′-二取代硫脲、氯乙酸、无水乙酸钠和无水乙醇混合，回流24小时。蒸除溶剂，残余物中加入甲醇与水，滤出固体，甲醇重结晶，得2-R基亚胺基-3-R1基-4-噻唑烷酮。
c.2-R基亚胺基-3-R1基-4-噻唑烷酮(4)与芳香醛ArCHO(5)进行诺文葛耳(Knoevenagel)反应，生成相应的2，3，5-三取代-4-噻唑烷酮类化合物(6)将2-R基亚胺基-3-R1基-4-噻唑烷酮、芳香醛ArCHO、六氢吡啶和无水乙醇混合，回流24小时。蒸除溶剂，残余物中加入甲醇与水，快速搅拌，析出固体。过滤，甲醇重结晶，得2，3，5-三取代-4-噻唑烷酮类化合物。
发明详述本发明通过分子模拟获得了SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的三维结构；基于3CL蛋白酶的三维结构用虚拟筛选方法筛选了现有化合物数据库SPECS，发现了一类2，3，5-三取代-4-噻唑烷酮类化合物具有SARS-CoV病毒3CL蛋白酶结合抑制活性；对其中的[2-(2-苯亚胺基-3-苯基-4-羰基-噻唑烷-5-基)亚甲基-4-溴苯氧基]乙酸进行了病毒水平测试，发现其有较好的抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶和抗SARS-CoV病毒活性；合成了2，3，5-三取代-4-噻唑烷酮类化合物，进行了分子和病毒水平测试，发现这类化合物均有抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶和抗SARS-CoV病毒活性。
一.用分子模拟和蛋白质同源模建方法建立SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的三维结构模型序列分析表明，SARS-CoV病毒3CL蛋白酶与遗传性肠胃炎病毒的主蛋白酶(Main Proteinase，Mpro)有较高的序列同源性，全序列比较，两者序列相似性为大于60％、相同性大于43％、序列间隙小于1％。以Mpro蛋白晶体结构(Anand K，Palm GJ，Mesters JR，Siddell SG，Ziebuhr J，et al.EMBO J2002，213213，PDB号为1LVO)为模板，用同源蛋白模建方法建立了三维结构模型，在SARS-CoV病毒3CL蛋白酶三维结构模型中确立了活性中心和活性口袋。
二、虚拟筛选选择3CL蛋白酶蛋白催化活性残基H41和C145周围6范围内的残基组成底物结合口袋作为虚拟筛选的模型，用分子对接(Molecular Docking)虚拟筛选(Virtual Screening)方法，搜寻了SPECS公司的化合物数据库，获得了一批与3CL蛋白酶具有较强亲和力的候选化合物。
三、分子水平筛选将构建好的pQE30/SARS 3CL蛋白酶质粒转化于大肠杆菌M15中，以IPTG(浓度0.8mM)诱导，在氨苄西林为抗生素，温度为30℃，表达时间为10小时条件下，表达SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白。以NTA-His柱层析法初步纯化SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白，再利用FPLC-凝胶过滤进一步纯化SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白。使用表面等离子共振(SPR)技术得到SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白与上述化合物相互作用的动力学参数。
四、病毒细胞水平筛选本发明进一步测试了上述化合物抑制SARS-CoV病毒感染Vero-E6细胞的活性。
以Vero-E6细胞作为病毒宿主细胞(易感细胞)，测试样品对病毒感染细胞的保护作用，检测指标为细胞变性反应(CPE)以及观察感染细胞保护率。把Vero-E6细胞接种于96孔培养板，置37℃，5％CO2孵箱培养，加入不同稀释浓度的SARS-CoV病毒和测试样品，观察CPE，并用中性红染色测定OD值，计算样品抗SARS-CoV病毒活性作用。在病毒-细胞水平模型的抗SARS病毒活性实验中，用不同有效浓度的SARS病毒感染Vero-E6细胞，结果表明上述化合物时有较明显的抑制SARS-CoV病毒感染Vero-E6细胞的保护活性。
图1为实施例1所得化合物在抗SARS病毒的细胞实验模型上的测试结果。
具体实施例方式
以下将以实施例进一步说明本发明。这些实施例仅用于举例说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例中的所有参数及其余说明，除另加说明之外，都是以质量为依据的。
实施例1[2-(2-苯亚胺基-3-苯基-4-羰基-噻唑烷-5-基)亚甲基-4-溴苯氧基]乙酸的制备 (2-甲酰基-4-溴苯氧基)乙酸乙酯的制备将0.5g 5-溴水杨醛、0.45g溴乙酸乙酯、1.9g无水碳酸钾和20mL无水乙腈混合，室温下搅拌2小时。TLC显示反应完全。滤去固体，母液浓缩得0.6g淡黄色油状物，收率84.0％
2-苯亚胺基-3-苯基-4-噻唑烷酮的制备在100mL茄形瓶中加入2.5g氯乙酸、4.56g N，N’-二苯基硫脲、3.3g无水硫酸钠和60mL无水乙醇，混合物回流20小时。降至室温，滤出固体，滤饼加大量水洗涤，然后用少量乙醇洗涤，置于红外灯下干燥，得2.7g淡黄色固体，收率50.4％[2-(2-苯亚胺基-3-苯基-4-羰基-噻唑烷-5-基)亚甲基-4-溴苯氧基]乙酸乙酯的制备将等摩尔量的(2-甲酰基-4-溴苯氧基)乙酸乙酯和2-苯亚胺基-3-苯基-4-噻唑烷酮混合，在六氢吡啶和无水乙醇的条件下回流20小时，或者在无水碳酸钾和无水乙腈的条件下室温反应48小时。滤去固体，母液浓缩后，通过柱层析分离得到淡黄色油状产物。
乙酸的制备将[2-(2-苯亚胺基-3-苯基-4-羰基-噻唑烷-5-基)亚甲基-4-溴苯氧基]乙酸乙酯溶于四氢呋喃-甲醇(3∶1)的二元溶剂中，冰浴下滴加1N氢氧化钠水溶液，加毕，升至室温反应2小时。TLC显示反应完全。调PH值至1-2，加入氯仿萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥。过滤，母液浓缩，得到的产物用无水甲醇重结晶，得淡黄色固体。
实施例25-[3-甲基-4-氧代-5-(3-溴-4-甲氧基苯基亚甲基)-噻唑烷-2-基亚胺基]-2-氯苯甲酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例35-[3-甲基-4-氧代-5-(4-烯丙氧基-3-氯苯基亚甲基)-噻唑烷-2-基亚胺基]-2-氯苯甲酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例4[4-溴-2-(3-邻甲苯基-4-氧代-2-邻甲苯基亚胺基噻唑烷-5-基亚甲基)-苯氧基]-乙酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例5{4-[2-(2-氯苯基亚胺基)-4-氧代噻唑烷-5-基亚甲基]-2-甲氧基苯氧基}-乙酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例6[2-甲氧基-6-(4-氧代-3-苯基-2-苯基亚胺基噻唑烷-5-基亚甲基)-苯氧基]-乙酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例73-[3-甲基-4-氧代-5-(3-溴-4-甲氧基苯基亚甲基)-噻唑烷-2-基亚氨基]-苯甲酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例85-[3-甲基-4-氧代-5-(4-烯丙氧基苯基亚甲基)-噻唑烷-2-基亚胺基]-2-氯苯甲酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例93-{3-甲基-4-氧代-5-[3-氯-4-(4-氟苄氧基)-苯基亚甲基]-噻唑烷-2-基亚胺基}-苯甲酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例103-{4-[2-(3，4-二甲基苯亚胺基)-4-氧代噻唑烷-5-基亚甲基]-苯氧基甲基}-苯甲酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例113-{4-[2-(4-氟苯基亚胺基)-4-氧代噻唑烷-5-基亚甲基]-苯氧基甲基}-苯甲酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例123-{2-甲氧基-4-[2-(4-氯苯基亚胺基)-4-氧代噻唑烷-5-基亚甲基]-苯氧基甲基}-苯甲酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例133-[3-甲基-4-氧代-5-(3-乙氧基-4-甲氧基酰基甲氧基-苯基亚甲基)-噻唑烷-2-基亚胺基]-苯甲酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例144-[3-甲基-4-氧代-5-(3-氯-4-羧基甲氧基-苯基亚甲基)-噻唑烷-2-基亚胺基]-苯甲酸乙酯制备方法参照实施例1化合物。
实施例15{2-[3-(2，5-二甲基苯基)-2-(2，5-二甲基苯基亚胺基)-4-氧代噻唑烷-5-基亚甲基]-6-甲氧基-苯氧基}-乙酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例163-[3-甲基-4-氧代-5-(3-甲基-4-甲氧基-苯基亚甲基)-噻唑烷-2-基亚胺基]-苯甲酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例173-[3-甲基-4-氧代-5-(2-羟基-5-氯苯基亚甲基)-噻唑烷-2-基亚胺基]-苯甲酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例183-[3-甲基-4-氧代-5-(2-甲氧基-苯基亚甲基)-噻唑烷-2-基亚胺基]-苯甲酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例192-氯-5-[3-甲基-4-氧代-5-(2-羟基-5-溴-苯基亚甲基)-噻唑烷-2-基亚胺基]-苯甲酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例202-氯-5-[3-甲基-4-氧代-5-(3-氯-4-炔丙氧基-苯基亚甲基)-噻唑烷-2-基亚氨基]-苯甲酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例212-氯-5-[3-甲基-4-氧代-5-(3-甲氧基-4-羧基甲氧基-苯基亚甲基)-噻唑烷-2-基亚胺基]-苯甲酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例223-[2-甲氧基-4-(2-苯基亚胺基-3-苯基-4-氧代-噻唑烷-5-基亚甲基)-苯氧基甲基]-苯甲酸制备方法参照实施例1化合物。
实施例23蛋白结合测试利用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)生物传感技术Biacore 3000研究化合物[2-(2-苯亚胺基-3-苯基-4-羰基-噻唑烷-5-基)亚甲基-4-溴苯氧基]乙酸与SARS-3CL蛋白水解酶相互作用BIACORE3000(BIACORE AB，Uppsala，Sweden)(Amersham)，化合物与SARS-3CL蛋白水解酶结合实验在室温下完成。芯片和缓冲溶液如，CM5芯片，EDC，NHS，Ethanolamine，HBS-EP购自BIACORE AB公司(Uppsala，Sweden)。SARS-3CL蛋白水解酶按文献方法(Haifang Sun，Haibin Luo，Changying Yu，et al.，Molecular cloning，purification and mass spectrometriccharacterization of 3C like proteinase of SARS coronavims，Protein Expr.Purif.2003，Vol.32，No.2302-308.)克隆、表达和纯化。
化合物[2-(2-苯亚胺基-3-苯基-4-羰基-噻唑烷-5-基)亚甲基-4-溴苯氧基]乙酸用DMSO溶解，用HBS-EP稀释至相应浓度，DMSO的含量为0.4％。将纯化的蛋白通过氨基偶联法连接到芯片上，用HBS-EP依次稀释[2-(2-苯亚胺基-3-苯基-4-羰基-噻唑烷-5-基)亚甲基-4-溴苯氧基]乙酸7至所需的浓度，用BIACORE 3000的动力学分析Wizard进行动力学实验，进行数据的收集和分析。图1为化合物[2-(2-苯亚胺基-3-苯基-4-羰基-噻唑烷-5-基)亚甲基-4-溴苯氧基]乙酸与SARS-3CL蛋白水解酶结合的动力学曲线，根据稳态法分析数据，上述化合物与SARS-3CL蛋白水解酶平衡离解常数见下表。
实施例24反相HPLC方法观察化合物对SARS 3CLpro蛋白酶抑制作用根据冠状病毒蛋白酶催化底物的特异性具有保守性的特点，设计10肽酶活性检测底物，用反相-HPLC和荧光法对半胱氨酸蛋白酶水解活性进行检测。该底物序列为H2N-SAVLQSGFRK-COOH。底物2.5mM，蛋白酶浓度0.7μM于37℃在20μl 20mM Bis-Tris-HCL(pH7.0)反应缓冲液中进行酶切反应，反应终止加入0.1％三氟醋酸。反应产物用5-90％浓度的0.1％三氟醋酸在Delta PakC18柱(3.9*150mm；Waters)中进行反相-HPLC分离，215nm波长检测洗脱产物。酶预先与不同浓度的蛋白酶抑制剂于37℃预孵育60min，加入肽底物(终浓度为2.5mM)裂解30min后，根据底物的水解程度测定蛋白酶活性。经0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM、2mM各浓度药物对酶的抑制作用分析，得到实施例2所得化合物的IC50为0.57±0.18mM。
实施例25抗SARS病毒-细胞测试为了对大量化合物进行药物筛选，构建了基于哺乳动物细胞内瞬时表达由酵母GAL4增强序列调控的报告基因系统，与该调控序列特异结合的转录因子的结合——激活功能域之间设计SARS蛋白酶可以识别/切割的10肽位点，这样，瞬时表达的蛋白酶活性可以在报告基因的表达水平上反映出来，对报告基因如CAT的活性检测即可获得酶抑制剂药理作用的相对指标。
设计并构建1)pCMV-3CLpro；2)pM-3CLcs-vp16；3)pG5-CAT真核表达载体。以上载体分别以1)+2)+3)共转染293细胞，48孔板的载体转染剂量分别为1.0μg/0.3μg/0.5μg，按脂质体(lipofectamine2000)方法转染16小时后，给药，继续培养24小时，收获细胞，裂解，测定细胞内报告基因的表达水平(RLU)。以转染2)+3)为阴性对照，药物用DMSO溶解后，按100μM、50μM、20μM、10μM、5μM终浓度配制，每一剂量组各转染3孔，取均值。阳性药物RLU值应明显高于阴性对照，并且能定量反映药物对蛋白酶的抑制作用，以利于化合物的大量筛选，见图1。
权利要求
1.一类化学结构如通式(I)所示的2，3，5-三取代-4-噻唑烷酮类化合物 其中R和R1各自独立地选自氢、C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烃基、C3-C7环烃基、Ar、芳烷基和5-7元杂环基；Ar选自苯基或取代的苯基、萘基或取代萘基和联苯基或取代联苯基，取代基可以是1-4个选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、羟基、C1-C4烷氧基、C1-C4不饱和烃氧基、羧基、酯基、C1-C6羧基烷氧基、C1-C6酯基烷氧基、C1-C6羧基烷基、C1-C6酯基烷基、氰基、硝基、氨基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、巯基、C1-C4酰基的基团；所述芳烷基中的芳基选自上述Ar基团；所述杂环基含有1-3个选自氧、硫、氮的杂原子，并可任选地被苯基并合和/或被一个或多个选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、酯基、C1-C6羧基烷氧基、C1-C6酯基烷氧基、C1-C6羧基烷基、C1-C6酯基烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4不饱和烃氧基、巯基、C1-C4酰基、Ar的基团所取代。
2.如权利要求1所述化合物，其优选结构选自以下化合物
3.如权利要求1所述2，3，5-三取代-4-噻唑烷酮类化合物的制备方法，其特征在于a.将异硫氰酸酯R-NCS(1)与胺R1-NH2(2)反应生成相应的N，N′-二取代硫脲(3)；b.N，N′-二取代硫脲(3)与氯乙酸反应生成相应的2-R基亚胺基-3-R1基-4-噻唑烷酮(4)；c.2-R基亚胺基-3-R1基-4-噻唑烷酮(4)与芳香醛ArCHO(5)进行诺文葛耳(Knoevenagel)反应，生成相应的2，3，5-三取代-4-噻唑烷酮类化合物(6)；
4.如权利要求1所述2，3，5-三取代-4-噻唑烷酮类化合物用途在制备抗SARS-CoV病毒药物用于治疗和/或预防SARS病毒感染中的应用。
全文摘要
本发明提供式(I)所示化合物、其顺反异构体或其与可药用酸和碱所成的盐，式(I)中各取代基的定义见说明书。还提供该类化合物的制备方法及其药理用途。该类化合物作为SARS－CoV病毒3CL蛋白酶抑制剂和抗SARS－CoV病毒药物用于治疗和/或预防SARS病毒感染。
文档编号C07D277/54GK1699355SQ200410018418
公开日2005年11月23日 申请日期2004年5月17日 优先权日2004年5月17日
发明者沈建华, 蒋华良, 沈旭, 李松, 黄蔚, 贵春山, 陈静, 孙涛, 叶飞, 白东鲁, 柳红, 罗小民, 陈凯先 申请人:中国科学院上海药物研究所, 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所