专利名称：提纯大环内酯的方法
技术领域：
本发明涉及提纯大环内酯类、特别是他克莫司、子囊霉素(ascomycin)、西罗莫司、依维莫司(everolimus)或吡美莫司(pimecrolimus)的方法，通过使用吸附树脂在高于约30摄氏度的洗脱温度分离的方法。
相关申请本申请要求美国临时申请编号No.60/638,628(2004年12月22日提交)和No.60/638,815(2004年12月23日提交)的权利，上述申请的内容全文引用在此作为参考。
背景技术：
大环内酯类是具有一个或多个脱氧糖作为取代基的多元内酯环。红霉素、阿奇霉素和克拉霉素是具有抑菌和/或杀菌活性的大环内酯。
他克莫司(FK 506)也是大环内脂类抗菌素，其还是一种免疫抑制剂。他克莫司比环孢子菌素更有效，据报道其具有对T-淋巴细胞的选择性抑制作用。
吡美莫司是大环内酰胺和子囊霉素衍生物，据报道其抑制T细胞和肥大细胞生成前炎性细胞活素。默克索引1331(Maryadele J.O′Neil等人编辑，第13版，2001年)。据报道吡美莫司用作免疫抑制剂，Id。
据报道西罗莫司，另一种大环内酯，是免疫抑制剂。在移植之后，已经将西罗莫司和环孢子菌素以及皮质类固醇类一起给药以避免移植排斥。MartindaleThe Complete Drug Reference 568(Sean C.Sweetman ed.，Pharmaceutical Press 33rd ed.2002).
依维莫司，西罗莫司的衍生物，据报道可在器官移植中用作免疫抑制剂。Martindale，见539。
大环内酯通常通过发酵获得，虽然其中一些的合成路线是已知的。所得到的大环内酯通常含一些杂质，其可通过各种方法检测，例如高压液相色谱分析(HPLC)。在药物化合物中存在杂质是不希望的，在许多管辖区域的卫生管理机构(例如美国的食品与药物管理局)对药物中杂质的可接受水平有确定的基本标准。不言而喻，需要降低任何药物中杂质浓度的方法并且将其工业化应用。
例如，美国专利No.4,894,366、6,576,135、6,881,341和6,492,513公开了他克莫司的提纯过程。需要其它的更经济有效的提纯大环内酯的方法。
发明概述在一个实施方案中，本发明提供提纯用于大环内酯的层析法。该方法包括提供大环内酯负载，将大环内酯负载加到吸附树脂床上，用洗脱液洗脱，所述洗脱液含有至少一种有机溶剂，所述有机溶剂选自THF、乙腈、正丙醇、异丙醇、乙醇以及和丙酮和水，在大于约30摄氏度至约所述溶剂沸点温度之间的温度洗脱，得到流出物，收集所述流出物的主要部分，然后回收大环内酯。
在另一方面、本发明涉及用上述方法制备的大环内酯，特别是他克莫司、子囊霉素、西罗莫司(雷帕霉素)、依维莫司和吡美莫司。
发明详述这里使用的术语“减压”指的是压力小于约760mmHg。另外，在这里使用的术语“面积百分比”指的是通过本发明方法得到的HPLC色谱的面积百分比。在这里使用的术语抗溶剂指的是这样的物质，通常在环境温度为液体，大环内酯在其中最好是微溶的。
在这里使用的术语“杂质”涉及与所需的大环内酯相比任何具有不同的停留时间的化合物。不同的停留时间可以例如通过下文描述的HPLC方法测定。
在这里使用的术语RRT0.95和RRT1.25分别涉及子囊霉素和涉及子囊霉素和二氢他克莫司(dihydrotacrolimus)，它们是他克莫司中的杂质，在HPLC分析中，例如下述的分析中，其具有相对保留时间(相对于他克莫司)约0.95和1.25。
这里使用的与混合物或液体组合有关的术语体积百分数或体积百分比(vol-％)指的是根据下式计算的体积分数(用物质A说明)Vol-％A＝WtA×ρA/(WtA×ρA+WtB×ρB)
其中WtA和WtB分别是物质A和B的重量，以克计；ρA和ρB分别是物质A和B的密度，以g/ml计。
通过在大于约30摄氏度至约溶剂(在洗脱液中包括的)沸点温度的温度用层析法将杂质与大环内酯分离，得到了好得多的纯度。
在一个实施方案中，本发明提供了用于提纯大环内酯的层析法(即，用于降低大环内酯中的杂质浓度)。该方法包括提供大环内酯负载，将大环内酯负载加到吸附树脂床上，用洗脱液洗脱，所述洗脱液含有至少一种有机溶剂，所述有机溶剂选自THF、乙腈、正丙醇、异丙醇、乙醇以及和丙酮和水，在大于约30摄氏度至约所述溶剂沸点温度的温度洗脱，得到流出物，收集所述流出物的主要部分，然后回收大环内酯。
实施本发明优选的大环内酯包括他克莫司、子囊霉素、西罗莫司、依维莫司和吡美莫司。当他克莫司是所述大环内酯时，降低的杂质至少包括他克莫司的子囊霉素异构体(RRT1.19)和二氢他克莫司，其定量分析通过下文所述的HPLC进行。当子囊霉素是所述大环内酯时，降低的杂质至少包括他克莫司。所用的大环内酯可来自于任何来源。
实施本发明所用的吸附树脂是本领域公知的，优选是交联的非离子的苯乙烯-二乙烯基苯材料，但可以是化学修饰的。丙烯酸型吸附树脂也是已知的。该吸附树脂具有高孔隙度结构，其表面可吸收、然后解吸不同的化学物质。吸收和解吸受到环境的影响，例如所用的溶剂。在极性溶剂(例如水)存在下，该吸附树脂显示出憎水性。当使用非极性溶剂(例如烃)时，该吸附树脂可显示出一些极性性能。通常，吸附树脂具有大网络结构，并具有至少约300m2/g的表面积。
用于实施本发明的吸附树脂包括该AMBERLITE(R)XAD树脂，其可以从Rohm and Haas获得；XAD 4、XAD 7 HP、XAD 16 HP、XAD761和XAD 1180，所提及的仅为少数。还可使用从Mitsubishi获得的DIAION(R)吸附树脂；HP 10、HP 20、HP 21、HP 30、HP 40、HP50、SP 800、SP 825、SP 850、SP 875、SP 205、SP 206、SP 207、HP1MG和HP2MG，所提及的仅为少数。AMBERLITE(R)XAD 1180是用于实施本发明的优选吸附树脂。AMBERLITE(R)XAD 1180是大网络交联芳族聚合物。其为非离子、疏水、交联聚合物，从其特有的大网络结构(含连续聚合物相和连续孔相)、高表面积和其表面的芳族特性取得其吸附特性。表面积是500m2/g或更高。孔隙度是0.60ml/ml或更高。产品数据表PDS 0205 A-Jan.98-1/2给出了关于该树脂的详细资料。
负载可作为大环内酯在有机溶剂或在与水联合使用的有机溶剂中的溶液提供，或作为被大环内酯负载的加载部分提供，即，大环内酯吸附在吸附树脂的加载部分上。
在加载到吸附树脂床之前，大环内酯负载吸附(沉淀)到吸附树脂的加载部分上，所述的吸附包括制备在任选含有水的有机溶剂中的大环内酯溶液，将溶液和部分吸附树脂和水合并。所述吸附树脂可以与制备床的那些相同，或者可以是不同的吸附树脂。吸附树脂的加载部分可以是床体积的约33％至约50％。在大环内酯吸附在吸附树脂上的吸附基本完成后，将负载与剩余溶液分离。可通过过滤分离。当为了制备负载使用再循环柱方法时，所述的柱被简单地与再循环系统脱离。
用于制备所述溶液的有机溶剂优选选自四氢呋喃(THF)、丙酮、乙腈(ACN)、甲醇、乙醇、正丁醇、正丙醇、异丙醇、酯(例如乙酸乙酯)和两极性的非质子溶剂，诸如二甲基甲酰胺(DMF)，负载从该溶液荷载或沉淀。在环境洗脱温度最优选该有机溶剂是THF、丙酮或ACN。
该水的加入降低了溶剂水的比值，因此增加了大环内酯在吸附树脂上的吸附。
大环内酯溶液、吸附树脂的加载部分和水的混合可在任何适宜的装备了搅拌器的容器中进行(例如搅拌釜反应器)。
例如，在环境温度，当大环内酯是他克莫司，所述溶液可以是约100g/l，抗溶剂的体积可至少为溶液体积的五倍。但是，在较高的洗脱温度，提纯所需溶剂的量减少。吸附树脂加载部分的总体积可与溶液的体积大致相等。通过常规试验本领域的熟练工人可优化所述比例以得到大环内酯在吸附树脂的加载部分上的吸附。
在该实施方案的后续步骤中，刚才的被大环内酯荷载的的加载部分与准备好的湿吸附树脂床连接。所述床限制在合适的容器中。优选，所述床限制在柱中，优选圆形截面的柱。为了制备所述床，所需量的吸附树脂用水或水与溶剂(例如THF、ACN、甲醇、丙酮等等)的混合物浆化。当所述床直径较大时，水-溶剂组合是有益的。然后，将所述浆液转移到所需容器中，优选诸如用于柱色谱的圆筒柱。引出水(或水-溶剂组合物)，留下湿吸附树脂床。制备和填充色谱柱是熟练工人众所周知的，程序也同样，已知的实际操作可容易地适用于本发明的实施。
加载部分可作为湿吸附树脂床上面的一层与其连接。当负载是在再循环系统中制备的，盛有所述负载的容器可与保持湿吸附树脂床的容器以任何形成流体通道的方式彼此连接。
大环内酯(例如他克莫司、子囊霉素、西罗莫司、依维莫司或吡美莫司)和杂质的分离通过洗脱液通过负载、然后通过与负载连接的吸附树脂床并进行流体交换完成，从而降低所述大环内酯中杂质的浓度。任选，所述洗脱液包括另一种有机溶剂，其选自本方法第一步骤中用于溶解所述大环内酯的那些溶剂。
在负载是作为大环内酯在有机溶剂、或在与水组合的有机溶剂中的溶液提供的情况下，将所述溶液注入到所制备的湿吸附树脂床中，柱与大环内酯溶液流接触，将洗脱液引入到溶液流流过并包围的吸附树脂的加载部分，从而大环内酯样品逐渐地吸附到吸附树脂的加载部分。
在第一洗脱后，所述床可与第二个床进行流体交换，来自第一个床的流出物洗脱流过第二个床。在第一和第二床洗脱后，第二基床可以并优选与第一床脱离(即，停止流体交换)，继续单独洗脱第二床。任选，所述洗脱液是THF和水的约33体积百分比对37体积百分比的混合物。可收集洗脱液级分，用水稀释，然后可送入第三个床(柱)。任选，将另外的柱连接到所述体系，使用额外量的水稀释以得到纯产品。优选，将额外量的水加到最后一个柱以增加大环内酯在吸附树脂上的吸附。
所述洗脱液包括水和有机溶剂，温度为大于约30摄氏度至约所述溶剂的沸点温度。优选的洗脱液、特别是当他克莫司是所述大环内酯时，基本上为THF和水的混合物，含有约20体积百分比至约50体积百分比、最优选约31体积百分比至约40体积百分比的THF。当诸如甲醇、乙腈、丙酮或正丁醇的有机溶剂与所述THF-水洗脱液一起使用时，THF成分小于38体积百分比，优选在约4体积百分比和约38体积百分比之间。另一种优选的洗脱液是乙腈和水的混合物，含有约30体积百分比至约70体积百分比、最优选约40体积百分比至约65体积百分比的乙腈。当所述洗脱液是乙腈和水的混合物时，所述洗脱液还可以包括对于1份洗脱液约0.0005-约0.003份的磷酸。此外，在温度高于环境温度时，需要的溶剂的量优选在约25-约35百分比之间。
所述流出物是经所述加载和与其连接的吸附树脂床被洗脱的，其洗脱速率大体上取决于床的截面积(垂直于所述洗脱液流测定)。优选所述流速(相对于所述截面积)小于约25厘米/小时，优选小于约15厘米/小时。较低的洗脱速率增加时间，但是提高了分离效率。为了得到增加的分离效率，优选的洗脱速率是约9厘米/小时至约11厘米/小时。
从吸附树脂床流出的流出物(即，所述流出物)根据固定相(例如静止床)上化学物质的择优保留以一个级分或多个级分收集，这对于使用例如色谱法的分离方法的熟练工人是惯常的。
洗脱的级分成分和组成可通过适合的方法监控。在大环内酯中杂质的检测和定量分析，特别是在他克莫司中的子囊霉素和二氢他克莫司，可通过下文所述的HPLC方法进行。
根据特别是柱负荷和洗脱液的组成和流速，收集主要部分，从而最终分离的产品有约0.1面积百分比或更少(通过如下所述的HPLC)的杂质子囊霉素。
如果需要，与杂质分离并因此具有降低的杂质浓度的大环内酯可用任何传统方法(例如萃取、冷冻干燥、蒸发、加成抗溶剂)从流出物中分离。作为有用的抗溶剂可提到水、烷烃和环烷烃。分离方法可进行组合。例如，抗溶剂可与浓缩的洗脱液合并。
优选的分离方法包括在70摄氏度或更低、优选60度摄氏度或更低、优选在760mmHg或更低的压力浓缩所述主要部分至其初始体积的约50％，由此获得浓缩的大环内酯级分。优选在浓缩前以每升洗脱液约1-约10ml的量加入磷酸以稳定大环内酯。
任选浓缩的主要级分在环境温度保持一段保持时间。当采用保持时间时，优选保持时间为大约1-4天。
不溶于水的溶剂(诸如乙酸乙酯或二氯甲烷)和碱(诸如氢氧化钠、有机胺或氨溶液)加入到所述浓缩的大环内酯级分，分离所述不溶于水的溶剂相，浓缩以获得大环内酯晶体。加入碱直到pH为约9或更小。
杂质降低的大环内酯的晶体通过任何传统方法回收，例如过滤(重力过滤或真空过滤)。
进一步地减少杂质可通过将回收的产品进行一些附加处理(诸如结晶和重结晶)实现。
通过本发明方法实现的大环内酯中杂质的减少可通过下文描述的HPLC方法监控。
正如以上讨论的，用吸附树脂色谱法采用大于约30摄氏度至所述溶剂沸点温度的洗脱温度可用于改进大环内酯的提纯，诸如他克莫司、子囊霉素、西罗莫司、依维莫司和吡美莫司。
在溶剂和水洗脱液中所用的有机溶剂的量取决于所需要的分离选择性。当有机溶剂浓度增加，分离选择性降低，因此高于某个界限，在洗脱过程中没有分离选择性。大环内酯不可溶于水，在有机溶剂水的混合物中仅有适中的溶解度，其中有机溶剂浓度小于上述讨论到的分离选择性界限。
在另一方面，本发明涉及用上述方法制备的大环内酯，特别是他克莫司、子囊霉素、西罗莫司(雷帕霉素)、依维莫司和吡美莫司。
通常，大于约30摄氏度至约所述溶剂(包括在洗脱液中的)沸点温度的洗脱温度提供了用吸附树脂色谱法对大环内酯的有效提纯，改进了最终产物的纯度和/或降低了所需溶剂的量。洗脱液中的有机溶剂成分由分离选择性决定。大于约30摄氏度至约所述溶剂的沸点温度的洗脱温度产生了更好的分离选择性，并可使用更大量的溶剂。
实施例所用色谱分析条件柱ZORBAX SB-C18 75×4.6mm；3.5μm预分离柱Symmetry Shield RPl 83.9×20mm；5μm洗脱液A将200ml的乙腈量入2000ml容量瓶，然后用蒸馏水稀释到2000ml总体积，随后加入100μl的50％乙酸。
B将100μl的50％乙酸加入2000ml乙腈。
梯度表
流速2.3ml/mm检测波长210nm注入体积20μl样品的溶剂乙腈柱单元温度60摄氏度分析时间27分钟他克莫司的停留时间约14分钟杂质子囊霉素(RRT0.95)、二氢他克莫司(RRT1.25)和他克莫司的异构体(RRT1.19)的停留时间以他克莫司为基准，表示为相对于色谱中所有峰的面积的面积百分比。
实施例根据本发明在上文列出的条件下进行的许多试验的结果如表1所示。
实验的起始物质是他克莫司粗产物。10g所述粗他克莫司产品溶解和吸附于AMBERLITE XAD 1180吸附树脂，树脂在3.2cm直径、1m高的柱中。每个试验使用约610ml所述的吸附树脂。如表1所述进行洗脱，洗脱速率为90ml/小时。收集级分，其中每个级分的体积为90ml。
用上述分析方法分析一些级分。合并适合的级分，将少量磷酸加入到合并的级分中。然后减压浓缩合并的级分，出去溶剂成分的大部分(浓缩的体积约为起始体积的1/3)。将少量氢氧化铵溶液加入到所述浓缩物中，用醋酸乙酯(所述浓缩物体积的1/4)萃取所述浓缩物的活性物质。
在减压下蒸发少量溶液形成醋酸乙酯相的固体成分。醋酸乙酯相在减压下浓缩到计算的固体物质质量的1.9倍。将环己烷加入到浓缩物中，用量为计算的固体物质的体积的6倍。将水加入到溶液中1小时，用量为计算的固体物质体积的0.2倍。然后在环境温度搅拌1小时。之后将晶体悬浮液保持在约5摄氏度约20小时。过滤晶体，用100ml正己烷悬浮。在不超过70摄氏度干燥至少12小时得到固体产物。
表权利要求
1.一种用于提纯大环内酯方法，包括a)提供大环内酯负载；b)将大环内酯负载加载到吸附树脂床上；c)洗脱液含有至少一种选自THF、乙腈、正丙醇、异丙醇、乙醇以及丙酮和水的有机溶剂，用洗脱液在大于约30摄氏度至约所述溶剂的沸点温度的温度洗脱得到流出物；d)收集所述流出物的主要部分；和e)回收大环内酯。
2.权利要求1的方法，其中大环内酯选自子囊霉素、西罗莫司、依维莫司和吡美莫司。
3.权利要求1的方法，其中所述吸附树脂是AMBERLITE(R)XAD1180。
4.权利要求1的方法，其中负载是大环内酯在有机溶剂、或在与水联合使用的有机溶剂中的溶液。
5.权利要求1的方法，其中负载是大环内酯，其被吸附到吸附树脂的加载部分。
6.权利要求5的方法，其中吸附包括制备大环内酯在有机溶剂中的溶液，将溶液与吸附树脂的一部分和水混合，将被吸附的负载与剩余溶液分离。
7.权利要求6的方法，其中所述吸附树脂的一部分与制备床所用的相同。
8.权利要求6的方法，其中所述吸附树脂的一部分与制备床所用的吸附树脂不同。
9.权利要求6的方法，其中通过过滤分离。
10.权利要求6的方法，其中所述有机溶剂选自四氢呋喃(THF)、丙酮、乙腈(ACN)、甲醇、乙醇、正丁醇、正丙醇、异丙醇、酯(例如乙酸乙酯)和两极性的非质子溶剂，诸如二甲基甲酰胺(DMF)。
11.权利要求10的方法，其中所述有机溶剂是THF、丙酮或乙腈。
12.权利要求1的方法，其中吸附树脂床限定在一个柱中。
13.权利要求1的方法，其中在步骤c)的洗脱液含至少一种有机溶剂。
14.权利要求13的方法，其中所述有机溶剂选自四氢呋喃(THF)、丙酮、乙腈(ACN)、甲醇、乙醇、正丁醇、正丙醇、异丙醇、酯(例如乙酸乙酯)和两极性的非质子溶剂，诸如二甲基甲酰胺(DMF)。
15.权利要求1的方法，其中所述洗脱液是THF和水的约20体积百分比对约50体积百分比的混合物。
16.权利要求15的方法，其中所述洗脱液是THF和水的约31体积百分比对约40体积百分比的混合物。
17.权利要求1的方法，其中所述洗脱液流速小于约25厘米/小时。
18.权利要求17的方法，其中所述洗脱液流速小于15厘米/小时。
19.权利要求18的方法，其中所述洗脱液流速为约9厘米/小时至约11厘米/小时。
20.权利要求1的方法，其中在步骤d)之前，所述床与第二吸附树脂床流体连通。
21.权利要求20的方法，其中第二床与第一床脱离。
22.权利要求20的方法，进一步包括将另外的吸附树脂床连接到所述体系。
23.权利要求22的方法，其中将额外量的水加入到最后一个柱。
24.权利要求1的方法，其中在步骤e)的回收包括在磷酸存在下，在约70摄氏度或更低的温度，在约760mmHg或更低的压力，浓缩主要的级分，加入水不混溶的溶剂和碱，分离水不混溶溶剂相并将其浓缩。
25.权利要求24的方法，其中所述水不混溶溶剂是乙酸乙酯或二氯甲烷。
26.权利要求24的方法，其中所述的碱选自氢氧化钠、有机胺或氨溶液。
全文摘要
提供了用于提纯大环内酯的方法，其中大环内酯负载置与湿吸附树脂床相邻放置，负载和床在大于30摄氏度的温度用有机溶剂洗脱液洗脱，有机溶剂选自THF、乙腈、正丙醇、异丙醇、乙醇和丙酮，收集洗脱液的中间级分，收集提纯的大环内酯。
文档编号C07D498/00GK101084228SQ200580043951
公开日2007年12月5日 申请日期2005年12月22日 优先权日2004年12月22日
发明者V·克里, Z·乔维克 申请人:特瓦药厂私人有限公司