专利名称：一种蛋白质－核酸嵌合体及其制造方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明是一种蛋白质-核酸嵌合体及其制造方法和应用，属于蛋白质-核酸嵌合体及其制造方法和应用的创新技术。
背景技术：
蛋白质是生物体的重要功能分子。它们决定了细胞的形态，结构和各种功能。因此虽然蛋白质由基因编码，但生物体的正常功能最终涉及到各种蛋白质之间的协调。研究蛋白质的表达，调控；不同的蛋白间的作用，及大量的不同的蛋白质组之间的作用就具有重大意义。蛋白质组学的研究有助于对生命的认识，及提供各类生物学的信息，用于诊断及医药开发。
目前为止，基因组学的研究已产生大量的基因序列。可是，目前对这些基因序列的生物学意义的理解相对于数据而言，是很少的。而且基因组学的研究成果是不能直接转化为蛋白质学的数据，因为理论上只有60％的基因组学数据与蛋白质学的相符。因此有必要发明新的方法学用于蛋白质组学方面的研究及在医学方面的应用。
目前已有若干蛋白质芯片的发明，全部应用各种不相同的点焊技术。如非特异的表面吸附；表面化学涂层，用共价联接；这二种方法的主要缺点是蛋白质只能随机地，多位点的和表面结合。结果是功能位点被覆没。第三种方法是亲和表面涂层。用Ni2+或avidin。而且这几种方法都不能区别蛋白质的复合成分。并且这几种方法都不成熟，且不易改进。主要问题是蛋白点焊技术尚不过关，且是否能过关值得怀疑。其原因在于各种蛋白结合到芯片上的能力各不相同，且大多蛋白易于降解；第二大问题是蛋白需在温性环境下结合到芯片上，极不易运输及保存。
发明内容
本发明的目的在于考虑上述问题而提供一种用途广泛的蛋白质-核酸嵌合体。
本发明的另一目的在于提供一种简单方便的蛋白质-核酸嵌合体及其制造方法。
本发明的另一目在于提供将蛋白质-核酸嵌合体制造方法应用于制造各种密度蛋白质芯片，或运用于制造可定向位置，基于DNA芯片或纳米芯片的蛋白质，抗体芯片，还可用于制造有特异性细胞导向的antisense或siRNA药物。
本发明蛋白质-核酸嵌合体，由蛋白部分(P)和核酸部分(N)及联结俩者之间的蛋白质结合底物(SE)组成一个P-N-Block。
上述蛋白部分(P)含有兴趣蛋白(Pi)，结合蛋白质(PE)，和多肽标记(Pt)。
上述核酸部分(N)含有DNA或带标记物的DNA(No)及连锁物(NL)。
本发明蛋白质-核酸嵌合体的制造方法，其特征在于包括有如下步骤1)把兴趣蛋白(Pi)与结合蛋白质(PE)及多肽标记(Pt)通过分子生物学的方法嵌合形成蛋白部分；2)通过化学合成的方法把可分解或不可分解的连锁物(NL)与带或不带标记的Oligonucleotide联接形成核酸部分；3)通过生物化学的方法把蛋白质结合底物(SE)与核酸部分相联；4)通过生物化学方法把蛋白部分与核酸部分相联。
上述兴趣蛋白(Pi)指生物界中所有的种类的蛋白质，结合蛋白质(PE)指生物界中所有种类的具有不可逆抑制底物的酶，或其它与蛋白质结合底物共价相联的蛋白质，多肽标记(Pt)指生物界中所有的种类的可用于标记的多肽。
上述核酸是DNA或带标记物的DNA(No)指化学合成的Oligo和单，双链DNA片断。
上述核酸指可转录为生物界中所有种类的蛋白质的基因序列，每一个核酸带有各自的特异的基因序列。
上述连锁物(NL)指带有特异化学基团并合成到核酸上的分子。
上述制造蛋白质-核酸嵌合体多聚体的方法运用于制造各种密度蛋白质芯片，或运用于制造可定向位置，基于DNA芯片或纳米芯片的蛋白质，抗体芯片，还可用于制造有特异性细胞导向的antisense或siRNA药物。
上述各种密度蛋白质芯片指结合到载体上的带标记的一个P-N-Block至多个P-N-Block形成的蛋白质芯片。
上述可定向位置，基于DNA芯片或纳米芯片的蛋白质，抗体芯片指各个P-N-Block各自带有特异的基因序列，可被DNA芯片或纳米芯片上的互补的基因序列所识别。
上述蛋白质-核酸嵌合体多聚体可用于核酸药物的传输。
上述制造蛋白质-核酸嵌合体方法还应用在提供监测蛋白质间相互作用的如下方法1)提供各自带有特异的基因序列的P-N-Block2)提供监测带有特异的基因序列的P-N-Block的方法。
本发明的蛋白质-核酸嵌合体用途广泛。本发明蛋白质-核酸嵌合体的制造方法简单方便。本发明蛋白质-核酸嵌合体制造方法可应用于制造各种密度蛋白质芯片，或运用于制造可定向位置，基于DNA芯片或纳米芯片的蛋白质，抗体芯片，还可用于制造有特异性细胞导向的antisense或siRNA药物。
图1为本发明概述P-N-Block的组成，结构及其制造总过程的示意图；图2-A为本发明蛋白部分制造的示意图；图2-B为Pi-PE之间，可有多种组合的可能性，可表达形成整个基因组中所有的蛋白质的示意图；图3-A为本发明通过化学合成的方法把可分解或不可分解的连锁物(NL)在CPG柱上合成的示意图；图3-B指可光解NL的示意图；图3-C图解可酸解的NL的合成过程的示意图；图4-A为本发明结合蛋白质(PE)及其相对应的不可逆抑制底物及其衍生物(SE)的示意图；图4-B为本发明图解核酸部分(NL-NO)与SE之间的生化反应，形成SE-NL-NO的示意图；图4-C为本发明图解核酸部分(NL-NO)与GSH之间的生化反应，形成SE-NL-NO的示意图；图5-(a)为本发明Pi不变，NO为代表整个基因组的寡核苷酸(oligonucleotide)的P-N-Block的组合的示意图；图5-(b)为本发明NO不变，Pi代表整个基因组所编码的蛋白质的示意图；图5-(c)为本发明NO和Pi之间的任意组合的示意图；图6-A为本发明制备SE的五个主要步骤的示意图；图6-B为本发明制备NL-NO的示意图；图6-C为本发明合成BCL2-AGT-BG/D1-NL-NO(x)的示意图；图7-A为本发明制造可酸解的一个P-N-Block的流程图；图7-B为本发明蛋白部分(PA-ACP)制备的示意图；图7-C为本发明可酸解的一个P-N-Block的合成的示意图8-A为本发明比较MCF-7细胞中BCL2和BAX的蛋白量的示意图；图8-B为本发明比较雌激素对MCF-7细胞中BCL2和BAX的蛋白量的影响的示意图；图9为本发明制造可光解的一个非标记SE-NL-NO(GSH-(PC)NO)的流程图；图10为本发明利用cantilever的生物敏感器的反应的全过程的示意图；图11为本发明制造可酸解的ErbB-2的antisense oligonucleotides及对细胞的作用的示意图。
具体实施例方式实施例本发明蛋白质-核酸嵌合体制造的总过程如图1所示，由蛋白部分(P)和核酸部分(N)及联结俩者之间的蛋白质结合底物(SE)组成一个P-N-Block。蛋白部分(P)含有兴趣蛋白(Pi)，结合蛋白质(PE)，和多肽标记(Pt)。核酸部分(N)含有DNA或带标记物的DNA(No)及连锁物(NL)。
本发明制造每一个P-N-Block须要四个主要步骤1)须把兴趣蛋白与结合蛋白质及多肽标记通过分子生物学的方法嵌合形成蛋白部分；2)通过化学合成的方法把可分解或不可分解的连锁物(NL)与带(或不带)标记的Oligonucleotide联接形成核酸部分；3)须通过生物化学的方法把蛋白质结合底物(SE)与核酸部分相联；4)再通过生物化学方法把蛋白部分与核酸部分相联。
本发明可用于制造基于DNA芯片或纳米芯片的快速，水性蛋白质芯片包括抗体芯片。本发明还可用于制造有特异性细胞导向的antisense或siRNA药物。
具体的表达为，在第一主要步骤中，须要通过分子生物学的克隆方法把兴趣蛋白与结合蛋白质相嵌合形成蛋白部分。更具体的表达为将兴趣蛋白与带有TAG(Pt)，如HIS，FLAG多肽的结合蛋白相联。形成蛋白部分，表达为兴趣蛋白-结合蛋白分子-TAG(即为Pi-PE-Pt)。更具体的表达为图2A，在选用合适的表达载体(expression vector)后，蛋白Pi，PE，Pt各部分可用分子生物学的方法通过PCR放大相联或在相关的酶切位点各自插入相应Pi，PE和Pt，以得到Pi-PE-Pt表达载体(expression vectors for Pi-PE-Pt)。表达载体可为原核生物或真原核生物的表达载体。表达载体在导入细菌或动物细胞后，表达兴趣蛋白-结合蛋白分子-TAG。更具体的表达如图2B所示，Pi-PE之间，可有多种组合的可能性，跟据具体的需要可以得到多样的蛋白部分。因此各种兴趣蛋白可通过cDNA表达形成整体的生物体蛋白组。另一具体的表达，Pi可以是各种不同的其中蛋白；其中的兴趣蛋白也可特指为抗体结合蛋白。更具体的表达指protein A，G，L及各类可以抗体结合的蛋白。PE指可与不可逆抑制底物结合的酶。同样，本发明不限定只使用图2B所示的几种兴趣蛋白(Pi)和结合蛋白质(PE)。可以是整个基因组中所有的蛋白质。本发明所指基因组，表达为人类基因组，鼠基因组及其它所有动，植物的基因组。
在第二主要步骤中，通过化学合成的方法把可分解或不可分解的连锁物(NL)与带(或不带)标记的DNA联接形成核酸部分(NL-NO)。具体的表达为DNA可以是单链DNA也可以是双链DNA。更具体的表达为DNA可以是DNA长片段(fragment)也可以是通过化学合成的寡核苷酸(oligonucleotide)。再具体的表达如图3。Oligo可在CPG柱上合成。另一具体的表达为，oligonucleotide是带有一组特异DNA序列。更具体的表达为一DNA序列与其他的每一个DNA序列各不相同，所以各具特异的DNA序列。以代表特定生物体中的所有基因序列。更具体的表达为，各序列的长度为10-99个碱基对。在5’端可以被修饰，形成带-NH2，-COOH，-SH，phosphate基团或带acrylic acid基团的末端(图3A)。另一具体的表达为，oligonucleotide可带有标记。更具体的表达为，在3’端带上带有Cy5或Cy3或6-FAM标记。另一具体的表达为，连锁物(NL)是一个化学linker，是可以通过化学或生物反应切断的分子。更具体的表达为可光解(图3B)，酸解的分子(图3C)或fluoride-cleavable phosphoramidite。另一具体的表达为可光解或酸解之oligonucleotide的5’端可以为其它任何可和蛋白质结合底物(SE)，如酶的不可逆抑制底物相联的基团，如-NH，-OH，-SH。
在第三主要步骤中须要通过生物化学方法把蛋白质结合底物(SE)联接到核酸部分的连锁物(NL)，形成蛋白质结合底物(SE)-NL-NO(图4)。具体的表达为，蛋白质结合底物可以是酶的不可逆抑制底物(irreversible substrates)或者是底物的衍生物(derivatives of substrates)。例如图4A，BG衍生物，GSH及衍生物，CO-A及衍生物，penicillin类衍生物。图4-A中所示只为范例。本发明覆盖所有的酶及其不可逆抑制底物。第三主要步骤中的生物化学反应具体的表达为图4-B。更具体的表达为核酸部分的NH键通过与连锁物(NL)(a)或(b)在pH6-7，更进一步在pH7.5的条件下，形成NL-NO。更进一步的表达，化学交联体不只限定于(a)或(b)，更可以为带长间隔(spacer)的化学交联体。在pH＞7.5的条件下，更进一步的在pH8.2的条件下，中间物(M)与酶的不可逆抑制底物(SE)形成蛋白质结合底物(SE)-NL-NO。
在第四主要步骤中具体的表达为，须要通过生物化学方法把蛋白部分与核酸部分相联形成一个P-N-Block。例如图5所示。更具体的表达为图5a，每一个P-N-Block带有各自特异的DNA序列(带有不同的OLIGO)，但具有相同的蛋白部分。例如，Pi为protein A，PE为GST；而NO则为全基因组的50mer的各种oligonucleotides。另一具体的表达为图5b，每一个P-N-Block带有各自特异的结合蛋白和蛋白质结合底物，但具有相同的DNA序列(带有相同的oligonucleotides)。另一具体的表达为图5c，每一个P-N-Block带有各自特异的结合蛋白和蛋白质结合底物，而且NO带有各自特异的DNA序列。NO和Pi之间可以形成任意或对应的组合。由此，每一个P-N-Block可以由一个基因及其编码的蛋白质相对应。因此可得到全基因组编码蛋白质的P-N-Block。
制造一个P-N-Block(AGT-BG/D1-)的总过程如图6-A所示，通过5个主要步骤合成出SE(BG/D1)。如图6-B所示，NO(x)(Oligonucleotide)的序列为CAAGTTCCTGGCCAACGTGAGCACCGTGCGACCTCCAAATATCGTTAAG。Oligonucleotide在合成时于5’修饰有Cy5基团，在3’修饰有-SH基团。在pH8.2的条件下，与NL(sulfo-SIAB)反应生成NL-NO。BG/D1在pH7的条件下与NL-NO(x)生成BG/D1-NL-NO(x)。
BCL2及AGT酶全长cDNA通过PCR放大，与6XHis和Enterokinase(E)识别序列接入pEZZ18载体。pEZZ18-6XHis-E-AGT转入E。Coli-HB101进行蛋白质生产。
将被转化的E。Coli HB101细胞溶解物加到Ni+2T柱上，使6XHis-E-PA-AGT蛋白质特异的结合到Ni+2T柱上。
如图6-C所示，BG/D1-NL-NO(x)在酸碱平衡，缓冲液置换后，加到Ni+2T柱上与柱中的6XHis-E-PA-AGT结合。形成6XHis-E-PA-AGT-BG/D1-NL-NO(x)。加入Enterokinase进行洗脱，获得BCL2-AGT-BG/D1-NL-NO(x)，并进行HPLC纯化。
图7表达基于DNA芯片的蛋白质，抗体芯片的制备。通过4个主要步骤(a-d)，可合成出CoA-oligonucleotides(SE-NL-NO，图7-A)。oligonucleotide带3’-phosphate基团，5’-Cy5/Cy3。Oligo(1)，的序列为TTATTAGCCAGAAGTCAGATGCTCAAGGGGCTTCATGATGTCCCCATAAT。
如图7-B所示，ACP酶全长cDNA通过PCR放大，与6XHis和Enterokinase识别序列接入pEZZ18载体。pEZZ18-6XHis-E-ACP转入E。Coli-HB101进行蛋白质生产。
将被转化的E。Coli HB101细胞溶解物加到Ni+2T柱上，使6XHis-E-PA-ACP蛋白质特异的结合到Ni+2T柱上。
CoA-NL-NO(1)在酸碱平衡，缓冲液置换后，加到Ni+2T柱上与柱中的6XHis-E-PA-ACP结合。形成6XHis-E-PA-ACP-CoA-NL-NO(1)(图7C)。
此时加入可以与PA结合的抗BCL2单克隆抗体，就形成6XHIS-E-(抗BCL2抗体)PA-ACP-CoA-NL-NO(1)。此时，加入Enterokinase进行洗脱，获得(抗BCL2抗体)PA-ACP-CoA-NL-NO(1)，并进行HPLC纯化。
同样，通过a-d步骤，带3’-phosphate基团，5’-Cy5/Cy3的Oligo(2)序列CAAGTTCCTGGCCAACGTGAGCACCGTGCGACCTCCAAATATCGTTAAG(NL-NO)与蛋白部分合成(抗BAX抗体)PA-ACP-CoA-NL-NO(2)。
因此，(抗BCL2抗体)-PA-ACP-CoA-NL-NO(1)和(抗BAX抗体)-PA-ACP-CoA-NL-NO(2)分别含有5’-Cy3或Cy5。即(抗BCL2抗体)-PA-ACP-CoA-NL-NO(1)(Cy5)，(抗BCL2抗体)-PA-ACP-CoA-NL-NO(1)(Cy3)和(抗BAX抗体)-PA-ACP-CoA-NL-NO(2)(Cy5)，(抗BAX抗体)-PA-ACP-CoA-NL-NO(2)(Cy3)两对(图8)。
如图8所示，比较MCF7细胞中BCL2和BAX的蛋白量。MCF7细胞经过48小时无血清37度培养。一等量MCF7细胞继续培养10小时，另一等量MCF7细胞，加入10-7nM雌激素(E2)同样培养10小时后。两部分细胞分别收取。提取蛋白质。测定蛋白量后。分别固定两部分细胞的等蛋白质量到PVDF膜上。一等量蛋白质加入(抗BCL2抗体)PA-ACP-CoA-NL-NO(1)(Cy5)和(抗BAX抗体)-PA-ACP-CoA-NL-NO(2)(Cy5)。另一等量蛋白质加入(抗BCL2抗体)PA-ACP-CoA-NL-NO(1)(Cy3)和(抗BAX抗体)-PA-ACP-CoA-NL-NO(2)(Cy3)，做为对照。在用缓冲液洗去没有结合的抗体后，用pH4。5缓冲液裂解。收取NO(1)(Cy5)，NO(2)(Cy5)和NO(2)(Cy3)，NO(2)(Cy3)。将两者混合。杂交到DNA芯片上。用芯片扫描仪测定萤光强度。因此，利用DNA芯片上的DNA互补链可测定各种蛋白质的表达。
图9表达基于cantilever芯片的生物敏感器的制备。在oligonucleotide合成时，5’端合成出可光解的oligonucleotide((PC)NO)，其序列为TTATTAGCCAGAAGTCAGATGCTCAAGGGGCTTCATGATGTCCCCATAAT。通过2个主要步骤，可合成出GSH-oligonucleotides(GSH-(PC)NO)。
如图10所示，GST酶全长cDNA通过PCR放大，与6XHis和Enterokinase识别序列接入pEZZ18载体。pEZZ18-6XHis-E-GST转入E。Coli-HB101进行蛋白质生产。
将被转化的E。Coli HB101细胞溶解物加到Ni+2T柱上，使6XHis-E-PA-GST蛋白质特异的结合到Ni+2T柱上。
GSH-(PC)NO在酸碱平衡，缓冲液置换后，加到Ni+2T柱上与柱中的6XHis-E-PA-GST结合。形成6XHis-E-PA-GST-GSH-(PC)NO。加入抗BCL2单克隆抗体(Y)，就形成6XHIS-E-(抗BCL2抗体)PA-GST-GSH-(PC)NO。此时，加入Enterokinase进行洗脱，获得(抗BCL2抗体)PA-GST-GSH-GSH-(PC)NO，并进行HPLC纯化。
如图10所示，测定MCF7细胞中的BCL2。固定50微克从MCF7细胞提取的蛋白质到PVDF膜上。加入(抗BCL2抗体)PA-GST-GSH-(PC)NO。用缓冲液洗去没有结合的抗体，用360nm紫外线裂解。收取NO后，杂交到带有互补序列的cantilever上。测定cantilever弯曲。另外surface plasmon resonace(SPR)可替代cantilever进性蛋白质测定。
核酸药物的传输如图11所示，先合成可酸解的ErbB-2的antisenseoligonucleotide(或dsRNA的可酸解其中之一条链。dsRNA的互补链则在合成后加入，退火，杂交形成双链dsRNA)。为了监测导入细胞的效率，合成时在5’端加上Cy5。
ACP酶全长cDNA通过PCR放大，接入pcDNA3。HisB载体。
pcDNA3-His-(apo)ACP-EGF转入HEK293细胞中进行无血清培养。细胞溶解物加到Ni+2T柱上，使6XHis-(apo)ACP-EGF蛋白质特异的结合到Ni+2T柱上进行蛋白质纯化。可酸解Oligo在碱平衡，缓冲液置换后，加到Ni+2T柱上与柱中的6XHis-(apo)ACP-EGF进行结合。形成Oligo-6XHis-(apo)ACP-EGF。经洗脱可得到Oligo-(apo)ACP-EGF。
Oligo-(apo)ACP-EGF可加入有表达ErbB-2的细胞(如MCF-7乳腺癌细胞)。经过EGF/ErbB-2相互作用，Oligo-(apo)ACP-EGF可导入细胞。经细胞内酸解。Oligo被释放到细胞内，起药物作用。测定荧光及抑制细胞生长的功效。
通过把EGF替换成其他兴趣蛋白(如transferrin)可获得各种有效的嵌合体。经受体调控的内吞作用(Receptor-mediated endocytosis)以完成细胞受体特异的DNA药物传输。
权利要求
1.一种蛋白质-核酸嵌合体，其特征在于由蛋白部分(P)和核酸部分(N)及联结俩者之间的蛋白质结合底物(SE)组成一个P-N-Block。
2.根据权利要求1所述的蛋白质-核酸嵌合体，其特征在于上述蛋白部分(P)含有兴趣蛋白(Pi)，结合蛋白质(PE)，和多肽标记(Pt)。
3.根据权利要求1所述的蛋白质-核酸嵌合体，其特征在于上述核酸部分(N)含有DNA或带标记物的DNA(No)及连锁物(NL)。
4.根据权利要求1所述蛋白质-核酸嵌合体的制造方法，其特征在于包括有如下步骤1)把兴趣蛋白(Pi)与结合蛋白质(PE)及多肽标记(Pt)通过分子生物学的方法嵌合形成蛋白部分；2)通过化学合成的方法把可分解或不可分解的连锁物(NL)与带或不带标记的Oligonucleotide联接形成核酸部分；3)通过生物化学的方法把蛋白质结合底物(SE)与核酸部分相联；4)通过生物化学方法把蛋白部分与核酸部分相联。
5.根据权利要求4所述的制造蛋白质-核酸嵌合体的方法，其特征在于上述兴趣蛋白(Pi)指生物界中所有的种类的蛋白质，结合蛋白质(PE)指生物界中所有种类的具有不可逆抑制底物的酶，或其它与蛋白质结合底物共价相联的蛋白质，多肽标记(Pt)指生物界中所有的种类的可用于标记的多肽。
6.根据权利要求4所述的制造蛋白质-核酸嵌合体的方法，其特征在于上述核酸是DNA或带标记物的DNA(No)指化学合成的Oligo和单，双链DNA片断。
7.根据权利要求4所述的制造蛋白质-核酸嵌合体的方法，其特征在于上述核酸指可转录为生物界中所有种类的蛋白质的基因序列，每一个核酸带有各自的特异的基因序列。
8.根据权利要求4所述的制造蛋白质-核酸嵌合体的方法，其特征在于上述连锁物(NL)指带有特异化学基团并合成到核酸上的分子。
9.根据权利要求4所述制造蛋白质-核酸嵌合体方法的应用，其特征在于上述制造蛋白质-核酸嵌合体多聚体的方法运用于制造各种密度蛋白质芯片，或运用于制造可定向位置，基于DNA芯片或纳米芯片的蛋白质，抗体芯片，还可用于制造有特异性细胞导向的antisense或siRNA药物。
10.根据权利要求9所述制造蛋白质-核酸嵌合体方法的应用，其特征在于上述各种密度蛋白质芯片指结合到载体上的带标记的一个P-N-Block至多个P-N-Block形成的蛋白质芯片。
11.根据权利要求9所述制造蛋白质-核酸嵌合体方法的应用，其特征在于上述可定向位置，基于DNA芯片或纳米芯片的蛋白质，抗体芯片指各个P-N-Block各自带有特异的基因序列，可被DNA芯片或纳米芯片上的互补的基因序列所识别。
12.根据权利要求4所述制造蛋白质-核酸嵌合体方法的应用，其特征在于上述蛋白质-核酸嵌合体多聚体可用于核酸药物的传输。
13.根据权利要求4所述制造蛋白质-核酸嵌合体方法的应用，其特征在于上述制造蛋白质-核酸嵌合体方法还应用在提供监测蛋白质间相互作用的如下方法1)提供各自带有特异的基因序列的P-N-Block2)提供监测带有特异的基因序列的P-N-Block的方法。
全文摘要
本发明是一种蛋白质－核酸嵌合体及其制造方法和应用。本发明蛋白质－核酸嵌合体，由蛋白部分(P)和核酸部分(N)及联结俩者之间的蛋白质结合底物(S
文档编号C07H21/00GK101074439SQ20061012429
公开日2007年11月21日 申请日期2006年12月19日 优先权日2006年12月19日
发明者张宏, 周岩 申请人:张宏, 周岩