专利名称：药用植物大戟3－羟基－3－甲基戊二酰辅酶a还原酶蛋白编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种在药用植物大戟中表达的Ep-Hmgr蛋白(药用植物大戟3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白，Euphorbia pekinensis 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Reductase，EpHMGR)及其核酸序列。
背景技术：
药用植物大戟(Euphorbia pekinensis)又名龙虎草、将军草、九头狮子等，在植物分类学上属大戟科，为多年生草本植物。全株含乳汁。现代医学研究发现，药用植物大戟的根具有多种药理作用，如致泻、利尿、降压等。临床一般用于治疗急、慢性肾炎水肿及晚期血吸虫病腹水或其他肝硬变腹水。研究发现药用植物大戟根含三萜类成分大戟甙、生物碱、大戟色素体A、B、C。另含树胶、树脂等。这些都为次生代谢产物。近代科学研究发现，次生代谢产物是天然活性物质，是解决目前世界面临的西药毒副作用大，癌症、艾滋病等疑难疾病无法医治等难题的一条新途径。
近年来，对许多植物材料的次生代谢的研究证明，HMGR是甲羟戊酸途径中一个关键酶。在甲羟戊酸途径中3-羟基-3-甲基戊二酸单酰CoA(HMGCoA)在HMGR的作用下生成甲羟戊酸(MVA)。由于该反应是一个不可逆过程，因此HMGR被认为是该途径中第一个限速酶。通过提高3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性或含量，可以间接的提高药用植物大戟中次生代谢产物或其前体的含量。
在对现有文献的分析中，“Plant Cell(植物细胞)，1992，4(10)1333-1344”报道了从马铃薯中克隆了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，NCBI网站上公布了橡胶树等的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的序列。但至今尚未有药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白序列及其核酸序列报道。
在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白序列及其核酸序列。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白编码序列。使其包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织，所获得的转基因植物将具有显著提高的次生代谢产物含量。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明所分离出的DNA分子包括编码具有药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第81-1832位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第81-1832位的核苷酸序列杂交。
较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第81-1832位的核苷酸序列。
本发明分离出的药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第81-1832位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第81-1832位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第81-1832位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第81-1832位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第81-1832位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，术语“药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白或多肽”指具有药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。该术语还包括具有与天然药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白相同功能的SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白多肽的血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1
表283％identity in 1198 nt over lapQuery 610 ATGGGACGATTCCTTCGTATTCTCTTGAATCGAAGCTCGGGGACTGTAAGAGAGCGGCTG669|||||| ||| || || |||||||| || ||||||||||||||||| || |||||||||Sbjct 537 ATGGGAAGATACCCTCCTATTCTCTGGAGTCGAAGCTCGGGGACTGCAAACGAGCGGCTG596Query 670 AGATTCGGCGGGAGGCTTTACAGAGGATGACGGGGAGGTCTTTGGAGGGTTTGCCTGTTG729|||||| || |||||||| ||||||||||| ||||||| |||| || ||||| || |Sbjct 597 CGATTCGACGCGAGGCTTTGCAGAGGATGACAAGGAGGTCGCTGGAAGGCTTGCCAGTAG656Query 730 AGGGATTCGATYACGAGTCGATTTTAGGTCAGTGCTGTGAAATGCCGGTTGGATATGTGC789| || |||||| |||||||||||||||| || |||||||||||||| || ||||| ||||Sbjct 657 AAGGGTTCGATTACGAGTCGATTTTAGGACAATGCTGTGAAATGCCAGTGGGATACGTGC716
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Query药用植物大戟Ep-Hmgr的核酸序列Sbjct帕拉橡胶树Hb-Hmgr的核酸序列(AF429388)表2为本发明的药用植物大戟Ep-Hmgr与帕拉橡胶树(Para rubber tree)Ps-Hmgr的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。
表383％identity in 572 aa over lap，90％simi larity in 572 aa over lapQuery 13 LHHQKRISEEVDDHRCLSPPLKASDALPLPLYLTNAVFFTLFFSVAYYLLHRWRDKIRNS72LHH+K + V+D+P KASDALPLPLYLTNAVFFTLFFSVAYYLLHRWRDKIRNSSbjct 7 LHHRKH-ATPVEDRSPTTP--KASDALPLPLYLTNAVFFTLFFSVAYYLLHRWRDKIRNS63Query 73 TPLHVVTLSEIAAIVSLIASfiyIIgffgigfVQSLIARPSHDTWDLDDADRSYLIDGDH132TPLH+VTLSEIAIVSLIASFIYLLGFFGI FVQS IAR SHD WDL+D D +YLID DHSbjct 64 TPLHIVTLSEIVAIVSLIASFIYLLGFFGIDFVQSFIARASHDVWDLEDTDPNYLIDEDH123Query 133 RLVTCSPAKVAPVNS--PPPAKMSVPEPIVSPLASEEDEEIVKSVVNGTIPSYSLESKLG190RLVTC PA+++P K+ EP+++PL SEEDE IV SVV+G IPSYSLESKLGSbjct 124 RLVTCPPANISTKTTIIAAPTKLPTSEPLIAPLVSEEDEMIVNSVVDGKIPSYSLESKLG183Query 191 DCKRAAEIRREALQRMTGRSLEGLPVEGFDXESILGQCCEMPVGYVQIPVGIAGPLLLDG250DCKRAA IRREALQRMT RSLEGLPVEGFD ESILGQCCEMPVGYVQIPVGIAGPLLL+GSbjct 184 DCKRAAAIRREALQRMTRRSLEGLPVEGFDYESILGQCCEMPVGYVQIPVGIAGPLLLNG243Query 251 REYSVPMATTEGCLVASTNRGCKAIHLSGGADSVLLKDGMTRAPVVRFTSVRRAAELKFF310REYSVPMATTEGCLVASTNRGCKAI+LSGGA SVLLKDGMTRAPVVRF S RAAELKFFSbjct 244 REYSVPMATTEGCLVASTNRGCKAIYLSGGATSVLLKDGMTRAPVVRFASATRAAELKFF303Query 311 LESPENFDSLSVVFNRSSGFAKLLNIQCTLAGRNLYMRFTCFTGDAMGMNMVSKGVQNVL370LE P+NFD+L+VVFN+SS FA+L I+C++AG+NLY+RF+C TGDAMGMNMVSKGVQNVLSbjct 304 LEDPDNFDTLAVVFNKSSRFARLQGIKCSIAGKNLYIRFSCSTGDAMGMNMVSKGVQNVL363
Query 371 EFLQSDFPDMDVLGISGNYCSDKKPAAVNWIEGRGKWvvceaiikeevvkkvLKTSVAAL430EFLQSDF DMDV+GISGN+CSDKKPAAVNWIEGRGK VVCEAII KEEVVKKVLKT+VA+LSbjct 364 EFLQSDFSDMDVIGISGNFCSDKKPAAVNWIEGRGKSVVCEAIIKEEVVKKVLKTNVASL423Query 431 VELNMVKNIagsavagsIggFNAHAANIVSAVFIATGQDPAQNVESSHCMTMMEAVNDGK490VELNM+KNLAGSAVAG+LGGFNAHA NIVSA+FIATGQDPAQNVESSHC+TMMEAVNDGKSbjct 424 VELNMLKNLAGSAVAGALGGFNAHAGNIVSAIFIATGQDPAQNVESSHCITMMEAVNDGK483Query 491 DLHISVTMPSIEVGTVGGGTQLASQSACLNLLGVKGANKESPGANARQLATIVAGSVLAG550DLHISVTMPSIEVGTVGGGTQLASQSACLNLLGVKGANKESPG+N+R LA IVAGSVLAGSbjct 484 DLHISVTMPSIEVGTVGGGTQLASQSACLNLLGVKGANKESPGSNSRLLAAIVAGSVLAG543Query 551 ELSLMSAIAAGQLVKSHLKYNRSSKDVSSFAS 582ELSLMSAIAAGQLVKSH+KYNRSSKD+S ASSbjct 544 ELSLMSAIAAGQLVKSHMKYNRSSKDMSKAAS 575Query药用植物大戟Ep-Hmgr氨基酸序列Sbjct帕拉橡胶树Hb-Hmgr氨基酸序列(AAQ63055.1)表3为本发明的药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白的氨基酸序列与帕拉橡胶树Hb-Hmgr的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。
发明还包括药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白多肽时，可以将药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白表达载体。
如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
还可用Northern印迹法技术分析药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白基因产物的表达，即分析药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白的核酸分子。
本发明涉及检测样品中是否存在药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
此外，根据本发明的药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白同源基因或同源蛋白。
为了得到与药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白基因相关的药用植物大戟cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选药用植物大戟cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用32P对药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自药用植物大戟的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白的基因家族的核苷酸序列。
本发明的药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
利用本发明的药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。本发明的药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白基因可通过基因工程技术用来提高药用植物大戟中次生代谢产物或其前体的含量，而这些次生代谢产物在临床上具有巨大的应用价值，对保护人民的健康生长有所帮助。因而本发明具有很大的应用前景。
具体实施例方式
下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白基因的克隆1.组织分离(isolation)药用植物大戟根来源于江苏省药用植物生物技术重点实验室，采取材料后，立即置于液氮中冷冻保存。
2.RNA的分离(RNA isolation)取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)根据一些植物Hmgr的氨基酸保守序列，设计兼并引物，利用同源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行(1)3’-RACEPCR(UPM+F2)得到EPF2’(1061bp)，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsingroup，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的木本植物如橡胶树(Hevea brasiliensis)等的Hmgr基因的同源性很高，故初步认为它是一个Hmgr基因。
(2)5’-RACE根据3’RACE结果，设计反向特异引物R2，经PCR(UPM+R2)得到EPR2’(1397bp)(过程同(1))。回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。
(3)将5’RACE测序结果与3’RACE测序结果比序并进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行PCR扩增Ep-Hmgr编码区(DF1+DR1)得到Ep-Hmgr编码区(1752bp)(过程同(1))。
BLAST的结果证明从药用植物大戟中新得到的基因确为一个植物Hmgr基因。通过组合使用上述3种方法，获得了候选的药用植物大戟EpHMGR的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物EpHMGRF15’-CCTCCAACTCATAAACACGCAT-3’(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸EpHMGRR15’-GTTTGTACAACAACATATG-3’(SEQ ID NO.2)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，EpHMGRF1/EpHMGRR2的PCR条件为94℃5分钟，随之以94℃1分钟、58℃1分钟和72℃2分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为2162bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQID NO.3所示的序列。
实施例2药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白基因的序列信息与同源性分析本发明新的药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白全长cDNA的长度为2200bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于81-1832位核苷酸。根据全长cDNA推导出药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白的氨基酸序列，共583个氨基酸残基，分子量62710.33，pI为6.51。详细序列见SEQ ID NO.4。
将药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank +EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与帕拉橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(AF429388)在核苷酸水平上具有较高的同源性(附表2)；在氨基酸水平上，它与帕拉橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(GenBank Accession No.AAQ63055.1)有83％的相同性和90％的相似性(见表3)。由此可见，药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白与帕拉橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，故可以认为药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白在功能上也相似。
实施例3药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白在大肠杆菌中进行原核表达及提纯在该实施例中，将全长的药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。
将药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白多肽以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达。
原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌根据药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白的氨基酸序列，设计蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pET32a(+)载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pET32a(+)载体(Novagen)。鉴定好的表达载体利用CaCl2方法转入大肠杆菌BL21，筛选鉴定得到含有pET32a(+)-3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶表达载体的工程菌BL21-pET32a(+)-3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶。
表达Trx-Ep-Hmgr重组蛋白的工程菌的分离鉴定挑取单菌落的BL21-pET32a(+)-Ep-Hmgr工程菌于3mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD600达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1mL菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μL，蒸馏水45μL，二巯基乙醇5μL)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达Trx-3-Ep-Hmgr融合蛋白的工程菌。
Trx-3-Ep-Hmgr融合蛋白的提取纯化按上述方法诱导表达Trx-Ep-Hmgr融合表达蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-Ep-Hmgr，经离心沉淀收集菌体，并根据厂家(Novagen)的说明书以BugBuster试剂和Benzonase核酸酶来纯化包涵体。包涵体可用溶解缓冲液(50mM CAPS，pH11.0，0.3％N-lauroylsarcosine)来溶解，再用透析缓冲液(200mM Tris-HCl，pH8.5)来透析。然后用组氨酸结合(His·Bind)树脂进行亲和层析，并经洗脱缓冲液(1Mimidazole，500mM NaCl，20mM Tris-HCl pH 7.9)洗脱来收集Trx-Ep-Hmgr融合蛋白。融合蛋白经肠激酶20℃酶切16小时后即可分离获得Ep-Hmgr的表达蛋白。
纯化的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活力测定按Thorsness等(Mol.Cell.Biol，1989，95702-5712)的方法对表达纯化的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶进行酶活力的测定，研究在其作用下3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A生成甲羟戊酸的能力。反应体系含有0.05M Tris-HCl(pH＝7.5)，5mM DTT，200mMNADPH，300mM14C标记的乙酰辅酶A(1mCi/mmol)及20mM磷酸葡萄糖，每毫升9.75mU磷酸葡萄糖脱氢酶用于NADPH的再生，总体积为100uL。反应流程如下首先加入400mg蛋白质37℃水浴15分钟，使3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化成甲羟戊酸。反应终产物和酶作用物在Bio-Rex5柱子上分离，反应终产物可从柱子中水洗下来。用液体闪烁记数器测定14C标记的反应终产物的含量。结果表明，表达的蛋白的确具有催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A生成甲羟戊酸的酶活性。
实施例4药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白在烟草中进行真核细胞表达将含目的基因(药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白基因)的表达载体的构建，根据药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白的全长序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白基因cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和pCAMBIA1301)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物烟草。
利用叶盘法转化烟草1.用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落，接种于2mL YEB液体(Sm+，Kan+)，28℃，200rpm振荡培养24-36小时；2.室温下4,000g离心10min；3.弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；4.取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；5.将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；6.把经侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；7.将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan 50mg/L+cb250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；8.约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan25mg/L)上进行生根培养，2-7天左右生根；
9.等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。利用Northern blotting检测Ep-Hmgr蛋白在转基因烟草植株中的表达1.RNA的提取待转基因烟草叶片长到2-3片叶时抽取烟草叶的RNA。以正常生长的植株作为对照(条件同上)，利用TRIzol试剂盒(GIBCO BRL，USA)提取并参考《分子克隆》有关RNA的制备章节(Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD260；RNA含量计算1OD260＝40μg/mL。
3.总RNA琼脂糖凝胶电泳分离1)取6mL25×(倍)电泳缓冲液，加入117mL无菌水，混匀。2)称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化，转入55℃水浴中。3)于通风橱中取26.8mL甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混匀。4)迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5)将提取的RNA(20μg)溶解于RNA变性溶液中，在65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。6)在样品中加入2uL10×上样缓冲液，混匀。7)在电泳液未盖过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳5小时左右。
4.RNA尼龙膜上转移1)转移之前，将尼龙膜用10×SSC浸泡。2)将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2×SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。3)滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。4)转移后，将膜于80℃烘烤2小时。
5.膜上杂交信号的检出1)将膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/mL鲑鱼精DNA]，65℃下预杂交2小时。2)将用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabellingmodule标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入1)的杂交液中，于65℃杂交16-24小时。3)取出膜，置于洗膜液I(1×SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1×SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分钟。4)用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。Northern杂交表明转基因烟草的Ep-Hmgr转录水平比未转基因的对照材料的表达水平明显高得多。
含药用植物大戟3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(Ep-Hmgr)的转基因烟草植株中的Ep-Hmgr蛋白活性测定1.蛋白的提取a)取500mg叶片，加入1000uL1×PBS(KH2PO40.2 g/L，Na2HPO41.15g/L，KCl 0.2 g/L，NaCl 8g/L)于50mL eppondorf管中研磨；b)13000rpm，4℃离心10分钟；c)取上清，备用。注以上过程于冰上进行。
2.蛋白的定量参考Bradford法(Bradford，1976)。取2uL蛋白样品，加入1mL Bradford试剂，混匀后，分光光度计测OD595；蛋白含量计算1OD595＝28.57μg。
3.Al-Hmgr蛋白活性测定 参考Thorsness等(Mol.Cell.Biol，1989，95702-5712)的方法(详细操作过程同实例3)。结果表明，转基因烟草植株的中的Ep-Hmgr蛋白酶活性比没有转基因的对照明显高得多(P＜0.05)。从而再次证明所克隆的药用植物大戟3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的确具有催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A生成甲羟戊酸的酶活性，将可用于利用转基因技术来提高植物的次生代谢产物的研究和产业化中。
本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1CCTCCAACTCATAAACACGCAT(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度19bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.2GTTTGTACAACAACATATG
(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)长度2200bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度583氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型多肽(iii).序列描述SEQ ID NO.4<110>徐州师范大学<120>药用植物大戟3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白编码序列<130>药用植物大戟3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白编码序列及应用<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2200<212>DNA
<213>药用植物大戟Euphorbia pekinensis<220>
<221>CDS<222>(81)..(1832)<400>1acgcggggcc tccaactcat aaacacgcat tcaaacacct cctctactct cttccttcca 60cctcctcctc ctccaccacc atg gat tcc acc aaa tcg cgg cgg ccg atc cgc113Met Asp Ser Thr Lys Ser Arg Arg Pro Ile Arg1 5 10cac otc cac cac caa aaa cgc atc tcc gaa gag gtt gac gac cac cgc 161His Leu His His Gln Lys Arg Ile Ser Glu Glu Val Asp Asp His Arg15 20 25tgt ctc tca ccg cct ctc aaa gcc tcc gac gct ctc cct ctc cct ttg 209Cys Leu Ser Pro Pro Leu Lys Ala Ser Asp Ala Leu Pro Leu Pro Leu30 35 40tat cta acc aat gcc gtt ttc ttc acc ctc ttt ttc tcc gtc gcc tat 257Tyr Leu Thr Asn Ala Val Phe Phe Thr Leu Phe Phe Ser Val Ala Tyr45 50 55tac ctc ctc cac cgg tgg agg gac aag atc cgt aac tcc act cct ctc 305Tyr Leu Leu His Arg Trp Arg Asp Lys Ile Arg Asn Ser Thr Pro Leu60 65 70 75
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aag ctc ggg gac tgt aag aga gcg gct gag att cgg cgg gag gct tta689Lys Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Glu Ile Arg Arg Glu Ala Leu190 195 200cag agg atg acg ggg agg tct ttg gag ggt ttg cct gtt gag gga ttc737Gln Arg Met Thr Gly Arg Ser Leu Glu Gly Leu Pro Val Glu Gly Phe205 210 215gat tac gag tcg att tta ggt cag tgc tgt gaa atg ccg gtt gga tat785Asp Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val Gly Tyr220 225 230 235gtg cag att ccg gtt gga att gcc ggt ccg ttg ctg ctg gat ggg cga833Val Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly Arg240 245 250gag tac tct gtt ccg atg gcg act acc gag ggc tgt ttg gtg gct agc881Glu Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser255 260 265act aac aga ggg tgt aag gcg att cat ctg tcc ggt ggt gcc gac agt929Thr Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile His Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ser270 275280gtc ctg ttg aag gat ggc atg aca aga gct ccc gtt gtt cgg ttc aca977Val Leu Leu Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Thr285 290 295tcg gtg agg agg gct gct gaa ttg aag ttt ttc tta gag agt cct gag1025
Ser Val Arg Arg Ala Ala Glu Leu Lys Phe Phe Leu Glu Ser Pro Glu300 305 310 315aat ttc gat agc tta tcc gtc gtt ttc aat agg tcc agt gga ttt gca1073Asn Phe Asp Ser Leu Ser Val Val Phe Asn Arg Ser Ser Gly Phe Ala320 325 330aag ctc cta aac ata caa tgc act cta gcc ggg agg aat cta tat atg1121Lys Leu Leu Asn Ile Gln Cys Thr Leu Ala Gly Arg Asn Leu Tyr Met335 340 345aga ttc acc tgc ttc act ggt gat gca atg ggg atg aac atg gtt tcc1169Arg Phe Thr Cys Phe Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser350 355 360aaa ggg gtc caa aac gtc ctt gag ttc ctt caa agt gat ttc cct gac1217Lys Gly Val Gln Asn Val Leu Glu Phe Leu Gln Ser Asp Phe Pro Asp365 370 375atg gat gtt ctg ggc atc tca gga aat tat tgt tcc gac aaa aag cca1265Met Asp Val Leu Gly Ile Ser Gly Asn Tyr Cys Ser Asp Lys Lys Pro380 385 390 395gcc gca gtg aac tgg att gaa gga cga ggc aaa tgg gtt gtc tgt gag1313Ala Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Trp Val Val Cys Glu400 405 410gcg att atc aag gaa gag gtg gtg aag aag gtg ttg aag act agt gtt1361Ala Ile Ile Lys Glu Glu Val Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Ser Val
415 420425gct gca cta gtg gag ctg aac atg gtc aag aat ctg gct ggttca gct1409Ala Ala Leu Val Glu Leu Asn Met Val Lys Asn Leu Ala Gly Ser Ala430 435 440gtt gct ggg tct ctt ggt gga ttc aat gca cat gct gct aac ata gtc1457Val Ala Gly Ser Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ala Asn Ile Val445 450 455tct gca gtt ttc att gcc act ggc cag gat cca gcc cag aat gtt gag1505Ser Ala Val Phe Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu460 465 470 475agc tct cac tgc atg acc atg atg gaa gct gtc aat gat gga aag gat1553Ser Ser His Cys Met Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Lys Asp480 485 490ctc cac atc tct gta acc atg ccc tcg att gag gtg ggc acg gtt gga1601Leu His Ile Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val Gly495 500 505gga ggt act cag cta gca tca cag tca gct tgc ctg aac ttg ctt ggt1649Gly Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly510 515 520gta aaa gga gca aat aaa gaa tca cca gga gca aac gca agg caa ctc1697Val Lys Gly Ala Asn Lys Glu Ser Pro Gly Ala Asn Ala Arg Gln Leu525 530 535
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<213>药用植物大戟Euphorbia pekinensis<400>2Met Asp Ser Thr Lys Ser Arg Arg Pro Ile Arg His Leu His His Gln1 5 10 15Lys Arg Ile Ser Glu Glu Val Asp Asp His Arg Cys Leu Ser Pro Pro20 25 30Leu Lys Ala Ser Asp Ala Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu Thr Asn Ala35 40 45Val Phe Phe Thr Leu Phe Phe Ser Val Ala Tyr Tyr Leu Leu His Arg50 55 60Trp Arg Asp Lys Ile Arg Asn Ser Thr Pro Leu His Val Val Thr Leu65 70 75 80Ser Glu Ile Ala Ala Ile Val Ser Leu Ile Ala Ser Phe Ile Tyr Leu85 90 95Leu Gly Phe Phe Gly Ile Gly Phe Val Gln Ser Leu Ile Ala Arg Pro
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565 570575Val Ser Ser Phe Ala Ser Ser580
权利要求
1.一种药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白编码序列，其特征在于，所分离出的DNA分子包括编码具有药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第81-1832位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第81-1832位的核苷酸序列杂交。
2.根据权利要求1所述的药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白编码序列，其特征是，分离出的药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白编码序列，其特征是，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第81-1832位的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白编码序列，其特征是，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
5.根据权利要求4所述的药用植物大戟Ep-Hmgr蛋白编码序列，其特征是，所提供的载体DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。
全文摘要
一种药用植物大戟Ep－Hmgr蛋白编码序列，属于基因工程领域。所分离出的DNA分子包括编码具有药用植物大戟Ep－Hmgr蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第81－1832位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40－55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第81－1832位的核苷酸序列杂交。本发明是一种3－羟基－3－甲基戊二酰辅酶A的还原酶，有助于提高药用植物大戟中次生代谢产物或其前体的含量，对于保护人民的健康生长有所帮助。
文档编号C07K14/415GK1936004SQ20061012579
公开日2007年3月28日 申请日期2006年8月28日 优先权日2006年8月28日
发明者曹小迎, 蒋继宏, 陈凤美, 冯友建, 孙勇 申请人:徐州师范大学