用人源化抗cd16a抗体治疗自身免疫疾病的方法

专利名称：用人源化抗cd16a抗体治疗自身免疫疾病的方法
专利说明用人源化抗CD16A抗体治疗自身免疫疾病的方法 本申请要求2005年7月11日提交的美国临时申请第60/698,623号的权利，该申请通过引用整体结合到本文中。
发明领域
本发明涉及CD16A结合蛋白和治疗免疫疾病的方法。本发明适用于生物医学和免疫学领域。

背景技术：

Fcγ受体(FcγR)是结合免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc区的细胞表面受体。这些受体的各种功能中有一个是使抗体-抗原复合物的形成与效应细胞反应相偶联。例如，免疫复合物对激活性Fcγ受体的交联可导致对病原体的吞噬、通过直接细胞毒性杀死外来细胞和转化细胞、对毒性物质的清除和对炎性反应的引发。值得注意的是，Fcγ受体在自身免疫性中起到关键的作用。结合激活性Fc受体的自身抗体能引发自身免疫疾病的继发症(pathogenic sequelae)，如特发性血小板减少性紫癜、关节炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性溶血性贫血及其它疾病。

在人类和啮齿动物中有三类Fcγ受体，称为FcγRI、FcγRII和FcγRIII(参见Ravetch和Bolland，2001 Annual Rev.Immunol.19275-90；Ravetch和Kinet，1991，Annual Rev.Immunol.9457-92)。FcγRI位点通常被单体IgG占据，而RII和RIII受体则通常不被占据，可供与免疫复合物发生相互作用。FcγRI也称CD64，能以高亲和力结合单体IgG，存在于单核细胞和巨噬细胞上。FcγRII也称CD32，能以中等亲和力结合多聚IgG(免疫复合物或聚合IgG)，存在于多种细胞类型上，包括B细胞、血小板、嗜中性白细胞、巨噬细胞和单核细胞。FcγRIII也称CD16，能以中等亲和力结合多聚IgG，是髓样细胞上的主要激活性FcγR。FcγRIII以两者形式存在。FcγRIIIA(CD16A)为跨膜信号转导形式(50-65 kDa)，由NK细胞、单核细胞、巨噬细胞和某些T细胞表达。FcγRIIIB(CD16B)为糖基磷脂酰肌醇锚定形式(48kDa)，由人嗜中性白细胞表达。参见例如Scallon等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.865079-83和Ravetch等，1989，J.Exp.Med.170481-97。CD16A的蛋白质和核酸序列在Genbank中以检索号P08637(蛋白质)和X52645(核酸)记录，在SWISS-PROT中以检索号CAA36870记录。CD16B的蛋白质和核酸序列在Genbank中以检索号075015(蛋白质)和X16863(核酸)记录，在SWISS-PROT中以检索号CAA34753记录。
发明概述
在一个方面，本发明提供可用于治疗患自身免疫疾病的个体的CD16A结合蛋白。本发明的CD16A结合蛋白为非小鼠抗体，包括嵌合、人和人源化的抗CD16A单克隆抗体及其片段、单链抗体和其它包含VH结构域和/或VL结构域的结合蛋白。

在一个方面，CD16A结合蛋白包含源自人IgG重链的Fc区(例如源自人IgG1的Fc区)，其中该Fc区缺乏效应子功能和/或该Fc区被修饰以减少与Fc受体的结合。在一个实施方案中，CD16A结合蛋白例如因为Fc区的残基297处的置换而不被糖基化。

在另一个方面，CD16A结合蛋白包含源自人IgG重链的Fc区(例如源自人IgG1的Fc区)，其中该Fc区其效应子功能减低和/或该Fc区被修饰以减少与Fc受体的结合。

在一个方面，CD16A结合蛋白是这样的人源化3G8抗体，其VH结构域包含三个源自小鼠单克隆抗体(mAb)3G8的VH结构域的互补决定区(CDR)。在一个实施方案中，该VH结构域具有Hu3G8VH-1的VH结构域的序列。在一个实施方案中，结合蛋白的CDR具有小鼠CDR的序列。在一些型中，该VH结构域CDR与3G8的VH结构域CDR差别在于至少一个或多个以下置换CDR1中位置34处的Val、CDR2中位置50处的Leu、CDR2中位置52处的Phe、CDR2中位置54处的Asn、CDR2中位置60处的Ser、CDR2中位置62处的Ser、CDR3中位置99处的Tyr和CDR3中位置101处的Asp。在一个实施方案中，该VH结构域具有Hu3G8VH-22的VH结构域的序列。在一个实施方案中，该VH结构域包含具有序列SEQ ID NO51的FR3结构域。该VH结构域可连接到抗体重链恒定结构域，例如人Cγ1恒定结构域。

在一些型中，CD16A结合蛋白其VH结构域具有表4所示的序列。在一些型中，CD16A结合蛋白其VH结构域与Hu3G8VH-1的序列差别在于一个或多个表1所示的置换。

在一个方面，CD16A结合蛋白是这样的人源化3G8抗体，其VL结构域包含三个源自小鼠单克隆抗体3G8的VL结构域的互补决定区(CDR)。在一个实施方案中，结合蛋白的CDR具有小鼠CDR的序列。在一些型中，该VL结构域CDR与3G8的VL结构域CDR差别在于至少一个或多个以下置换CDR1中位置24处的Arg；CDR1中位置25处的Ser；CDR1中位置32处的Tyr；CDR1中位置33处的Leu；CDR1中位置34处的Ala；CDR2中位置50处的Asp、Trp或Ser；CDR2中位置51处的Ala；CDR2中位置53处的Ser；CDR2中位置55处的Ala或Gln；CDR2中位置56处的Thr；CDR3中位置92处的Tyr；CDR3中位置93处的Ser和CDR3中位置94处的Thr。在一个实施方案中，该VL结构域具有Hu3G8VL-1、Hu3G8VL-22或Hu3G8VL-43的VL结构域的序列。该VL结构域可连接到抗体轻链恒定结构域，例如人CK恒定区。

在一些型中，CD16A结合蛋白其VL结构域具有表4所示的序列。在一些型中，CD16A结合蛋白其VL结构域与Hu3G8VL-1的序列差别在于一个或多个表2所示的置换。

在一个方面，CD16A结合蛋白包含如上所述的VH结构域和VL结构域(它可通过编码重链和轻链的多核苷酸的共表达来制备)。任选地，人源化重链可变区包含表4所示的序列和/或人源化轻链可变区包含表4所示的序列。例如，在示例性的实施方案中，结合蛋白其重链可变区具有序列SEQ ID NO113和其轻链可变区具有序列SEQ ID NO96、100或118。在另一个示例性的实施方案中，结合蛋白其重链可变区具有序列SEQ ID NO109和其轻链可变区具有序列SEQ ID NO96。在另一个示例性的实施方案中，结合蛋白其重链可变区具有序列SEQ ID NO104和其轻链可变区具有序列SEQ ID NO96。

在一个实施方案中，CD16A结合蛋白是包含两个轻链和两个重链的四聚抗体，所述轻链包含VL结构域和轻链恒定结构域，所述重链包含VH结构域和重链恒定结构域。在一个实施方案中，轻链恒定结构域是人CK和/或重链恒定区是Cγ1。

在本发明的一个实施方案中，CD16A结合蛋白包含能以小于5nM的结合常数结合CD16A或sCD16A的抗原结合位点。

在一个实施方案中，(本发明的)CD16A结合蛋白与包含未修饰Fc区的参考CD16A结合蛋白相比，包含对至少一个Fc效应配体的结合降低的无糖基(aglycosyl)Fc区(例如在位置297处发生糖基化的人IgG1Fc结构域)。Fc效应配体可以是FcγRIII或补体的C1q成分。

本发明涵盖包含不被糖基化的Fc区的CD16A结合蛋白，如人或人源化抗CD16A单克隆抗体。本文所用的“不被糖基化的(notglycosylated)”Fc区涵盖这样的Fc区其中整个Fc区不含糖基化位点，或者其中Fc区当中的特定区域不被糖基化，或者其中Fc区当中的特定残基不被糖基化。在一个具体的实施方案中，本发明提供包含源自人IgG1的Fc区的CD16A结合蛋白，其中对应于Fc区的CH2结构域的297位置的氨基酸无糖基(本文称为GMA-161)。在另一个实施方案中，本发明提供能与GMA-161竞争结合和/或能和GMA-161一样结合CD16A的相同表位的CD16A结合蛋白。本发明还涵盖这样的分子，它们所包含的氨基酸序列与GMA-161的氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性。

本发明还涵盖这样的抗体或其片段，它们所包含的可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列与GMA-161的可变重链和/或轻链的氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性。本发明亦涵盖这样的抗体或其片段，它们所包含的一个或多个CDR的氨基酸序列与GMA-161的一个或多个CDR的氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性。两个氨基酸序列的同一性百分数可用本领域技术人员公知的任何方法来确定，包括BLAST蛋白质搜索。

在一个实施方案中，本发明提供能结合CD16A和抑制Fc受体与CD16的结合的、属人源化抗体的CD16结合蛋白。

在一个方面，本发明提供包含本文所述CD16A结合蛋白和药物可接受赋形剂的药物组合物。

在一个方面，本发明提供编码本文所述CD16A结合蛋白的VH结构域的分离多核苷酸，其任选为表达载体。在一个方面，本发明提供编码本文所述CD16A结合蛋白的VL结构域的分离核酸，其任选为表达载体。在一个方面，本发明提供包含本文所述多核苷酸的细胞，其任选为哺乳动物细胞。在一个方面，本发明提供表达本文所述CD16A结合蛋白的细胞系，其任选为哺乳动物细胞系。

本发明亦提供一种减少哺乳动物中的有害免疫应答(或不需要的免疫应答)的方法，所述方法包括将本文所述CD16A结合蛋白给予哺乳动物。在一个实施方案中，减少有害免疫应答包括保护(哺乳动物)免于抗体介导的血小板损耗。

在一个方面，本发明提供一种治疗哺乳动物中的有害免疫应答而又不在哺乳动物中引起嗜中性白细胞减少(例如严重嗜中性白细胞减少或中度嗜中性白细胞减少)的方法，所述方法包括将具有源自人IgG的Fc区的CD16A结合蛋白给予哺乳动物，其中该Fc区的位置297处的氨基酸无糖基。

在上述方法的各实施方案中，有害免疫应答是炎性反应，例如自身免疫疾病引起的炎性反应。在一个实施方案中，炎性反应由以下疾病引起特发性血小板减少性紫癜(ITP)、类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性溶血性贫血(AHA)、硬皮病、自身抗体引发的荨麻疹、天疱疮、血管炎综合征、系统性血管炎、古德帕斯彻氏综合征、多发性硬化(MS)、牛皮癣关节炎、关节强直性脊椎炎、斯耶格伦氏综合征、赖特综合征、川崎氏病、多肌炎和皮肌炎。可按本发明进行治疗的疾病或病症的其它实例还包括任何能用静脉免疫球蛋白(IVIG)疗法治疗的疾病(例如过敏性哮喘)。本发明提供既能保护(哺乳动物)免于自身免疫疾病又不会导致哺乳动物中的嗜中性白细胞显著减少的CD16A结合蛋白。在一个实施方案中，CD16A结合蛋白是抗CD16A抗体。这些CD16A结合蛋白用作人类治疗药物特别有利。在一个方面，本发明提供一种治疗哺乳动物中的自身免疫疾病而又不在哺乳动物中引起嗜中性白细胞减少(neutrophil diminution)或嗜中性白细胞减少(neutropenia)的方法，所述方法通过将具有源自人IgG的Fc区的CD16A结合蛋白给予哺乳动物来进行，其中该Fc区的每个CH2结构域的位置297。

在又一个方面，本发明提供一种抑制IgG抗体与细胞上的FcγRIII的结合的方法，所述方法通过使该细胞与CD16A结合蛋白在CD16A结合蛋白能结合于其上的FcγRIII的条件下相接触来进行。

在一个方面，本发明提供一种制备在治疗有害免疫应答方面的治疗功效改进的CD16A结合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤i)获得第一CD16A结合蛋白，其中该第一CD16A结合蛋白包含源自IgG的Fc区；ii)修饰该第一CD16A结合蛋白的Fc区，产生在Fc区的位置297处无糖基化的(aglycosylated)第二CD16A结合蛋白，其中该第二CD16A结合蛋白当给予哺乳动物时在治疗有害免疫应答方面比该第一CD16A结合蛋白更有效。

在一个方面，本发明提供一种制备在治疗有害免疫应答方面的治疗功效改进的CD16A结合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤i)获得第一CD16A结合蛋白，其中该第一CD16A结合蛋白包含源自IgG的Fc区；ii)修饰该第一CD16A结合蛋白的Fc区，产生较之该第一CD16A结合蛋白的未修饰Fc区，与Fc效应配体的结合减低的第二CD16A结合蛋白，其中该第二CD16A结合蛋白当给予哺乳动物时在治疗有害免疫应答方面比该第一CD16A结合蛋白更有效。在一个实施方案中，Fc效应配体是FcγRIII或补体的C1q成分。

在一个方面，该方法涉及给予CD16A结合蛋白以减少受试者中的有害免疫应答，而又不会引起一种或多种由鼠3G8的给予所产生的显著有害作用，或者所引起的这种(有害)作用的水平比鼠3G8的给予所产生的显著要低。

在本发明的一个实施方案中，在治疗有害免疫应答方面的治疗功效的改进包括在保护免于抗体介导的血小板损耗方面的有效性的改进。有害免疫应答任选由特发性血小板减少性紫癜(ITP)所致或因将常规单克隆抗体6A6给予muFcγRIII-/-，huFcγRIIIA转基因小鼠而产生。

本发明提供包含源自人IgG重链的Fc区的CD16A结合蛋白用于治疗免疫疾病或用于制备免疫疾病治疗用药物的用途，其中该Fc区缺乏效应子功能。在其它实施方案中，本发明提供包含源自人IgG重链的Fc区的CD16A结合蛋白用于治疗免疫疾病或用于制备免疫疾病治疗用药物的用途，其中该Fc区其效应子功能减低。

治疗性单克隆抗体的应用受到“首剂”副作用(first dose sideeffects)的问题的限制。首剂副作用可从轻微流感样症状到严重毒性这样的轻微程度到严重程度，包括诸如以下的症状高烧、发冷/寒战、头痛、震颤、恶心/呕吐、腹泻、腹痛、身体不适、肌肉/关节疼痛和全身乏力。首剂副作用据认为由单克隆抗体的Fc区结合和激活含FcγR细胞上的FcγR而刺激发生的淋巴因子产生和细胞因子释放所引起。

本发明因此涵盖通过减少或消除Fc与一个或多个FcγR的结合来减少或消除至少一种与首剂副作用有关的症状的CD16A结合蛋白。这种CD16A结合蛋白包含相对于野生型Fc区域而言具有一个或多个氨基酸修饰的变异Fc区。相对于可比较的野生型Fc区，该修饰能减少或消除Fc与一个或多个FcγR的结合。该修饰通常是氨基酸置换。但是，该修饰也可以是氨基酸插入和/或缺失。通常，该修饰出现在CH2和/或铰链区中。或者，通过改变或消除一个或多个Fc区上的一个或多个糖基，可以减少或消除Fc与一个或多个FcγR的结合。Fc糖基化作用可用本领域公知的方法改变或消除。例如，Fc糖基化作用可通过在岩藻糖基化作用缺损的细胞(例如fuc6裸细胞)中产生Fc来改变，或者通过去糖基化酶或者能改变或消除糖基化位点(例如CH2结构域中的位置297-299处的N-X-S/T糖基化位点)的氨基酸修饰来消除。FcγR结合可用本领域公知和本文例示的标准方法来测量。本发明的抗体因此特别有用，因为它们因淋巴因子产生或细胞因子释放所引起的体内毒性发生减少或没有。

测量淋巴因子产生和细胞因子释放的方法是本领域公知和常规的，它们被纳入本文中。例如，细胞因子释放可通过测量包括但不限于TNF-α、GM-CSF、IFN-α在内的细胞因子的分泌来测量。参见例如美国专利第6,491,916号；Isaacs等，2001，Rheumatology，40724-738；这两个文献通过引用整体结合到本文中。淋巴因子产生可通过测量包括但不限于以下淋巴因子在内的淋巴因子的分泌来测量白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)、白介素-16(IL-16)、PDGF、TGF-α、TGF-α、


GCSF、GM-CSF、MCSF、


TFN-α、IGF-I、IGF-II。例如参见Isaacs等，2001，Rheumatology，40724-738；Soubrane等，1993，Blood，81(1)15-19；这两个文献通过引用整体结合到本文中。

本文所用的术语“Fc区”用以定义IgG重链的C末端区域。将人IgG重链Fc区定义为从Cys226延伸到羧基末端，尽管分界线可能稍有不同。IgG的Fc区包含CH2和CH3这两个恒定结构域。人IgG Fc区的CH2结构域通常从氨基酸231延伸到氨基酸341。人IgG Fc区的CH3结构域通常从氨基酸342延伸到447。人IgG Fc区的CH2结构域(也称“Cγ2‘结构域)通常从氨基酸231延伸到340。CH2结构域的独特之处在于它没有与另一结构域紧密配对。相反，有两个N连接的分支糖链插入在完整天然IgG的两个CH2结构域之间。

在本说明书中，IgG重链中的残基的编号方式为Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService，NH1，MD(1991)中所载的EU index的编号方式，该文献通过引用特意结合到本文中。“Kabat中所载的EU index”指人IgG1 EU抗体的编号方式。

“铰链区”通常定义为从人IgG1的Glu216延伸到Pro230。可将形成重链间S-S键(inter-heavy chain S-S binds)的第一个和最后一个半胱氨酸残基按相同方向放置，以将其它IgG同种型的铰链区与IgG1序列进行比对。

可减少或消除至少一种与首剂副作用有关的症状的Fc修饰的实例，包括但不限于以下Fc修饰位置233处的氨基酸被脯氨酸置换；或者位置234处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置235处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置234处的氨基酸被丙氨酸置换和位置235处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置238处的氨基酸被精氨酸置换；或者位置265处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置265处的氨基酸被谷氨酸置换；或者位置270处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置270处被天冬氨酸置换；或者位置297处的丙氨酸或谷氨酰胺置换；或者位置298处被脯氨酸或天冬氨酸置换；或者位置299处被除丝氨酸或苏氨酸以外的任何氨基酸置换；或者位置265处的氨基酸被丙氨酸置换和位置297处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置265处的氨基酸被丙氨酸置换和位置297处的氨基酸被谷氨酰胺置换；或者位置265处的氨基酸被谷氨酸置换和位置297处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置265处的氨基酸被谷氨酸置换和位置297处的氨基酸被谷氨酰胺置换。本发明还涵盖任何本文所列变体的组合。

本发明涵盖减少或消除患者中至少一种与首剂副作用有关的症状的方法，所述方法包括给予有效量的一种或多种本发明抗体。本发明方法能减少至少一种与细胞因子释放综合征有关的症状，包括但不限于高烧、发冷/寒战、头痛、震颤、恶心/呕吐、腹泻、腹痛、身体不适、肌肉/关节疼痛和全身乏力。
附图简述


图1显示CD16A结合蛋白对sCD16A的结合的ELISA结果。Hu3G8-24.43是具有Hu3G8VH-24的重链和Hu3G8VL-43的轻链的抗体。Hu3G8-5.1是具有Hu3G8VH-5的重链和Hu3G8VL-1的轻链的抗体。Ch3G8是嵌合3G8抗体。Hu1gG1是非相关免疫球蛋白。

图2显示人源化和嵌合抗体与表达CD16A的胞外结构域的CHO-K1细胞的结合的测定结果。Hu3G8-22.1是具有Hu3G8VH-22的重链和Hu3G8VL-1的轻链的抗体。Hu3G8-5.1是具有Hu3G8VH-5的重链和Hu3G8VL-1的轻链的抗体。Hu3G8-22.43是具有Hu3G8VH-22的重链和Hu3G8VL-43的轻链的抗体。N297Q表示抗体是无糖基化的。

图3显示基于细胞的竞争测定的结果。所示的无糖基化人源化抗体与无糖基化嵌合抗体竞争结合表达CD16A的胞外结构域的CHO-K1细胞。

图4显示对sCD16A与免疫复合物的结合的抑制作用。Hu3G8-1.1是具有Hu3G8VH-1的重链和Hu3G8VL-1的轻链的抗体。

图5显示在腹膜内注射ch6A6前1小时静脉内注射单克隆抗体3G8(0.5μg/g)或人IVIG(1mg/g)的小鼠中的针对ITP的保护作用。

图6显示在静脉内注射ch6A6前1小时静脉内注射单克隆抗体3G8(0.5μg/g)或人IVIG(1mg/g)的小鼠中的针对ITP的保护作用。

图7显示在腹膜内注射ch6A6前1小时静脉内注射ch3G8(0.5μg/g)的小鼠中的针对ITP的保护作用的缺乏。

图8显示在腹膜内注射ch6A6前1小时静脉内注射ch3G8N297Q的小鼠中的针对ITP的保护作用。

图9显示在静脉内注射ch6A6前1小时静脉内注射ch3G8N297Q的小鼠中的针对ITP的保护作用。

图10显示给予CD16A结合蛋白或对照后的嗜中性白细胞FACS扫描结果。x轴显示用抗CD16抗体进行标记，y轴显示用抗Gr-1抗原的抗体进行标记。右上图显示嗜中性白细胞；左上图显示其它粒细胞和不再被3G8-FITC染色的嗜中性白细胞。

图11显示用人源化抗CD16A抗体进行的AIHA预防。

图12显示人源化3G8抗体对ch4D5介导的抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)的抑制作用。

图13A-B显示小鼠3G8(图13A)和人源化3G8抗体(图13B)对ch4-4-20介导的ADCC的抑制作用。

图14显示hu3G8-5.1的给予对FcγRIII-/-，hCD16A，hCD32A小鼠抵抗ITP的保护作用。

图15A-B显示hu3G8-5.1N297Q的给予对FcγRIII-/-，hCD16A，hCD32A小鼠抵抗ITP的保护作用。图15(A)显示每个剂量在指定时间的数据点。图15(B)显示在5小时时间点的剂量反应。

图16A-B显示给其中已诱发(subsequent)血小板减少的小鼠给予无糖基化人源化抗体的治疗作用。图16(A)显示Hu3G8-5.1-N297Q的给予。图16(B)显示Hu3G8-22.1-N297Q和Hu3G8-22.43-N297Q的给予。

图17显示人源化抗CD16A抗体在治疗自身免疫性溶血性贫血中的治疗作用。
发明详述 1.定义
认为本文所用的所有专业术语、符号和其它科学术语或专门用语具有本发明所属技术领域的技术人员常知的含义，除非另有定义。在一些情况下，为清楚和/或方便参考起见定义了常知的含义，本文中加入这种定义不应必然被解释为代表了与本领域常知含义的实质差别。本发明的实施会应用到分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术(这些技术在本领域技术人员的技能范围内)，除非另外说明。这种技术在文献中有充分的阐述，如Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等(编辑)，1999，包括到2001年为止的各补编)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等(编辑)，1987，包括到2001年为止的各补编)；MolecularCloningA Laboratory Manual，第3版(Sambrook和Russet，2001)；PCRThe Polymerase Chain Reaction，(Mullis等(编辑)，1994)；TheImmunoassay Handbook(D.Wild(编辑)，Stockton Press NY，1994)；Bioconjugate Techniques(Greg T.Hermanson，(编辑)，Academic Press，1996)；Methods of Immunological Analysis(R.Masseyeff，W.H.Albert和N.A.Staines(编辑)，WeinheimVCH Verlags gesellschaft mbH，1993)；Harlow和Lane Using AntibodiesA Laboratory Manual Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1999及Beaucage等(编辑)，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons，Inc.，New York，2000)。

术语“重链”、“轻链”、“可变区”、“构架区”、“恒定区”等具有其在免疫学领域的一般含义，指天然免疫球蛋白中的结构域和合成(例如重组)结合蛋白(例如人源化抗体)的相应结构域。天然免疫球蛋白(例如IgG)的基本结构单位是具有两个轻链和两个重链的四聚体。天然免疫球蛋白通常被表达为约150,000道尔顿的糖蛋白，不过如下文所述，IgG也可以以非糖基化形式产生。每个链的氨基末端(“N”)部分包括约100-110个或更多个氨基酸的、主要负责抗原识别的可变区。每个链的羧基末端(“C”)部分界定恒定区，其中轻链具有单一恒定结构域，重链通常具有三个恒定结构域和一铰链区。因此，IgG分子的轻链的结构是N-VL-CL-C，IgG重链的结构是N-VH-CH1-H-CH2-CH3-C(其中H为铰链区)。IgG分子的可变区由含有与抗原接触的残基的互补决定区(CDR)和保持CDR环的结构并决定其定位的非CDR区段(称为构架区)所组成。因此，VL和VH结构域具有N-FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4-C结构。

本文所用的术语“CD16A结合蛋白”、“CD16A抗体”和“抗CD16A抗体”可互用，指多种免疫球蛋白样蛋白质或衍自免疫球蛋白的蛋白质。“CD16A结合蛋白”通过与VL和/或VH结构域的相互作用结合CD16A(这与Fc介导的结合不同)。CD16A结合蛋白的实例包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体(例如包含2个重链和2个轻链)及其其片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段)、双功能或多功能抗体(参见例如Lanzavecchia等，1987，Eur.J.lmmunol.17105)、单链抗体(参见例如Bird等，1988，Science 242423-26)、融合蛋白(例如噬菌体展示融合蛋白)、“微型抗体(minibodies)”(参见例如美国专利第5,837,821号)以及其它包含VL和/或VH结构域或其片段的抗原结合蛋白。在一个方面，CD16A结合蛋白是“四聚抗体”，即它通常具有天然IgG的结构，包含有可变结构域和恒定结构域(即两个包含VL结构域和轻链恒定结构域(如人Cκ)的轻链，和两个包含VH结构域和重链铰链区和恒定结构域(如人Cγ1)的重链)。明确将小鼠抗体3G8排除出CD16A结合蛋白的定义，除非有特意的说明。

当提及结合蛋白或抗体(按本文的宽泛定义)时，每个结构域的氨基酸配号按Kabat，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST(National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1987和1991)的定义进行。免疫球蛋白成熟重链和轻链的可变区的氨基酸按链中氨基酸的位置来标示。Kabat描述了各抗体的多个氨基酸序列，鉴定了每个亚群的氨基酸共有序列，给每个氨基酸分配了残基号码。通过将所关心的抗体与Kabat的共有序列中的一个参照保守氨基酸进行比对，可将Kabat的编号方案扩展到他的编号纲要中没有包括的抗体。这个分配残基编号的方法已成为本领域标准，它可容易地鉴别不同抗体(包括嵌合或人源化抗体变体)中对等位置处的氨基酸。例如，人抗体轻链的位置50处的氨基酸所占据的位置与小鼠抗体轻链的位置50处的氨基酸对等。因此，本文中用到的涉及嵌合或人源化抗体的诸如“在Fc区的位置297处”的提法，指免疫球蛋白链、免疫球蛋白链的区域或衍自免疫球蛋白链的多肽的区域中对应于相应的人免疫球蛋白的位置297的氨基酸位置。

免疫球蛋白的“Fc区”指免疫球蛋白重链的C末端区域。尽管Fc区的分界线可能稍有不同，但通常Fc区从多肽的大约位置226-230延伸到羧基末端(涵盖CH2和CH3结构域)。人Fc区的序列见Kabat(出处同上)。另外，已知存在多个同种异型变体。

“Fc效应配体”是能结合IgG抗体的Fe区，从而激活效应子机制导致病原体被清除和破坏的配体。Fc效应配体包括三种细胞Fc受体类型——FcRγI、FcRγII和FcRγIII。三种Fc受体类型的每一种的多个同种型也包括在本发明内。因此，术语“Fc效应配体”包括FcγRIIIA(CD16A)和FcγRIIIB(CD16B)术语“Fc效应配体”还包括新生Fc受体(Fcγn)和补体的C1q成分。IgG与Fc受体的结合可引发多个生物过程，包括抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)、炎性介质的释放、对抗体产生的控制、免疫复合物的清除和抗体包被颗粒的破坏。补体的C1q成分与IgG的结合可激活补体系统。补体的激活在调理作用、细胞病原体的裂解和炎性反应中起到重要作用。

本文所用的“效应子功能”指由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用产生的生化事件。效应子功能包括但不限于抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。效应子功能包括在抗原被结合后起作用的功能和不依赖于抗原结合来起作用的功能。

本文所用的“缺乏效应子功能”的Fc区，不会结合Fc受体和/或不会结合补体的C1q成分并引发这种结合所特有的生物应答。本文所用的“其效应子功能减低的”Fc区，对Fc受体的亲和力减低和/或对补体的C1q成分的亲和力减低，从而不甚有效地引发这种结合所特有的生物应答。包含其效应子功能减低的Fc区的分子与包含具有野生型效应子功能活性的野生型Fc区的分子相比，效应子功能活性可能减低至少10％、至少20％、至少50％、至少80％、至少80％、至少90％或至少99％。

术语“糖基化位点”指被哺乳动物细胞识别为进行糖残基连接的位置的氨基酸残基。糖类如寡糖连接的氨基酸残基通常是天冬酰胺残基(N-键合)、丝氨酸残基(O-键合)和苏氨酸残基(O-键合)。具体的连接位点通常具有特征性氨基酸序列，称为“糖基化位点序列”。N-连接糖基化作用的糖基化位点序列是-Asn-X-Ser-或-Asn-X-Thr-，其中X可以是脯氨酸之外的任何常规氨基酸。人IgG的Fc区具有两个糖基化位点，每个CH2结构域中有一个。在人IgG的CH2结构域中的糖基化位点发生的糖基化作用，是在位置297处的天冬氨酸(Asn 297)的N-连接糖基化作用。

术语“嵌合(的)”当指抗体时其含义为本领域的一般含义，指其中一部分重链和/或轻链与一种物种(例如小鼠)的抗体完全相同或同源，而其余的部分与另一物种(例如人类)的抗体完全相同或同源的抗体。

本文所用的术语“人源化(的)”其含义为本领域普通含义。一般而言，非人抗体的人源化涉及将非人免疫球蛋白VL区和VH区的CDR序列置换到人构建区中。此外，本文所用的“人源化”抗体可包含为增加亲和力或为其它目的在CDR和/或构架区中引入的另外的置换和突变。例如，在人序列中置换上非人构架残基可增加亲和力。参见例如Jones等，1986，Nature 321522-25；Queen等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8610029-33；Foote和Winter，1992，J Mol.Biol.224487-99；Chothia等，1989，Nature 342877-83；Riechmann等，1988，Nature 332323-27；Co等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.882869-73；Padlan，1991，Mol.Immunol.28489-98。所得的可变结构域具有非人CDR序列和源自人抗体构架序列或人共有序列(例如如Kabat(出处同上)所公开)的构架序列。多个不同的人构架区可单独或组合用作本发明的人源化单克隆抗体的基础。人源化抗体的构架序列是“实质上人构架”，也就是说至少约70％的构架序列、往往至少约80％的构架序列、最通常至少约90％的构架序列是来自人抗体序列。在一些实施方案中，实质上人构架包含VH FR4结构域(例如SEQID NO64)的位置113处的丝氨酸。本文所用的“人源化抗体”除四聚抗体外还包括包含有源自非人抗体的CDR和源自人构架区的构架序列的单链抗体、抗体片段等。

本文所用的“哺乳动物”包括人、非人灵长类动物、啮齿动物如小鼠和大鼠以及其它哺乳动物。

本文所用的“嗜中性白细胞减少”取其一般含义，指血液中循环的嗜中性白细胞的数量异常低下的状态。人血液中的嗜中性白细胞的正常水平因年龄和种族而稍有差异。成人平均水平为约1500个细胞/mm3血液。嗜中性白细胞计数小于500个细胞/mm3会导致严重感染的重大风险。一般来说，人体中的严重嗜中性白细胞减少定义为血液嗜中性白细胞计数小于约500个细胞/mm3，而中度嗜中性白细胞减少的特征是血液嗜中性白细胞计数为约500-1000个细胞/mm3。

本文所用的“治疗”指试图改变受治疗个体或细胞的疾病进程而进行的临床干预，它可为预防目的进行或者可在临床病理过程中进行。治疗的疗效包括但不限于疾病发生或复发的预防、症状的减轻、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、疾病进展速度的降低、疾病状态的改善或缓和以及预后的免除或改进。

“有效量”是治疗时足以实现有益的或所需的临床结果的量。可将有效量以一次剂量或多次剂量给予患者。“治疗有效量”是足以缓和、改善、稳定、逆转或减慢疾病的进程或者以别的方式减少疾病的病理后果或减少疾病的症状的量。改善或减少不需要是且通常并不是永久的，而是可持续至少1小时、至少1天或至少1个周的时间或更长时间。有效量通常由主治医师根据病例情况进行确定，这在本领域技术人员的技能范围内。当确定适当剂量以使达到有效量时，通常要考虑几个因素。这些因素包括患者的年龄、性别和体重、所治疗的病况、病况的严重程度和所给予的结合蛋白的形式和有效浓度。“炎症减少量”是能减少受试者中的炎症的量。炎症的减少可通过本领域公知的标准进行评判，所述标准包括C-反应性蛋白水平的减少、补体消耗的减少、炎症部位(例如类风湿性关节炎受试者中的关节、狼疮受试者中的肾脏、髓鞘等)免疫复合物沉积的减少、细胞因子释放的减少、巨噬细胞和嗜中性白细胞的迁移等等。

本文所用的“实质上序列同一性”指两个或多个序列或亚序列(例如结构域)当进行比对来比较最大对应时，具有至少约80％氨基酸残基同一性，优选至少约90％或至少约95％同一性。两个相似序列(例如抗体可变区)之间的序列同一性可如下进行测定(1)将两个序列沿其整个长度进行比对，或者如果两个序列长度不同时沿着较短序列的整个长度进行比对，使同一性的总数最大(其中两比对序列或两比对序列较短者的长度为“L”个残基)；(2)数出有氨基酸同一性的位置的数量(不包括被标示为被排除不作比较的“E”残基的数量)，其中同一性的数量标示为“N”；(3)将“N”除以“L”减“E”之差。例如，两个序列的长度各为80个残基，其中有6个特定残基被排除不作比较，其余74个位置有65个同一性，这两个序列的比较得出的序列同一性将是N/(L-E)或65/(80-6)或87.8％。(各残基当示例性地而非限制性地存在于融合蛋白的非抗体结构域中时，可指定为“被排除”不作计算。)或者，可通过计算机执行以下文献中描述的算法计算出最佳比对和序列同一性Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2482[局部同源算法(local homology algorithm)]、Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443[同源比对算法(homology alignmentalgorithm)]、Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444[相似性搜索方法(search for similarity method)]或Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-10[BLAST算法]。参见Ausubel等(出处同上)和WisconsinGenetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。当采用任何上述算法时，使用(Window字长、空隙罚分等的)默认参数。某氨基酸或核酸序列与另一序列当序列同一性程度为至少约70％同一性、优选至少约80％同一性或至少约90％同一性或甚至至少约95％同一性时，它们是“实质上相似的”。实质上完全相同的序列也是实质上相似的。

本文所用的某多肽、多肽结构域或区域或者氨基酸序列和另一多肽、多肽结构域或区域或者氨基酸序列当它们完全相同或实质上相似且具有相似的生物功能时，则前一序列是“衍自”后一序列。例如，在人源化小鼠单克隆抗体中，互补决定区(CDR)“衍自”小鼠单克隆抗体的相应CDR，可变结构域构架区可“衍自”相应人抗体的构架序列。显而易见的是，一个结构域(举例)和某亲本结构域(举例)尽管两者因为例如如下突变的引入而在序列上不同，但也可以是前者衍自后者，所述突变会或者不会影响改变含有该(举例)结构域的蛋白质的结合亲和力或其它特性，如本文描述的特性。还应认识到，通常来说，“衍自”某亲本结构域(举例)的某结构域(举例)是用该亲本分子的物质(例如遗传物质)或信息(例如核苷酸或氨基酸序列)来制备、产生或设计的。

标准的氨基酸用缩写为丙氨酸Ala(A)；丝氨酸Ser(S)；苏氨酸Thr(T)；天冬氨酸Asp(D)；谷氨酸Glu(E)；天冬酰胺Asn(N)；谷氨酰胺Gln(Q)；精氨酸Arg(R)；赖氨酸Lys(K)；异亮氨酸Ile(I)；亮氨酸Leu(L)；甲硫氨酸Met(M)；缬氨酸Val(V)；苯丙氨酸Phe(F)；酪氨酸Tyr(Y)；色氨酸Trp(W)；甘氨酸Gly(G)；组氨酸His(H)；脯氨酸Pro(P)和半胱氨酸Cys(C)。

本文所用的“GMA-161”指其中VL链具有SEQ ID NO98所示序列和VH链具有SEQ ID NO120所示序列的CD16A结合蛋白。
2.导论
FcγRIIIA受体CD 16A能起到将细胞毒性和免疫复合物抗体与效应子应答偶联的作用。据认为，FcγRIIIA受体与自身免疫疾病和其它发病情况中所存在的免疫球蛋白聚集体(例如免疫复合物)的相互作用，导致受试者中出现有害的炎性反应。虽然不想受限于具体的机制，但还是认为减少FcγRIIIA受体(本文中一般称为“CD16A”或“CD16A受体”)与免疫球蛋白聚集体的相互作用会减轻这一炎性反应。同样虽然不想受限于具体的机制，但还是认为减少CD16A与免疫球蛋白聚集体的相互作用的一个方法是使用抗CD16A抗体或其它CD16A结合蛋白来阻断该相互作用。

单克隆抗体3G8(“mAb 3G8”)是小鼠单克隆抗体，能以1×109M-1的Ka结合人CD16A和B的Fc结合结构域(Fleit等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.793275-79)。3G8能阻断人IgG1免疫复合物与分离的人NK细胞、单核细胞和嗜中性白细胞以及与CD16A转染的293细胞的结合。已进行了将mAb 3G8给予人患者以治疗特发性血小板减少性紫癜(ITP)的实验(Clarkson等，1986，N.Engl.J Med.3141236-39；Soubrane，等，1993，Blood 8115-19)。3G8抗体的给予据报道会导致血小板水平增加并伴随出现一种或多种显著副作用，包括HAMA应答、细胞因子释放综合征和/或明显的嗜中性白细胞减少。

本发明提供新型CD16A结合蛋白，包括人源化和/或无糖基化的单克隆抗体，和提供通过给予该蛋白减少受试者中的有害免疫应答的方法。在已确立的(well established)模型中证实这些结合蛋白的给予能预防这两种不同的自身免疫疾病自身免疫性溶血性贫血(AHA)和特发性血小板减少性紫癜。这些结果表明这一治疗法对其它自身免疫疾病也同样有效。此外，本发明人意外发现，效应子功能改变的抗CD16A抗体(例如无糖基化的抗体)的给予能抵抗自身免疫疾病所特有的有害免疫应答而又不引起急性严重嗜中性白细胞减少。因此，本发明提供用于自身免疫疾病的抗体介导实现的(antibody-mediated effected)治疗，而又不出现使用别的治疗法所观察到的明显副作用的新试剂和方法。
3.CD16A结合蛋白
有多种CD16A结合蛋白可用于本发明的方法。合适的CD16A结合蛋白包括人或人源化单克隆抗体及CD16A结合抗体片段(例如scFv或单链抗体、Fab片段、微型抗体)，和别的通过与轻链可变区结构域、重链可变区结构域或这两者的相互作用结合CD16A的抗体样蛋白质。

在一些实施方案中，供按本发明来使用的CD16A结合蛋白包含这样的VL和/或VH结构域，其具有一个或多个含有源自非人抗CD16A抗体(如小鼠抗CD16A抗体)的序列的CDR和一个或多个源自一种或多种人免疫球蛋白的构架序列的构架区。有多种非人抗CD16A单克隆抗体(从中可获得CDR和其它序列)是已知的(参见例如Tamm和Schmidt，1996，J.Immunol.1571576-81；Fleit等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.793275-79；LEUKOCYTE TYPING IIHUMAN MYELOID ANDHEMATOPOIETIC CELLS，Reinherz等(编辑)，New YorkSpringer-Verlag；1986；LEUCOCYTE TYPING IIIWHITE CELL DIFFERENTIATIONANTIGENS McMichael AJ(编辑)，OxfordOxford University Press，1986)；LEUKOCYTE TYPING IVWHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS，Kapp等(编辑)，Oxford Univ.Press，Oxford；LEUKOCYTE TYPING VWHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS，Schlossman等(编辑)，OxfordUniv.Press，Oxford；LEUKOCYTE TYPING VIWHITE CELLDIFFERENTIATION ANTIGENS，Kishimoto(编辑)，Taylor & Francis。另外，如实施例中所示，使用公知的用以产生和选择单克隆抗体或相关结合蛋白的方法(例如杂交瘤技术、噬菌体展示等)，可获得新的能识别在细胞上表达的人CD16A的CD16A结合蛋白。参见例如O’Connel等，2002，J.Mol.Biol.32149-56；Hoogenboom和Chames，2000，Imm.Today21371078；Krebs等，2001，J.Imm.Methods 25467-84及本文引述的其它参考文献。来自非人物种的单克隆抗体可用本领域公知的抗体人源化技术进行嵌合化或人源化。

或者，可使用具有人免疫系统的元件的转基因动物(参见例如美国专利第5,569,825号和第5,545,806号)，使用人外周血细胞(Casali等，1986，Science 234476)，通过按Huse等，1989，Science 2461275所述的一般方案从B细胞筛选DNA文库和通过其它方法，产生抗CD16A完全人抗体。

出于一些目的设想到，使用这样的CD16A结合蛋白来阻断3G8的结合会是有利的，该CD16A结合蛋白结合CD16A受体的表位与3G8所结合的表位相同，或者至少足够靠近这个表位。用以进行表位作图和竞争性结合实验以鉴定具有所需结合特性的结合蛋白的方法，是实验免疫学领域技术人员公知的。参见例如Harlow和Lane(出处同上)；Stahl等，1983，Methods in Enzymology 9242-53；Kirkland等，1986，J.Immunol.1373614-19；Morel等，1988，Molec.Immunol.257-15；Cheung等，1990，Virology 176546-52和Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.3277-82。另参见下文实施例和§3G(i)。例如，可以这样确定两个抗体是否结合相同的位点用其中一个抗体来捕获ELISA板上的抗原，然后测量另一抗体结合受捕获抗原的能力。也可这样进行表位比较用酶、放射性核素或荧光团直接或间接标记第一抗体，然后测量未标记的第二抗体抑制该第一抗体与细胞上、溶液中或固相上的抗原的结合的能力。

也可以测量抗体阻断CD16A受体与ELISA板上形成的免疫复合物的结合的能力。这种免疫复合物是这样形成的首先用抗原如荧光素包被ELISA板，然后将特异性抗荧光素抗体施与该板。这一免疫复合物然后充当可溶性Fc受体如sFcγRIIIa的配体。或者，可形成可溶性免疫复合物并用酶、放射性核素或荧光团直接或间接标记。然后可测量抗体抑制这些标记免疫复合物与细胞上、溶液中或固相上的Fc受体的结合的能力。

本发明的CD16A结合蛋白可以或可以不包含人免疫球蛋白Fc区。Fc区不存在于例如scFv结合蛋白中。Fc区存在于例如人或人源化四聚单克隆IgG抗体中。在本发明的一些实施方案中，CD16A结合蛋白包含效应子功能改变的Fc区，所述效应子功能改变例如与未改变的Fc区(例如天然IgG1蛋白的Fc)相比对效应配体如Fc受体或补体的CI成分的亲和力减低，这在下文中有详细描述。在一些实施方案中，Fc区在对应于位置297的Fc区氨基酸处没有糖基化。这种抗体缺乏Fc效应子功能。

因此，在本发明的一些实施方案中，CD16A结合蛋白因其中缺乏Fc结构域而不显示Fc介导的与效应配体(如Fc受体或补体的C1成分)的结合，而在其它情况下，结合或效应功能的缺乏是因为抗体恒定区中的变更所致。

本发明涵盖包含这样的变异Fc区的CD16A结合蛋白，该变异Fc区在一个或多个区域中具有一个或多个氨基酸修饰(例如置换，但还包括插入或缺失)，所述修饰会改变(例如增加或降低)变异Fc区与FcγR的亲和力。这种变异Fc区的实例公开于2004年1月9日提交的美国申请系列号10/754,922和2004年7月28日提交的美国申请系列号10/902,588中，这两个专利申请通过引用整体结合到本文中。在一些实施方案中，本发明涵盖包含变异Fc区的CD16A结合蛋白，其中所述变异Fc区相比于野生型Fc区包含至少一个氨基酸修饰，用本领域技术人员公知的标准测定法(例如体外测定法)测定发现，该变异Fc区相比于包含野生型Fc区的可比较分子不结合任何FcγR或结合亲和力减低。这种变异的实例包括但不限于位置233处的氨基酸被脯氨酸置换；或者位置238处的氨基酸被精氨酸置换；或者位置265处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置265处的氨基酸被谷氨酸置换；或者位置270处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置270处被天冬氨酸置换；或者位置297处的丙氨酸或谷氨酰胺置换；或者位置298处的脯氨酸或天冬氨酸置换；或者位置299处被除丝氨酸或苏氨酸以外的任何氨基酸置换；或者位置234处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置235处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置234处的氨基酸被丙氨酸置换和位置235处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置265处的氨基酸被丙氨酸置换和位置297处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置265处的氨基酸被丙氨酸置换和位置297处的氨基酸被谷氨酰胺置换；或者位置265处的氨基酸被谷氨酸置换和位置297处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置265处的氨基酸被谷氨酸置换和位置297处的氨基酸被谷氨酰胺置换。本发明还涵盖任何本文所列变体的组合。

优选地，所述一个或多个氨基酸修饰能增加变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲和力。在一个优选的实施方案中，本发明的分子还能以较低的亲和力特异性结合FcγRIIB(通过Fc区)，该较低的亲和力是相比于包含野生型Fc区的可比较分子(即除了Fc区中的一个或多个氨基酸修饰外具有和本发明分子相同的氨基酸序列)结合FcγRIIB的亲和力而言。在一些实施方案中，本发明涵盖包含具有一个或多个氨基酸修饰的变异Fc区的分子，相比于包含野生型Fc区的可比较分子，所述修饰能增加变异Fc区对Fc RIIIA和/或Fc RIIA的亲和力和增强变异Fc区对Fc RIIB的亲和力。在其它实施方案中，本发明涵盖包含具有一个或多个氨基酸修饰的变异Fc区的分子，相比于包含野生型Fc区的可比较分子，所述修饰能增加变异Fc区对Fc RIIIA和/或Fc RIIA的亲和力，但不改变变异Fc区对Fc RIIB的亲和力。
4.包含类似于3G8 CDR序列的CDR序列的CD16A结合蛋白
可用于本发明的实施的CD16A结合蛋白包括包含源自小鼠单克隆抗体3G8的CDR的CDR序列的蛋白质(即其CDR序列与3G8的CDR的序列相同或类似)。编码小鼠3G8单克隆抗体的重链和轻链可变区的互补cDNA(包括CDR编码序列)进行了克隆和测序，这在实施例中描述到。3G8的核酸和蛋白质序列在下文提供，标示为SEQ ID NO1和2(VL)及SEQ ID NO3和4(VH)。用小鼠可变区和CDR序列产生了大量的包含源自3G8 CDR的互补决定区的嵌合和人源化单克隆抗体，并对它们的特性进行了分析。为鉴定能以高亲和力结合CD16A并具有其它适需特性的人源化抗体，产生了包含具有源自3G8的CDR的VH区的抗体重链，并与包含源自3G8的CDR的VL区的抗体轻链组合(通过共表达)以产生分析用四聚抗体。所得四聚抗体的特性按下文所述进行确定。下文描述到，包含3G8 CDR的CD16A结合蛋白，如下文所述的人源化抗体蛋白，可按本发明进行使用以减少有害免疫应答。
A.VH区
在一个方面，本发明的CD16A结合蛋白可包含这样的重链可变结构域，其中至少一个CDR(通常3个CDR)具有小鼠单克隆抗体3G8重链的某个CDR(更通常所有3个CDR)的序列，而该结合蛋白的剩余部分是实质上人的(源自和实质上类似于人抗体的重链可变区)。

在一个方面，本发明提供这样的人源化3G8抗体或抗体片段，其在实质上人构架中含有源自3G8抗体的CDR，但其中重链可变结构域的至少一个CDR在序列上与相应的小鼠抗体3G8重链CDR有差异。例如，在一个实施方案中，该CDR与3G8 CDR序列的差异至少在于其具有一个或多个表1所示的CDR置换(例如CDR1中位置34处的缬氨酸、CDR2中位置50处的亮氨酸、CDR2中位置52处的苯丙氨酸、CDR2中位置52处的酪氨酸、CDR2中位置52处的天冬氨酸、CDR2中位置54处的天冬酰胺、CDR2中位置60处的丝氨酸、CDR2中位置62处的丝氨酸、CDR3中位置99处的酪氨酸和/或CDR3中位置101处的天冬氨酸)。合适的CD16A结合蛋白可包含0、1、2、3、4个或更多个这些置换(往往具有1-4个这些置换)，任选还可具有另外的置换。

在一个实施方案中，CD16A结合蛋白可包含与Hu3G8VH-1构建物的VH结构域(其序列在表4中给出)相同或相似的重链可变结构域序列。例如，本发明提供包含具有这样的序列的VH结构域的CD16A结合蛋白，所述序列(1)与Hu3G8VH-1的VH结构域差别在于0个、1个或1个以上的表1所示CDR置换；(2)与Hu3G8VH-1的VH结构域差别在于0个、1个或1个以上的表1所示构架置换；和(3)在其余位置与Hu3G8VH-1 VH序列有至少约80％同一性，往往至少约90％同一性，有时至少约95％同一性，或者甚至至少约98％同一性。

本发明的CD16A结合蛋白的示例性VH结构域具有表3和6所示的Hu3G8VH-5和Hu3G8VH-22的序列。

VH结构域所具有的序列与Hu3G8VH-1的序列(表4)的差别可为至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个表1所示的置换。这些置换据认为会导致对CD16A的亲和力提高和/或会减少CD16A结合蛋白当给予人时的免疫原性。在某些实施方案中，在其余位置与Hu3G8VH-1 VH结构域的序列同一性程度为至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。
表1 VH结构域置换
出于示例而非限制的目的，表4中显示了多种CD16A结合蛋白VH结构域的序列。下文实施例中描述到，将包含融合到人Cγ1恒定区的这些序列的重链与hu3G8VL-1轻链(下述)共表达形成四聚抗体，测量该抗体与CD16A的结合，对比hu3G8VH-1VH结构域评估氨基酸置换的作用。其中的VH结构域具有3G8VH-1、2、3、4、5、8、12、14、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、42、43、44和45的序列的构建物显示高亲和力结合，hu3G8VH-6和-40VH结构域显示中等结合。包含hu3G8VH-5和hu3G8VH-22的VH结构域的CD16A结合蛋白被认为具有特别优良的结合特性。
B.VL区
进行了类似的研究，以鉴定具有优良结合特性的轻链可变结构域序列。在一个方面，本发明提供包含这样的轻链可变结构域的CD16A结合蛋白，该结构域中至少一个CDR(通常3个CDR)具有小鼠单克隆抗体3G8轻链的某个CDR(更通常所有3个CDR)的序列，而该结合蛋白的剩余部分是实质上人的(源自和实质上类似于人抗体的重链可变区)。

在一个方面，本发明提供这样的人源化3G8抗体或抗体片段，其在实质上人构架中含有源自3G8抗体的CDR，但其中轻链可变结构域的至少一个CDR在序列上与小鼠抗体3G8轻链CDR不同。在一个实施方案中，该CDR与3G8序列的差异至少在于CDR中具有一个或多个氨基酸置换，如一个或多个表2所示的置换(例如CDR1中位置24处的精氨酸；CDR1中位置25处的丝氨酸；CDR1中位置32处的酪氨酸；CDR1中位置33处的亮氨酸；CDR2中位置50处的天冬氨酸、色氨酸或丝氨酸；CDR2中位置53处的丝氨酸；CDR2中位置55处的丙氨酸或谷氨酰胺；CDR2中位置56处的苏氨酸；CDR3中位置93处的丝氨酸和/或CDR3中位置94处的苏氨酸)。在各个实施方案中，可变结构域可包含0、1、2、3、4、5个或更多个这些置换(往往具有1-4个这些置换)，任选还可具有另外的置换。

在一个实施方案中，合适的CD16A结合蛋白可包含与Hu3G8VL-1构建物的VL结构域(其序列在表5中给出)相同或相似的轻链可变结构域序列。例如，本发明提供包含具有这样的序列的VL结构域的CD16A结合蛋白，所述序列(1)与Hu3G8VL-1的VL结构域差别在于0个、1个或多个表2所示CDR置换；(2)与Hu3G8VL-1的VL结构域差别在于0个、1个或多个表2所示构架置换；和(3)在其余位置与Hu3G8VL-1 VL序列有至少约80％同一性，往往至少约90％同一性，有时至少约95％同一性，或者甚至至少约98％同一性。

本发明的CD16A结合蛋白的示例性VL结构域具有表4和6所示的Hu3G8VL-I或Hu3G8VL-43的序列。

VL结构域所具有的序列与Hu3G8VL-1的序列(表5)的差别可为0个、1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个表2所示的置换。这些置换据认为会导致对CD16A的亲和力提高和/或会减少CD16A结合蛋白当给予人时的免疫原性。在某些实施方案中，在其余位置的序列同一性程度为至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。
表2 VL结构域置换
出于示例而非限制的目的，表5中显示了多种CD16A结合蛋白VL结构域的序列。下文实施例中描述到，将包含融合到人CK恒定区的这些序列的轻链与Hu3G8VH-1重链(下述)共表达形成四聚抗体，测量该抗体与CD16A的结合，对比Hu3G8VL-1 VL结构域评估氨基酸置换的作用。其中的VL结构域具有3G8VL-1、2、3、4、5、10、16、18、19、21、22、24、27、28、32、33、34、35、36、37和42的序列的构建物显示高亲和力结合，hu3G8VL-15、17、20、23、25、26、29、30、31、38、39、40和41显示中等结合。包含hu3G8VL-1、hu3G8VL-22和hu3G8VL-43的VL结构域的CD16A结合蛋白被认为具有特别优良的结合特性。
C.VL和/或VH结构域的组合
本领域公知的是，本文别处也阐述到，可将免疫球蛋白轻链和重链在它们能结合在一起产生四聚抗体的条件下进行重组表达，或者可在体外进行如此组合。类似地，可将VL和/或VH结构域的组合表达成单链抗体的形式，另外其它的包含VL和/或VH结构域的CD16A结合蛋白可用公知的方法进行表达。因此应认识到，可将本文描述的源自3G8的VL结构域与本文描述的源自3G8的VH结构域进行组合产生CD16A结合蛋白，所有这种组合都被设想到了。

出于示例而非限制的目的，有用的CD16A结合蛋白的实例是包含至少一个VH结构域和至少一个VL结构域的结合蛋白，其中该VH结构域来自hu3G8VH-1、hu3G8VH-22或hu3G8VH-5，该VL结构域来自hu3G8VL-1、hu3G8VL-22或hu3G8VL-43。具体的说，包含hu3G8VH-22及hu3G8VL-1、hu3G8VL-22或hu3G8VL-43，或者hu3G8VH-5及hu3G8VL-1的人源化抗体具有优良的特性。

本领域技术人员认识到，本文描述的VL和VH结构域的序列可用公知的方法如亲和力成熟作进一步的修饰(参见Schier等，1996，J.Mol.Biol.263551-67；Daugherty等，1998，Protein Eng.11825-32；Boder等，1997，Nat.Biotechnol.15553-57；Boder等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9710701-705；Hudson和Souriau，2003，Nature Medicine 9129-39)。例如，CD16A结合蛋白可用亲和力成熟技术进行修饰，以鉴定出对CD16A的亲和力提高和/或对CD16B的亲和力下降的蛋白质。
D.恒定结构域和Fc区
上文提到，本发明的CD16A结合蛋白可含有轻链和/或重链恒定区(包括连接IgG分子中的CH1和CH2结构域的铰链区)。设想认为可以使用来自任何类型的免疫球蛋白(例如IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)的恒定结构域。轻链的恒定结构域可以是λ或κ。重链的恒定结构域可以是任何同种型(例如IgG1、IgG2，、IgG3和IgG4)。可以使用嵌合恒定结构域、恒定结构域的部分及天然人抗体恒定结构域的变体(含有氨基酸残基的缺失、插入或置换)。例如，可作修饰在恒定结构域的氨基酸序列中产生出变化，以提供另外的或不同的特性，如所得多肽的免疫原性或半寿期改变。所述变化可从少数(例如小于10个，如1、2、3个或更多个)氨基酸残基的插入、缺失或置换到恒定区结构域的大量修饰。所设想到的变化包括会影响与膜受体的相互作用、补体固定、循环持续性和其它效应子功能的变化。例如，铰链区和其它区域可按美国专利第6,277,375号的描述进行修饰。特别是，缺失或改变Fc区的氨基酸往往是有利的。例如，可对Fc区进行修饰，以减少或消除与Fc效应配体如FcγRIII和补体的C1q成分的结合，使得抗体缺乏(或大大减低了)效应子功能。具有这种修饰Fc区的抗体当给予哺乳动物时与未修饰抗体相比，极少或不会引发抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)和/或补体介导裂解。鉴定缺乏效应子功能的抗体的测定法是本领域公知的。参见例如美国专利第6,194,551号、第6,528,624号和第5,624,821号；欧洲专利第EP 0 753065 B1号和PCT公开说明书WO 00/42072。

本发明的CD16A结合蛋白可包括这样的人IgG1Fc结构域，其包含的一个或多个氨基酸置换或缺失(相对于亲本天然IgG1)导致结合蛋白的Fc结构域与FcγRIIA和/或FcγRIIIA之间的相互作用减低(例如以使巨噬细胞的潜在激活减至最低和/或使嗜中性白血病减少减至最低)和/或Fc区与FcγRIIB的结合增加(例如以使FcγRIIB介导的对效应细胞激活的抑制增加；参见Bolland和Ravetch，1999，Adv.in Immunol.72149)。实现所需的结合上的变化的具体突变，可通过利用微生物、病毒或哺乳动物细胞的表面上表达的突变Fc文库的展示，从这种文库中筛选具有所需特性的突变Fc变体来进行选择鉴定。另外，文献报道说，Fc的特定残基或区域参与Fcγ相互作用，因此这些残基的缺失或突变预期会导致FcγR结合减低。人抗体上的FcγR结合位点据报道是残基233-239(Canfield等，1991，J.Exp.Med.1731483-91；Woof等，1986，Mol.Imm.23319-30；；Duncan等，1988，Nature 332563)。与人IgG1Fc复合的FcγRIII的晶体结构揭示了受体及其配体之间的潜在接触处，还揭示单FcγRIII单体以不对称方式结合Fc同型二聚体的两个亚单位。Fc区的丙氨酸扫描诱变证实了大多数的预测接触残基的重要性(Shields等，2001，J.Biol.Chem.2766591-6604)。

示例性的Fc区突变包括例如向Cγ-1中的L235E、L234A、L235A和D265A突变(已证实它们对所有FcR的亲和力低)(Clynes等，2000，Nat.Med.6443-46；Alegre等，1992，J.Immunol.1483461-68；Xu等，2000，CellImmunol.20016-26)。另外的据信能影响FcR结合的Fc区修饰在WO00/42072(例如“4级(class 4)”Fc区变体)和WO 02/061090中描述。

Fc与FcγRIIA和FcγRIIIA或其它蛋白质的结合可用多种方法中的任何一种来测量，这些方法包括ELISA法测量与分离重组FcγR的结合和RIA法或FACS法测量与细胞的结合。免疫复合物和热聚集或化学交联Fc或IgG可用于这种测定法中测试对FcR的亲和力。在一个实施方案中，免疫复合物这样来产生在Fab背景下表达对抗原(如荧光素)有亲和力的Fc，并将抗体和抗原混合形成免疫复合物。
E.因无糖基化或糖基化的变化对Fc效应配体的结合减低的Fc区
上文讨论到，在包含Fc结构域的本发明CD16A结合蛋白(例如抗CD16A单克隆抗体)中，该Fc结构域可进行修饰以实现所需的特性。在一个具体的方面，本发明提供包含不被糖基化的Fc区的CD16A结合蛋白，如人或人源化抗CD16A单克隆抗体。在一些实施方案中，无糖基化抗体通过对Fc区的修饰来产生。这种修饰的实例包括但不限于位置297处被丙氨酸或谷氨酰胺置换；或位置298处被脯氨酸或天冬氨酸置换；或位置299处被除丝氨酸或苏氨酸外的任何氨基酸置换。在其它实施方案中，本发明的无糖基化抗体可在其糖基化途径存在突变的细胞系中产生。这种细胞系是本领域技术人员公知的，包括例如fuc6。下文实施例10说明到，本发明人意外发现，效应子功能改变的抗CD16A抗体(无糖基化抗体)的给予能抵抗自身免疫疾病而又不引起急性严重嗜中性白血病减少。在这个发现的基础上，可设计出治疗性抗CD16A抗体来抵抗自身免疫疾病而又不引起危险的副作用。

在一个实施方案中，本发明提供包含源自人IgG1的Fc区的CD16A结合蛋白，其中对应于Fc区的CH2结构域的位置297的氨基酸是无糖基。术语“无糖基”或“无糖基化的”当指Fc区整体、Fc区当中的特定区域或Fc区中的特定氨基酸残基时，是指没有糖残基连接到该特定区域或残基。

本发明涵盖包含不被糖基化的Fc区的CD16A结合蛋白，如人或人源化抗CD16A单克隆抗体。本文所用的“不被糖基化的”(或“无糖基化的”)Fc区涵盖其中整个Fc区不含糖基化位点、或其中Fc区当中的特定区域不被糖基化、或其中Fc区当中的特定残基不被糖基化的Fc区。

本发明涵盖包含不被糖基化的Fc区的CD16A结合蛋白，如人或人源化抗CD16A单克隆抗体。在一个具体的实施方案中，本发明提供包含源自人IgG1的Fc区的CD16A结合蛋白，其中对应于Fc区的CH2结构域的位置297的氨基酸是无糖基(本文称为GMA-161)。在另一个实施方案中，本发明提供与GMA-161竞争结合和/或能和GMA-161一样结合CD16A的相同表位的CD16A结合蛋白。本发明还涵盖这样的分子，该分子所包含的氨基酸序列与GMA-161的氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性。

本发明还涵盖这样的抗体或其片段，该抗体或其片段所包含的可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列与GMA-161的可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性。本发明亦涵盖这样的抗体或其片段，所述抗体或其片段所包含的一个或多个CDR的氨基酸序列与GMA-161的一个或多个CDR的氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性。两个氨基酸序列的同一性百分数可用本领域技术人员公知的任何方法来确定，包括BLAST蛋白质搜索。

在一个方面，CD16A结合蛋白包含如上所述的VH结构域和VL结构域(它可通过编码重链和轻链的多核苷酸的共表达来制备)。任选地，人源化重链可变区包含SEQ ID NO109或120所示的序列或由该序列组成，和/或人源化轻链可变区包含SEQ ID NO96或98所示的序列。例如，在示例性的实施方案中，结合蛋白其重链可变区具有序列SEQ IDNO109或120和其轻链可变区具有序列SEQ ID NO96或98。在另一个示例性的实施方案中，结合蛋白其重链可变区具有序列SEQ IDNO109和其轻链可变区具有序列SEQ ID NO96。在另一个示例性的实施方案中，结合蛋白其重链可变区具有序列SEQ ID NO109和其轻链可变区具有序列SEQ ID NO98。在另一个示例性的实施方案中，结合蛋白其重链可变区具有序列SEQ ID NO120和其轻链可变区具有序列SEQ ID NO98。在另一个示例性的实施方案中，结合蛋白其重链可变区具有序列SEQ ID NO120和其轻链可变区具有序列SEQ ID NO98。

在一个实施方案中，CD16A结合蛋白可包含与SEQ ID NO109或120所示的VH结构域相同或相似的重链可变结构域序列。在一个实施方案中，本发明提供包含这样的VH结构域的CD16A结合蛋白，该VH结构域其序列与SEQ ID NO109或120的VH结构域的差异在于0个、1个或1个以上的氨基酸修饰。在其它实施方案中，本发明提供与SEQ ID NO109或120的VH序列有至少约80％同一性、往往至少约90％同一性、有时至少约95％同一性或至少约98％同一性的CD16A结合蛋白。

在其它实施方案中，VH结构域所具有的序列与SEQ ID NO109或120的序列的差别可为至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个本文所示的修饰。在某些实施方案中，与VH结构域的序列同一性程度为至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。

在一个实施方案中，CD16A结合蛋白可包含与SEQ ID NO96或98所示的VL结构域相同或相似的轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，本发明提供包含这样的VL结构域的CD16A结合蛋白，该VL结构域其序列与SEQ ID NO96或98的VL结构域的差异在于0个、1个或1个以上的氨基酸修饰。在其它实施方案中，本发明提供与SEQ ID NO96或98的VL序列有至少约80％同一性、往往至少约90％同一性、有时至少约95％同一性或至少约98％同一性的CD16A结合蛋白。

在其它实施方案中，VL结构域所具有的序列与SEQ ID NO96或98的序列的差别可为至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个本文所示的修饰。在某些实施方案中，与VL结构域的序列同一性程度为至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。

不被糖基化的人IgG抗体显示与Fc效应子配体如Fc受体和C1q的结合降低(参见例如Jefferis等，1995，Immunology Letters 44111-17；Tao等，1989，J.of Immunology，1432595-2601；Friend等，1999，Transplantation 681632-37；Radaev and Sun，2001，J.of BiologicalChemistry 27616478-83；Shields等，2001，J.of Biological Chemistry2766591-6604和美国专利第5,624,821号)。虽然不想受限于具体的机制，但还是认为本文所述的CD16A结合蛋白Fc结构域位置297处的氨基酸的无糖基化导致与CD16A和补体的C1q成分的结合减低。这种无糖基化的抗体缺乏效应子功能。

在人IgG1恒定区中，位置297处的残基是天冬酰胺。在本发明的一个实施方案中，位于或对应于CD16A结合蛋白Fc结构域的位置297处的残基是天冬酰胺以外的残基。用另一氨基酸残基置换天冬酰胺可消除位置297处的N-糖基化位点。任何氨基酸残基置换，只要不会导致CD16A结合蛋白在哺乳动物细胞中表达时发生糖基化，都适合于本实施方案。例如，在本发明的一些实施方案中，位置297处的氨基酸残基是谷氨酰胺或丙氨酸。在一些实施方案中，位置297处的氨基酸残基是半胱氨酸，其任选连接到PEG。

在本发明的其它实施方案中，位置297处的残基可以是或可以不是天冬酰胺，但不被糖基化。这可通过多种方式来实现。例如，已知位置297处天冬酰胺以外的氨基酸残基对于位置297处的N-连接糖基化是重要的(参见Jefferis和Lund，1997，Chem.Immunol.65111-28)，CH2结构域的位置297以外的位置处的残基的置换可导致产生在残基297处无糖基化的CD16A结合蛋白。出于示例而非限制的目的，CH2结构域中位置299处的苏氨酸或丝氨酸以外的残基会导致产生在位置297处不被糖基化的抗体。类似地，位置298处的氨基酸置换成脯氨酸会产生在位置297处的氨基酸不被糖基化的抗体。在本发明的其它实施方案中，使用IgG2或IgG4的Fc结构域而不是IgG1结构域。

CD16A结合蛋白的氨基酸残基的修饰在本领域普通技术人员的技能范围内，可通过对编码该结合蛋白或其部分的多核苷酸的突变来实现。包含源自IgG的Fc区的CD16A结合蛋白不一定要在氨基酸水平上发生突变才能是无糖基化的。在源自IgG的Fc区的位置297处无糖基化的结合蛋白，可通过使CD16A结合蛋白在某些细胞(例如大肠杆菌；参见国际公开说明书WO 02061090A2)和细胞系中，或者在某些不会在Asn 297处发生糖基化的细胞培养生长条件下进行表达来产生。或者，可在蛋白质表达后例如通过酶法从CD16A结合蛋白除去糖基。除去或修饰蛋白质上糖基的方法是公知的，包括使用内切糖苷酶和肽:N-糖苷酶。

显而易见的是，有多种方法可用来修饰CD16A结合蛋白的Fc区以改变其特性。因此，除非另有指定，本文在修饰CD16A结合蛋白的Fc区情形下所用的术语“修饰”，包括直接修饰蛋白质本身，修饰编码该蛋白质的多核苷酸和/或修饰或选择供产生该蛋白质的合适表达系统。

除了在对应于精氨酸297的位置处无糖基化的CD16A结合蛋白外，因为该位置处的糖类的仅仅部分除去或修饰所致的与Fc效应配体的结合减低的变体，也可用于本发明中。例如，可对Fc区进行修饰以使包含不会给结合蛋白赋予效应子功能的非天然糖类。本文所用的“修饰Fc区”是源自亲本Fc区、但在糖基化模式上与亲本Fc区不同的Fc区。

在一些实施方案中，本发明涵盖通过修饰(例如缺失)糖基化位点来修饰本发明抗体的糖类含量的方法。修饰抗体的糖类含量的方法是本领域公知的，并将它们纳入本发明中，参见例如美国专利第6,218,149号；EP 0 359 096 B1；美国公开说明书第2002/0028486号；WO03/035835；美国公开说明书第2003/0115614号；美国专利第6,218,149号；美国专利第6,472,511号；所有这些专利通过引用整体结合到本文中。在其它实施方案中，本发明涵盖通过缺失抗体的一个或多个内源糖部分(moiety)来修饰本发明抗体的糖类含量的方法。在一个具体的实施方案中，本发明涵盖通过修饰邻近297的位置来使抗体Fc区的糖基化位点移位。
F.CD16A结合蛋白的产生
本发明的CD16A结合蛋白可用本领域公知的多种方法来产生，包括蛋白质从头合成和编码该结合蛋白的核酸的重组表达。所需的核酸序列可通过重组方法(例如先期制备的所需多核苷酸的变体的PCR诱变)或通过固相DNA合成来产生。通常使用重组表达方法。在一个方面，本发明提供包含这样的序列的多核苷酸，该序列编码本文所公开的CD16A结合蛋白或其CD16A结合片段，例如该序列编码本文所述的VL或VH或者本文所述的抗体重链或轻链。由于遗传密码的简并性，有多个核酸序列编码每个免疫球蛋白氨基酸序列，本发明包括所有编码本文描述的结合蛋白的核酸。

抗体的重组表达是本领域公知的，例如可通过将编码任选连接到恒定区的轻链和重链可变区的核酸插入到表达载体中来进行。表达载体通常包括控制序列如启动子、增强子和转录终止序列，编码多肽(例如免疫球蛋白链)的DNA区段被有效连接到这些控制序列以确保免疫球蛋白多肽的表达。表达载体通常可在宿主生物中作为附加体或宿主染色体DNA的组成部分来复制。轻链和重链可克隆在相同的或不同的表达载体中。

免疫球蛋白轻链和重链用标准的方法来表达。含多条多肽链的抗体或抗体片段可在单一宿主细胞表达系统中产生，即宿主细胞产生抗体或抗体片段的每条链，并在体内将各条多肽链装配成多聚结构形成抗体或抗体片段。参见例如Lucas等，1996，Nucleic Acids Res.，241774-79。当重链和轻链分别在单独的表达载体上克隆时，将各载体进行共转染以获得完整免疫球蛋白的表达和装配。或者，还已知可以这样做分别在单独的表达载体中重组产生抗体重链和轻链，然后在体外从各条重链和轻链装配出抗体。参见例如美国专利第4,816,567号和Carter等，1992，Bio/Technology 10163-67。

CD16A结合蛋白可方便地在原核细胞或真核细胞中表达。有用的抗体表达宿主包括细菌(参见例如PCT公开说明书WO 02/061090)、酵母(例如Saccharomyces)、昆虫细胞培养物(Putlitz等，1990，Bio/Technology 8651-54)、植物和植物细胞培养物(Larrick和Fry，1991，Hum.Antibodies Hybridomas 2172-89)和哺乳动物细胞。表达的方法是本领域公知的。例如，在大肠杆菌中，应用lac启动子来驱动融合到各种原核分泌信号序列如pelB的重链和轻链的表达的载体，成功实现了scFv和Fab片段向周质间隙或向培养基的分泌(Barbas等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.887978-82)。可使用源自pET25b的其中已插入lac启动子取代T7启动子的载体。

哺乳动物系统特别适用于产生CD16A结合蛋白，包括四聚抗体及其片段。已知有多种能够分泌完整异源蛋白质的核酸宿主细胞系，包括CHO细胞系、COS细胞系、HeLa细胞、L细胞和骨髓瘤细胞系。哺乳动物细胞的表达载体可包含表达控制序列，如复制起点、启动子、增强子、核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。表达控制序列的实例有源自内源基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。在一个实施方案中，结合蛋白用载体pCDNA3.1或类似载体中的CMV即时早期增强子/启动子来表达。为促进分泌，可按Orlandi等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.863833-37的描述将基因融合到含有小鼠VH基因的信号序列的基因盒，这种做法已被广泛用于免疫球蛋白的高水平分泌。

可用常规方法将含有编码目的多肽的DNA区段的载体转移到宿主细胞中，具体方法取决于细胞宿主的类型。例如，氯化钙转染法常用于原核细胞，而磷酸钙处理法、电穿孔法、脂质转染法、生物导弹法或基于病毒的转染法可用于其它细胞宿主。其它用以转化哺乳动物细胞的方法包括使用polybrene、原生质体融合、脂质体、电穿孔和微量注射(一般可参见Sambrook等，出处同上)。为进行瞬时表达，可采用阳离子脂质(例如LIPOFECTAMINETM 2000，Invitrogen)用单独的重链表达载体和轻链表达载体对细胞例如HEK293进行共转染。这个方法可实现3天后条件培养基中的IgG表达水平为10-20mg/l。然后可再对细胞进行流加培养，3天后又收获到相似的数量。应认识到，对于一些应用来说，可将表达CD16A结合蛋白的细胞维持在含有FBS(经筛选有非常低水平的牛IgG)的培养基中，或者维持在无血清培养基中。

除了表达四聚抗体外，还可制备单链抗体、抗体片段和其它CD16A结合蛋白。例如，可通过对四聚抗体进行蛋白水解消化，或者更通常地通过重组表达截短的抗体构建物，来制备免疫球蛋白片段。通常用短的连接肽连接VL和/或VH结构域来制备单链V区(“scFv”)构建物(参见例如Bird等，1988，Science 242423-26；美国专利第4,946,778号、第5,455,030号、第6,103,889号和第6,207,804号)。

结合蛋白表达出来后，可用本领域公知的程序进行纯化，所述程序包括硫酸铵沉淀、亲和层析、凝胶电泳等(一般可参见Harris和Angal，1990，PROTEIN PURIFICATION APPLICATIONS，A PRACTICAL APPROACHOxford University Press，Oxford，UK及Coligan等，出处同上)。在一个实施方案中，这样实现纯化用高流速蛋白质A树脂如Poros A(PerceptiveBiosystems，Inc)捕获抗体，在低pH下洗脱，然后进行大小排阻层析以除去任何存在的痕量聚集物。由于FcγRIIIA会优先结合聚集的IgG，对于某些应用来说将需要除去聚集物。结合蛋白如需要可纯化至极大的纯度，例如至少约80％纯度、常常至少约90％纯度、更常常至少约95％纯度、或者至少约98％纯度。就此而论，纯度百分数按制品的总蛋白质含量的重量百分数来计算，不包括结合蛋白纯化出来后特意加入到组合物中的各组分。

CD16A结合蛋白可在表达后进行修饰。例如，用聚乙二醇使抗体衍生化(“聚乙二醇化”)据报道能延长停留时间(半寿期和稳定性)和降低体内免疫原性而又不改变生物活性。参见例如Leong等，2001，Cytokine16106-19；Koumenis等，2000，Int.J.Pharm.19883-95；美国专利第6,025,158号。可将CD16A结合蛋白缀合到可检测标记或配体(例如放射性同位素或生物素)。其它修饰是本领域公知的，也设想包括在本发明中。
G.CD16A结合蛋白的特性
在某些实施方案中，将具有下述特性的CD16A结合蛋白用于本发明的方法中。
i)结合亲和力
CD16A结合蛋白可用其结合特性和生物活性来描述。在各个实施方案中，本发明CD16A结合蛋白和CD16A的相互作用的结合常数为0.1-5nM、小于约2.5nM、小于约1nM或小于约0.5nM。通常，该结合蛋白结合CD16A的亲和力，为3G8或下述包含重链Ch3G8VH和轻链Ch3G8VL的嵌合抗体在类似条件下所显示的结合亲和力的4倍以内，任选2倍以内。在一个实施方案中，(该结合蛋白)对CD16A的结合亲和力大于3G8(对CD16A)的结合亲和力。在另一个实施方案中，(该结合蛋白)对CD16B的结合亲和力不大于、优选小于3G8或嵌合抗体Ch3G8(对CD16B)的结合亲和力。

结合可用多种方法来测量，包括ELISA、生物传感器(动力学分析)和放射免疫测定(RIA)。ELISA是公知的(参见Harlow和Lane，出处同上及Ausubel等，出处同上)，可用含有结合蛋白的条件培养基或者用纯化的抗体来进行。由导致50％表观最大结合的抗体浓度可估测抗体Kd。

结合也可用生物传感器测定法来检测，该测定法也能提供有关抗体结合FcγRIIIA的动力学和平衡特性的信息。示例性的生物传感器测定法使用到BIAcore系统(Malmqvist等，1997，Curr.Opin.Chem.Biol.1378-83)。BIAcore系统的操作涉及到使分析物经过其上固定有配体(例如CD16A)的传感器芯片。分析物的结合可通过跟踪表面等离子共振(SPR)信号来测量，该信号随结合到芯片的分析物质量成正比变化。使固定浓度的分析物经过芯片达给定的一段时间，以便测量缔合速度k(on)。这个阶段之后，使单独缓冲液经过芯片，可测量分析物从芯片表面解离的速度k(off)。从两动力学常数之比可计算出平衡解离常数；Kd＝k(on)/k(off)。

可用放射免疫测定(RIA)来测量抗体对荷FcγRIII细胞的亲和力，和测量这些抗体对IgG与细胞的复合的抑制作用。在一个示例性的测定中，制备125I标记的结合蛋白，测定该蛋白质的比放射性。将标记的结合蛋白和细胞混合数小时，离心将细胞和被结合的物质与不被结合的物质分离，测定两个分离层中的放射性。采用直接结合方案(direct bindingformat)，用结合数据的Scatchard分析，测定碘化结合蛋白的Kd和结合位点数量。可将含有过量的冷(未标记)结合蛋白竞争物的对照包括在内，以确保结果能反映具体的相互作用。合适的细胞的实例包括(1)源自正常人外周血淋巴细胞的NK细胞或巨噬细胞；(2)从huCD16A转基因小鼠获得的细胞(Li等，1996 J.Exp.Med.1831259-63)；(3)表达融合到RII或别的受体(如CD8或LFA-3)的跨膜和胞内结构域的CD16A胞外部分的哺乳动物细胞系；(4)短暂或稳定转染上CD16A表达载体的哺乳动物细胞系(例如CHO、HEK-293、COS)(任选共表达γ链以使受体表达最佳)。

可用于表达CD16A和其它供用于结合测定的多肽的表达载体的实例，包括含有强启动子/增强子序列(例如CMV即时早期启动子/增强子序列)和位于其中引入了CD16A基因的多聚接头区域的聚腺苷酸化/侧翼的转录终止位点的哺乳动物表达载体(例如pCDNA 3.1或pCI-neo)。通常，载体包括可选择标志如新霉素抗性基因。

在一个实施方案中，被表达以供用于测定的CD16A具有以下序列
MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEK DSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEY RCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKN TALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSK NVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFS VKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK(SEQ ID NO116)。也可使用具有以下序列的CD16A
MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEK DSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEY RCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKN TALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSK NVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFS VKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK(SEQ ID NO117)。

另外的CD16A变体和置换物是普通技术人员公知的，或者普通技术人员容易从科学文献辨别。

可使用竞争性测定方案(format)来测量CD16A结合蛋白抑制别的分子与受体的结合的能力。例如，在一个竞争性测定方案中，将固定数量的标记3G8与不同数量的未标记3G8、CD16A结合蛋白或非相关IgG(对照)混合并加入到FcγRIIIA表达细胞。在进行温育并将被细胞结合的物质与游离于溶液中的物质分离后，测定被结合的标记3G8(和/或任选还有未被结合的标记3G8)的数量。然后从此数据确定出导致标记3G8的结合降低50％(IC50)的未标记单克隆抗体的浓度。
ii)阻断结合FcγRIIIA的免疫复合物
本发明CD16A结合蛋白的另一特征是能够抑制免疫复合物(IC)与CD16A的结合(“IC阻断活性”)。通常，结合蛋白的IC阻断活性是3G8或本文所述嵌合蛋白Ch3G8在类似条件下所显示的活性的4倍以内，优选2倍以内。

测量抗体阻断复合IgG与CD16A的结合的能力的测定法是公知的。参见例如Knapp等，1989，LEUKOCYTE TYPING IV，Oxford UniversityPress，Oxford，第574-97页及Edberg和Kimberly，1997，J.Immunol.1593849-57。一种合适的测定法是RIA测定法，其方案为上述竞争性测定方案，但用125I标记的聚集非相关人IgG1代替上述竞争性测定法中所用的125I-标记3G8。

本发明提供抑制IgG抗体与细胞上的CD16的结合的方法，该方法是使细胞与CD16A结合蛋白在CD16A结合蛋白能结合细胞上的FcγRIII的条件下接触。接触可以是体内接触(例如通过在哺乳动物体内给予结合蛋白)或者体外接触(例如通过将抗体加入到表达FcγRIII的培养细胞)。被阻止结合FcγRIII的IgG抗体，可在结合蛋白的加入或给予之前或之后给予动物或加入到培养基，或者可正常地存在于或因响应疾病状态存在于动物中。在一个实施方案中，细胞表面上的CD16是CD16A。
iii)防止发生血小板损耗的体内保护作用
可在多种动物模型中评估本发明CD16A结合蛋白减少有害免疫应答的能力。示例性的模型系统是特发性血小板减少性紫癜(ITP)的小鼠模型(参见Oyaizu等，1988，J Exp.Med.1672017-22；Mizutani et al.1993，Blood 82837-44)。参见下文实施例9。其它合适的模型是本领域公知的。其它动物模型包括例如Current Protocols in Immunology中所描述的炎性疾病啮齿动物模型(在一些情况下用人CD16A转基因动物进行修正)。转基因小鼠可用常规方法产生，或者可从商业来源(例如Taconic Inc.，German Town，New York)购得。

适合评估CD16A结合蛋白在小鼠模型中提供保护以防血小板损耗的能力的程序的一个实例，在下文实施例8中描述。可将CD16A结合蛋白以多个浓度给予muFcγRIII-/-，huFcγRIIIA转基因小鼠，随后在小鼠中引发ITP(例如通过给予小鼠6A6或嵌合6A6抗体来引发)。在6A6/ch6A6给予后的定时时间间隔，将小鼠放血，测定血小板计数。任选然后在阴性对照组中观察到最大血小板损耗的时间点测定每种分子的IC50。根据实施例8的结果和先前的研究结果，最大损耗出现在6A6给予后2-6小时。IC50用曲线拟合程序如SigmaPlot程序中提供的四参数拟合进行图解确定。与未处理组和给予了非相关同种型匹配单克隆抗体的相同制剂的组相比，处理组在给予6A6后血小板损耗得到统计学显著的抑制，这表明存在所需的生物活性。

测定CD16A结合蛋白的保护作用的实验在下文实施例中描述。HEK-293细胞中产生的重组小鼠3G8、具有人IgG1或IgG2恒定结构域的嵌合3G8(HEK-293和CHO-K1细胞中产生的ch3G8-γ1及HEK-293细胞中产生的ch3G8-γ2)和ch3G8-γ1变体(ch3G8-γ1 D265A)的制品并不提供显著的保护作用。从杂交瘤产生的鼠3G8和在HEK-293细胞中产生的含无糖基化人G1恒定区的3G8嵌合型(Ch3G8-G1 N297Q)，在小鼠模型中能够保护小鼠免于血小板损耗。下文实施例10、11和15-17证实到，Ch3G8 N297Q和无糖基化人源化抗体在ITP小鼠模型中能提供保护以防血小板损耗。虽然不想受限于具体的理论，但还是认为一种可能性是，由于ch3G8 N297Q在很大程度上缺乏了效应子功能，它在保护小鼠免于ITP方面比ch3G8更有效。因此，这些数据提示，无效应子功能的抗CD16A抗体(例如无糖基化抗体)优于一些糖基化抗体(例如糖基化重组抗体)。此外，如实施例中所描述，将无糖基化抗CD16A抗体给予muFcγRIII-/-，huFcγRIIIB转基因小鼠不会导致血液、脾脏和骨髓中出现嗜中性白细胞损耗。虽然不想受限于具体的理论，但还是认为这些意外结果有几种可能的解释。已知蛋白质糖基化作用在不同的细胞系中有所不同，特别是来自不同物种的细胞系。因在不同细胞类型中表达而导致的连接到抗体恒定区的糖类的性质差异，可能是造成活性差异的原因，也就是说活性的缺乏部分原因是由ch3G8以糖基化依赖性方式通过抗体Fc区结合Fc受体(或补体)所引起的效应细胞激活。或者，重组鼠和ch3G8可含有其它的会影响活性的翻译后修饰，这些翻译后修饰可通过用不同细胞系表达CD16A结合蛋白来消除。将同种型和/或含有突变的同种型进行组合来消除效应子功能，这种做法所能提供的保护作用可能类似于消除Fc上的糖类的做法。
5.治疗方法
有多种以有害免疫应答为特征的疾病和病症可用本发明结合蛋白来治疗，该结合蛋白即本文所述的CD16A结合蛋白(例如包含本文所公开的VL和/或VH序列，并任选包含按本文所公开进行修饰以使效应子功能减低的Fc区)。在一个实施方案，将结合蛋白给予患自身免疫疾病(即以自身抗体的产生为特征的疾病)的受试者。据认为，自身免疫疾病中所观察到的病原性IgG抗体，或者是这些疾病的病原引发物，或者通过对细胞Fc受体的不适当激活促进疾病进程和介导疾病。聚集的自身抗体和/或与自身抗原复合的自身抗体(免疫复合物)能结合激活性FcR，从而引发多种自身免疫疾病的后发病(其部分上因为针对自身组织的免疫介导验证而发生)。虽然不想受限于具体的作用机制，但还是认为本文描述的CD16A结合蛋白会干扰和减少自身免疫抗体与FcγRIII受体的相互作用。

可以治疗的自身免疫疾病的实例包括但不限于特发性血小板减少性紫癜(ITP)、类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性溶血性贫血(AHA)、硬皮病、自身抗体引发的荨麻疹、天疱疮、血管炎综合征、系统性血管炎、古德帕斯彻氏综合征、多发性硬化(MS)、牛皮癣关节炎、强直性脊椎炎、斯耶格伦氏综合征、赖特综合征、川崎氏病、多肌炎和皮肌炎。可按本发明进行治疗的疾病和病症的其它实例还包括任何易用静脉免疫球蛋白(IVIG)疗法治疗的疾病(例如过敏性哮喘)。因此，设想到了迄今为止用IVIG疗法治疗的自身免疫疾病(在一个实施方案中，ITP以外的病症)的治疗。尽管还没有详细了解IVIG的作用机制，但还是认为对细胞FcγR活性的调节在其体内功效中起到作用。IVIG的保护活性可能有赖于制品中存在的少部分二聚或多聚IgG。FcγRIII途径在将细胞毒性和免疫复合物抗体与效应子应答相偶联方面的特异性，和能够用单克隆抗体直接阻断这一途径的这个事实，强烈提示抗FcγRIII抗体相比于IVIG将具有增强的活性。

可通过给予本发明抗体进行治疗的自身免疫疾病的其它实例，包括但不限于局限性脱发、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、肾上腺的自身免疫疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻-皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病、Churg-Strauss综合征、疤痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩氏病、盘状红斑狼疮、特发性混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、血管球性肾炎、格雷夫斯氏病、Guillain-Barre综合征、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、幼年型关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮、Mknikre氏病、混合性结缔组织病、多发性硬化、I型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、polychrondritis、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、牛皮癣关节炎、Raynauld’s phenomenon、赖特综合征、类风湿性关节炎、肉样瘤病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)、红斑狼疮(lupus erythernatosus)、Takayasu氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞血管炎、溃疡性大肠炎、色素层炎、vasculitide如皮炎、herpetiformis vasculitis、白癜风和韦格纳氏肉芽肿。炎性疾病的实例包括但不限于哮喘、脑炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、变态反应性疾病、脓毒性休克、肺纤维化、未分化型脊椎关节病变、未分化型关节病(undifferentiated arthpathy)、关节炎、炎性骨质溶解及慢性病毒性和细菌性感染所致的慢性炎症。一些自身免疫疾病伴有炎性病症。因此，所认为的自身免疫疾病和炎性疾病之间有重叠。因此，一些自身免疫疾病也可表现为炎性疾病。可按本发明方法进行预防、治疗或控制的炎性疾病的实例包括但不限于哮喘、脑炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、变态反应性疾病、脓毒性休克、肺纤维化、未分化型脊椎关节病变、未分化型关节病(undifferentiated arthpathy)、关节炎、炎性骨质溶解及慢性病毒性和细菌性感染所致的慢性炎症。

有害免疫应答的减少可检测为炎症的减少。在一个具体的实施方案中，相比于没有给予抗体的动物的炎症，给予所述抗体可减少动物的炎症达至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或至少10％。或者，有害免疫应答的减少可检测为所治疗病症的特有症状的减少(例如患有自身免疫疾病的受试者所呈现的症状的减少)，或者可按自身免疫领域的医师和实验人员容易确认的其它标准来检测。显而易见的是，在许多情况下，具体的减少征象将取决于所治疗的具体病症。例如，出于示例而非限制的目的，ITP受试者中有害免疫应答的减少可检测为受试者中血小板水平的升高。类似地，贫血受试者中的有害免疫应答的减少可检测为受试者中RBC水平的升高。临床医师会确认出治疗后血小板或RBC水平的显著变化或者其它应答。

有害免疫反应任选由特发性血小板减少性紫癜(ITP)所致或因将抗血小板抗体(任选为鼠单克隆抗体6A6)给予muFcγRIII-/-，huFcγRIIIA转基因小鼠而产生。

在一个方面，本发明提供通过给予在很大程度上缺乏效应子功能的CD16A结合蛋白来治疗自身免疫疾病如ITP的方法。在一个实施方案中，CD16A结合蛋白包含源自仁IgG的Fc区。在一个实施方案中，Fc区无糖基。在一个实施方案中，每个CH2结构域的位置297是天冬酰胺或脯氨酸以外的残基。在一个方面，结合蛋白包含本文别处所述的可变区序列。但是，如本文所论述，本发明的组合和治疗方法并不限于源自鼠单克隆抗体3G8的具体CD16A结合蛋白，而是可应用于全体CD16A结合蛋白。在一个实施方案中，CD16A结合蛋白是具有两个轻链和两个重链的四聚抗体蛋白。

在一个相关方面，本发明提供通过给予哺乳动物治疗有效量的包含本文所述CD16A结合蛋白的药物组合物，来减少哺乳动物中的有害免疫应答而又不显著减少嗜中性白细胞水平或引起嗜中性白细胞减少(例如严重嗜中性白细胞减少或中度嗜中性白细胞减少)的方法。在一个实施方案中，哺乳动物是人。在一个实施方案中，哺乳动物是包含一个或多个人转基因的非人动物(例如小鼠)。

为了治疗应用，将本发明的结合蛋白用药物可接受赋形剂或载体(例如含水载体如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等)进行配制，并任选包括其它用以增加稳定性、半寿期或用以接近生理条件的物质(乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠、组氨酸和精氨酸)。为了给予个体，组合物任选是无菌的，且热原或其它污染物。结合蛋白的浓度可在很大范围内变动，例如从小于约0.01％、通常至少约0.1％到高达5％(重量)。制备胃肠外给药的组合物的方法对于本领域技术人员是公知的或显而易见的，这些方法在例如Remington，THE SCIENCE OF PRACTICEAND PHARMACY，第20版，Mack Publishing Company，Easton，PA，2001)中有更详细的描述。本发明的药物组合物通常通过胃肠外途径给予，最通常通过静脉内、皮下、肌肉内途径给予，但其它给予途径也可使用(例如黏膜、表皮、腹膜内、口服、鼻内和肺内途径)。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体肌肉内、静脉内或皮下给予。本发明的组合物可给予患者身体的其它部位，例如骨髓、脊髓。组合物可通过任何便利的途径给予，例如通过输注或大剂量注射给予，或者通过上皮衬里或黏膜皮肤衬里(例如口腔黏膜、直肠和肠黏膜等)吸收给予，且可与其它生物活性剂一起给予。给予可以是全身给予或局部给予。另外，还可采用肺部给予，例如通过使用吸入器或喷雾器来给予，和与气溶胶化剂一起配制给予。参见例如以下各号美国专利6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；及以下PCT公开说明书WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，每个专利通过引用整体结合到本文中。

药物组合物优选以适合于精确数量给药的单位剂型形式供应，不过这不是必需的。

在一个实施方案中，CD16A结合蛋白可以以适于缓释的形式、在适于缓释的制剂或装置中来给予(所述缓释例如在几个周或几个月的时间里稀释)。

在一个实施方案中，将编码CD16A结合蛋白的多核苷酸(例如CD16A结合蛋白表达载体)给予患者。给予后，CD16A结合蛋白在患者中得到表达。适应于给予CD16A结合蛋白的载体可以是病毒载体(例如源自腺病毒的载体)或非病毒载体。通常，载体会包含启动子，任选还包含有助于驱动蛋白质的转录的增强子。这种治疗性载体可体内、体外或先体外后体内(ex vivo)引入到细胞或组织中。对于先体外后体内疗法，可将载体引入到取自患者的细胞(如干细胞)中，并进行克隆增殖以便自体移植回相同患者中(参见例如美国专利第5,399,493号和第5,437,994号)。

组合物可给予来进行预防性和/或医疗性治疗。在预防性应用中，在预期的或潜在的有害免疫应答出现之前将组合物给予患者。例如，特发性血小板减少性紫癜和系统性红斑狼疮这些病症中的有害免疫应答可能会因某些药物的给予而恶化。可预料到这种药物引起的应答而给予本发明的CD16A结合组合物，以减少应答的程度。在医疗性应用中，将组合物给予已经遭受有害免疫应答的患者，给予的量足以至少部分上改善病况及其并发症。足够实现这一点的数量可以是“治疗有效量”或“治疗有效剂量”。对这些用途来说有效的数量取决于病症和患者本身免疫系统的一般状况，但一般为每剂约0.01至约100mg抗体，更常用的是每个患者0.1-50mg和1-10mg的剂量。也可以给予哺乳动物“炎症减少量的”结合蛋白以减少有害免疫应答。

本发明组合物的能有效治疗、预防或改善有害免疫应答所伴一种或多种症状(例如自身免疫疾病)的数量，可通过标准的临床技术来确定。制剂中所要采用的精确剂量也须取决于给药途径和病症的严重程度，并应按执业医师的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可从得自体外试验系统或动物模型试验系统的剂量-反应曲线外推得到。

本发明组合物给予患者的剂量通常为约0.1mg/kg至约10mg/kg患者体重，例如约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5和约10mg/kg患者体重。优选地，给予患者的剂量为约0.1mg/kg至约3mg/kg患者体重。在其它实施方案中，本发明组合物的剂量为约0.1、约0.3、约1.0或约3.0mg/kg患者体重。在一个最优选的实施方案中，本发明组合物在约30分钟时间里静脉内给予。在其它实施方案中，本发明组合物在至少约1小时、至少约30分钟或至少约15分钟时间里静脉内给予。

CD16A结合蛋白的给予可按主治医师的判断来进行，例如每天一次、每周一次、两周一次或任何其它合适的时间间隔，这取决于诸如疾病性质、患者病况和结合蛋白半寿期等因素。

用治疗上或预防上有效量的本发明CD16A结合蛋白对受试者的治疗，可包括单次治疗或优选可包括一系列的治疗。在一个优选的实施方案中，用本发明CD16A结合蛋白以约0.1至约10mg/kg体重的剂量对受试者进行治疗，治疗时间是每周一次，进行约1至约10周，优选约2至约8周，更优选约3至约7周，甚至更优选约4、约5或约6周。在其它实施方案中，本发明的药物组合物每天给予一次、两次或三次。在其它实施方案中，本发明药物组合物每周一次、每周两次、每两周一次、每月一次、每六周一次、每两个月一次、每年两次或每年一次进行给予。还应认识到，用于治疗的抗体的有效剂量可在特定治疗过程中增加或减少。

可将CD16A结合蛋白与旨在减轻有害免疫应答或其症状或后遗症的其它治疗法组合给予。因此，结合蛋白可作为包括共给予别的药剂的治疗方案的一部分来给予，所述别的药剂例如化疗药剂如非类甾醇抗炎药物(例如阿司匹林、布洛芬)、类甾醇(例如皮质类固醇、泼尼松)、免疫抑制剂(例如环胞菌素A、甲氨喋呤、环磷酰胺制剂)和抗体(例如与IVIG联用)。
A.药物组合物
本发明组合物包括可用于制备药物组合物的原料药组合物(例如不纯的或非无菌的组合物)和可用于制备单位剂型的药物组合物(即适合于给予受试者或患者的组合物)。这种组合物包含预防上或治疗上有效量的本文所公开预防和/或治疗药剂或者这些药剂和药物可接受载体的组合。优选地，本发明组合物包含预防上或治疗上有效量的本发明抗体和药物可接受载体。

在一个具体的实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的CD16A结合蛋白和药物可接受载体。在一个实施方案中，所述药物组合物还包含一种或多种另外的药剂。

在一个具体的实施方案中，术语“药物可接受(的)”指被美国联邦政府或州政府的管理机关批准或者被美国药典或其它公认药典列入用于动物，更具体的说人类。术语“载体”指稀释剂、佐剂(例如弗氏完全和不完全佐剂)、赋形剂或治疗药物借以进行给药的介质。这种药物载体可以是无菌液体如水和油，油包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给予时，水是优选的载体。盐水溶液及右旋糖和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、flee、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。组合物如需要还可含有少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可呈现溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释剂等形式。本发明组合物可含有本领域公知的任何赋形剂，如Handbook ofPharmaceutical Excipients，Arthur H.Kibbe(2000版)，Am.PharmaceuticalAssociation，Washington，DC中所公开的赋形剂；该手册的内容通过引用整体结合到本文中。

通常，本发明组合物的各成分单独供应或者在单位剂型中混合在一起供应，例如作为装在密封容器如安瓿或小药囊(sachette)中的冻干粉或无水浓缩物供应，所述容器标示有活性剂的数量。在组合物通过输注给予的情况下，它可用含有无菌药物级水或盐水的输注瓶进行分配。在组合物通过注射给予的情况下，可提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便在进行给药前将各成分混合。

本发明组合物可配制成中性形式或盐形式。药物可接受的盐包括但不限于与阴离子形成的盐，如衍自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，和与阳离子形成的盐，如衍自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
6.增加CD16A结合蛋白的疗效
在一个相关方面，本发明提供一种增加包含一个或多个Fc结构域的CD16A结合蛋白(例如包含两个Fc结构域的抗CD16A抗体)的疗效的方法，所述方法包括对该蛋白进行修饰，使得其Fc区与原始(即未修饰)Fc区相比对至少一种Fc效应配体的结合力减低。例如，可对Fc区进行修饰，使得Fc区不被糖基化。如上所述，可通过几种方式(例如通过遗传突变、通过选择表达系统来改变Fc糖基化模式等方式)，实现对Fc区的修饰。在一个实施方案中，Fc效应配体是FcγRIII。在一个实施方案中，Fc效应配体是补体的C1q成分。如本文所用，题述CD16A结合蛋白当给予时不会引起嗜中性白细胞减少(或者所导致的嗜中性白细胞减少较不严重)，则它与会引起嗜中性白细胞减少的参考结合蛋白相比“疗效”提高。例如，某一CD16A结合蛋白能减少哺乳动物中的有害免疫应答(例如哺乳动物中的ITP或实验引发的ITP)的严重程度并减少嗜中性白血病水平达x％，另一CD16A结合蛋白能减少动物中的有害免疫应答的严重程度并减少嗜中性白血病水平达y％，如果y大约x，例如大两倍，则前者的“疗效”大于前者。在一个实施方案中，蛋白质通过突变来修饰，使得被修饰蛋白无糖基化。

例如，本发明提供产生包含修饰免疫球蛋白重链的修饰CD16A结合蛋白，即疗效大于包含亲本免疫球蛋白重链的亲本CD16A结合蛋白的修饰CD16A结合蛋白的方法，所述方法如下进行(1)向编码亲本免疫球蛋白重链的亲本多核苷酸中引入至少一个突变，以产生编码修饰免疫球蛋白重链的修饰多核苷酸，该突变向修饰免疫球蛋白重链中所引入的氨基酸置换会改变、减少或消除亲本免疫球蛋白重链的CH2结构域中的糖基化；(ii)将该修饰多核苷酸在细胞中表达成修饰免疫球蛋白重链，以产生该修饰CD16A结合蛋白重链。任选的，该重链在能与轻链共表达以产生四聚抗体的条件下产生。
7.消除细胞因子释放综合征
治疗性单克隆抗体的应用受到“首剂”副作用的问题的限制。首剂副作用可从轻微的流感样症状到严重的毒性这样的轻微程度到严重程度，包括诸如以下的症状高烧、发冷/寒战、头痛、震颤、恶心/呕吐、腹泻、腹痛、身体不适、肌肉/关节疼痛和全身乏力。首剂副作用据认为由单克隆抗体的Fc区结合和激活含FcγR细胞上的FcγR而刺激发生的淋巴因子产生和细胞因子释放所引起。或者，首剂副作用可由Fc区结合补体相关受体如C1q所引起。

本发明因此涵盖通过减少或消除Fc与一个或多个FcγR的结合，或者通过减少或消除Fc与至少一个补体相关受体如C1q的结合，来减少或消除至少一种与首剂副作用有关的症状的CD16A结合蛋白。这种CD16A结合蛋白包含相对于野生型Fc区域而言具有一个或多个氨基酸修饰的变异Fc区。相对于可比较的野生型Fc区，该修饰能降低或消除Fc与一个或多个FcγR的结合(或者减少或消除Fc与至少一个补体相关受体如C1q的结合)。该修饰通常是氨基酸置换。但是，该修饰也可以是氨基酸插入和/或缺失。通常，该修饰出现在CH2和/或铰链区中。或者，通过改变或消除一个或多个Fc区上的一个或多个糖基，可以减少或消除Fc与一个或多个FcγR的结合。Fc糖基化作用可用本领域公知的方法改变或消除。例如，Fc糖基化作用可通过在岩藻糖基化作用缺损的细胞(例如fuc6裸细胞)中产生Fc来改变，或者通过去糖基化酶或者能改变或消除糖基化位点(例如CH2结构域中的位置297-299处的N-X-S/T糖基化位点)的氨基酸修饰来消除。FcγR结合可用本领域公知和本文例示的标准方法来测量。本发明的抗体因此特别有用，因为它们因淋巴因子产生或细胞因子释放综合征所引起的体内毒性发生减少或没有。

测量淋巴因子产生和细胞因子释放的方法是本领域公知和常规的，它们纳入本文中。例如，细胞因子释放可通过测量包括但不限于TNF-α、GM-CSF、IFN-α在内的细胞因子的分泌来测量。参见例如美国专利第6,491,916号；Isaacs等，2001，Rheumatology，40724-738；这两个文献通过引用整体结合到本文中。淋巴因子产生可通过测量包括但不限于以下淋巴因子在内的淋巴因子的分泌来测量白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)、白介素-16(IL-16)、PDGF、TGF-α、TGF-α、

TNF-α、GCSF、GM-CSF、MCSF、

IFN-α、TFN-α、IGF-I、IGF-II。例如参见Isaacs等，2001，Rheumatology，40724-738；Soubrane等，1993，Blood，81(1)15-19；这两个文献通过引用整体结合到本文中。

本文所用的术语“Fc区”用以定义IgG重链的C末端区域。将人IgG重链Fc区定义为从Cys226延伸到羧基末端，尽管分界线可能稍有不同。IgG的Fc区包含CH2和CH3这两个恒定结构域。人IgG Fc区的CH2结构域通常从氨基酸231延伸到氨基酸341。人IgG Fc区的CH3结构域通常从氨基酸342延伸到氨基酸447。人IgG Fc区的CH2结构域(也称“Cγ2‘结构域)通常从氨基酸231延伸到340。CH2结构域的独特之处在于它没有与别的结构域紧密配对。相反，有两个N连接的分支糖链插入在完整天然IgG的两个CH2结构域之间。

在本说明书中，IgG重链中的残基的编号方式为Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService，NH1，MD(1991)中所载的EU index的编号方式，该文献通过引用特意结合到本文中。“Kabat中所载的EU index”指人IgG1 EU抗体的编号方式。

“铰链区”通常定义为从人IgG1的Glu216延伸到Pro230。可将形成重链间S-S键(inter-heavy chain S-S binds)的第一个和最后一个半胱氨酸残基按相同方向放置，以将其它IgG同种型的铰链区与IgG1序列进行比对。

可减少或消除至少一种与首剂副作用有关的症状的Fc修饰的实例，包括但不限于以下Fc修饰位置233处的氨基酸被脯氨酸置换；或者位置234处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置235处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置234处的氨基酸被丙氨酸置换和位置235处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置238处的氨基酸被精氨酸置换；或者位置265处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置265处的氨基酸被谷氨酸置换；或者位置270处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置270处被天冬氨酸置换；或者位置297处的丙氨酸或谷氨酰胺置换；或者位置298处被脯氨酸或天冬氨酸置换；或者位置299处被除丝氨酸或苏氨酸以外的任何氨基酸置换；或者位置265处的氨基酸被丙氨酸置换和位置297处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置265处的氨基酸被丙氨酸置换和位置297处的氨基酸被谷氨酰胺置换；或者位置265处的氨基酸被谷氨酸置换和位置297处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置265处的氨基酸被谷氨酸置换和位置297处的氨基酸被谷氨酰胺置换。本发明还涵盖任何本文所列变体的组合。

本发明涵盖减少或消除患者中至少一个与首剂副作用有关的症状的方法，所述方法包括给予有效量的一种或多种本发明抗体。本发明方法能减少至少一种与细胞因子释放综合征有关的症状，包括但不限于高烧、发冷/寒战、头痛、震颤、恶心/呕吐、腹泻、腹痛、身体不适、肌肉/关节疼痛和全身乏力。
8.实施例 实施例1小鼠3G8VH和VL及从中产生的嵌合分子 A)小鼠3G8VH和VL
克隆了编码小鼠3G8抗体轻链的cDNA。3G8抗体重链的序列由Jeffrey Ravetch博士提供。3G8VH和VL的氨基酸序列在下表1和3中提供。编码可变区的核酸序列如下 SEQ ID NO1{3G8VH} CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGT CTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGGACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGG ATTCGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGAT GACAAGCGCTATAATCCAGCCCTGAAGAGCCGACTGACAATCTCCAAGGATACCTCC AGCAACCAGGTATTCCTCAAAATCGCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATAC TACTGTGCTCAAATAAACCCCGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTC ACTGTCTCTGCA SEQ ID NO3{3G8VL} GACACTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCC ACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTTTGATGGTGATAGTTTTATGAAC TGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATACTACATCCAAT CTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGCCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACC CTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATACTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGT AATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA B)嵌合重链
为构建出编码融合到人恒定结构域的小鼠3G8VH的表达的嵌合基因，用标准技术(包括重叠PCR扩增)将编码3G8VH的核酸融合到编码信号肽(参见Orlandi等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.863833-37；以下小写字母下划线部分)和人Cγ1恒定区(以下小写字母部分)的序列。为促进克隆，引入SacI位点，导致VH FR4中的单一残基变化(ala→ser)。FR4中的这个变化不会影响与CD16的结合。所产生的核酸具有下示序列。编码VH结构域的区域为大写字母部分。
SEQ ID NO5{ch3G8VH} gctagcatttaaacttaagcttgttgactagtgagatcacagttctctctacagtta ctgagcacacaggacctcaccatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagca acagctacaggtaaggggctcacagtagcaggcttgaggtctggacatatatatggg tgacaatgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactccCAGGTTACCCT GAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTC TTTCTCTGGGTTTTCACTGAGGACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAGCC TTCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGACAAGCGCTA TAATCCAGCCCTGAAGAGCCGACTGACAATCTCCAAGGATACCTCCAGCAACCAGGT ATTCCTCAAAATCGCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCA AATAAACCCCGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTGAGCTC Agcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctc tgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgac ggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcct acagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagctt gggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtgga caagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagc acctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacac cctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacga agaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaa gacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcac cgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaa agccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgaga accacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagag caatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacgg ctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaa cgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagag cctctccctgtctccgggtaaatgagtgcggccgcgaattc
将这个构建物插入到pCI-Neo(Promega Biotech)中多接头的NheI-EcoRI位点处，用于在细胞中表达该嵌合重链。
C)嵌合轻链
为构建出编码融合到人恒定结构域的小鼠3G8VL的嵌合基因，用标准技术将这一3G8VL区段融合到信号序列(如上述VH的信号序列(小写字母下划线部分)和人Cκ恒定区(小写字母部分))cDNA，产生具有下示序列的核酸 SEQ ID NO6ch3G8VL gctagctgagatcacagttctctctacagttactgagcacacaggacctcaccatgg gatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtaaggggctcacag tagcaggcttgaggtctggacatatatatgggtgacaatgacatccactttgccttt ctctccacaggtgtccactccGACACTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCT GTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTTT GATGGTGATAGTTTTATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTC CTCATCTATACTACATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGCCAGT GGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATACTGCA ACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAG CTTGAGATCAAAcgaactgtggctgcaccatcggtcttcatcttcccgccatctgat gagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatccc agagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccag gagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctg acgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccat cagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttagttctag agtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattc
将这个构建物插入到pCI-Neo(Promega Biotech)中多接头的NheI-EcoRI位点处，用于在细胞中表达该嵌合轻链。
D)表达
上述ch3G8VH和ch3G8VL嵌合蛋白可共表达形成称为ch3G8的嵌合抗体。嵌合抗体ch3G8可在骨髓瘤中或在其它哺乳动物细胞(例如CHO，HEK-293)中表达。下文实施例4提供了用于CD16A结合蛋白如ch3G8及其变体的表达的程序的一个实例。
实施例2人源化抗CD16A结合蛋白 A)人源化重链
将来自小鼠3G8VH克隆的CDR编码序列融合到源自人种系VH序列VH2-70的构架序列，产生编码标示为Hu3G8VH的VH的多核苷酸。该多核苷酸通过重叠PCR程序产生。在第一个步骤中，使用下示引物和策略，用小鼠3G8VH多核苷酸(SEQ ID NO1)作为模板。


将所得片段用EcoRI和SacI消化并克隆到pUC18中。测序后，选择一个质粒进行最后一轮重叠PCR，以矫正在第二个PCR步骤中产生的缺失。所得多核苷酸具有以下序列 SEQ ID NO16{hu3G8VH} CAGGTTACCCTGAGAGAGTCTGGCCCTGCGCTGGTGAAGCCCACACAGACCCTCACA CTGACTTGTACCTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGG ATTCGTCAGCCTCCCGGGAAGGCTCTAGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGAT GACAAGCGCTATAATCCAGCCCTGAAGAGCCGACTGACAATCTCCAAGGATACCTCC AAAAACCAGGTAGTCCTCACAATGACCAACATGGACCCTGTGGATACTGCCACATAC TACTGTGCTCGGATAAACCCCGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTC ACTGTGAGCTCA
然后将Hu3G8VH序列与编码分泌信号序列的区段(如上所述；小写字母下划线部分)和人Cγ1恒定区的cDNA(小写字母部分)组合。所得多核苷酸具有以下序列 SEQ ID NO17{hu3G8VH-1} gctagcgtttaaacttaagcttgttgactagtgagatcacagttctctctacagtta ctgagcacacaggacctcaccatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagca acagctacaggtaaggggctcacagtagcaggcttgaggtctggacatatatatggg tgacaatgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactccCAGGTTACCCT GAGAGAGTCTGGCCCTGCGCTGGTGAAGCCCACACAGACCCTCACACTGACTTGTAC CTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAGCC TCCCGGGAAGGCTCTAGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGACAAGCGCTA TAATCCAGCCCTGAAGAGCCGACTGACAATCTCCAAGGATACCTCCAAAAACCAGGT AGTCCTCACAATGACCAACATGGACCCTGTGGATACTGCCACATACTACTGTGCTCG GATAAACCCCGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTGAGCTC Agcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctc tgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgac ggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcct acagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagctt gggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtgga caagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagc acctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacac cctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacga agaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaa gacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcac cgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaa agccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgaga accacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagag caatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacgg ctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaa cgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagag cctctccctgtctccgggtaaatgagtgcggccgcgaattc
为在哺乳动物细胞(HEK-293)中表达，将Hu3G8VH-1序列克隆到pCI-Neo多接头的NheI-EcoRI位点处，插入后将其克隆入pUC和pCDNA3.1(following intervening cloning into pUC and pCDNA3.1)。
B)人源化轻链
将来自小鼠3G8VL克隆的CDR编码序列融合到源自人B3种系V-κ基因的构架序列。使用下示引物和策略，用小鼠3G8VL多核苷酸(SEQ ID NO2)作为模板，通过重叠PCR程序产生多核苷酸。


所得多核苷酸具有以下序列 SEQ ID NO25{hu3G8VL} GACACTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCC ACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTTTGATGGTGATAGTTTTATGAAC TGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATACTACATCCAAT CTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGCCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACC CTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATACTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGT AATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTTGAGATCAAA
然后用标准技术将Hu3G8VL基因区段与信号序列(如上所述；小写字母下划线部分)和人C-κ恒定区(小写字母部分)cDNA组合，得到具有以下序列的产物 SEQ ID NO26{hu3G8VL-1} gctagctgagatcacagttctctctacagttactgagcacacaggacctcaccatgg gatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtaaggggctcacag tagcaggcttgaggtctggacatatatatgggtgacaatgacatccactttgccttt ctctccacaggtgtccactccGACACTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCT GTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTTT GATGGTGATAGTTTTATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTC CTCATCTATACTACATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGCCAGT GGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATACTGCA ACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTT GAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCGGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCC AGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAG AGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTG AGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGTTCTAGAGTCGACTCTAG AGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC
将这个构建物插入到pCI-Neo中以便在哺乳动物细胞中表达。
实施例3变异CD16A结合蛋白
制备了另外的表达构建物，其中通过定点诱变在VL或VH结构域中引入了序列变化。典型的诱变反应在0.05ml体积中含有10ng质粒DNA(从大肠杆菌甲基化感受态株分离)、各125ng的正向引物和反向引物(各自含有目的突变)、反应缓冲液和dNTP。加入2.5个单位的

DNA聚合酶(Stratagene)，进行15个循环的95°，30sec、55°，1min、68°，12min反应。然后用DpnI内切核酸酶消化PCR产物，将限制酶切DNA用于转化大肠杆菌XL-10

株超感受态细胞。由于DpnI只消化甲基化DNA，它会消化亲本的非突变质粒，留下的主要是含有目的突变的新合成非甲基化产物。

变异VH结构域的序列在表4中显示。变异VL结构域的序列在表5中显示。
实施例4在哺乳动物细胞中的表达
将重链和轻链表达质粒(例如包含融合到上述人Cγ1和Cκ恒定结构域的嵌合、人源化和变异VL和VH结构域)的各种组合共转染到HEK-293细胞中，进行重组四聚抗体(例如包含2个重链和2个轻链)的瞬时表达，该抗体在本文中有时称为“重组抗体”。转染是用

2000(Invitrogen)根据厂商说明书在6孔板中进行的。

重组抗体是通过将重链表达质粒(即编码包含VH和恒定结构域的重链)和轻链表达质粒(即编码包含VL和恒定结构域的轻链)一起共转染到HEK-293中以便进行重组抗体的瞬时表达来产生的。

将表4所列的Hu3G8VH变体与hu3G8VL-1轻链共表达。作为参考，大多数测定包括(i)ch3G8VH和ch3G8VL的共表达所产生的重组抗体(“ch3G8VH/ch3G8VL”)和(ii)hu3G8VH-1和hu3G8VL-1的共表达所产生的重组抗体(“hu3G8VH-1/hu3G8VL-1”)。

将表5所列的Hu3G8VL变体与ch3G8VH重链共表达。作为参考，大多数测定包括(i)ch3G8VH和ch3G8VL的共表达所产生的重组抗体(“ch3G8VH/ch3G8VL”)和(ii)hu3G8VH和hu3G8VL-1的共表达所产生的重组抗体(“hu3G8VH/hu3G8VL-1”)。

3天后，通过ELISA测定条件培养基中的重组抗体水平，按实施例5的描述用ELISA分析重组抗体与捕获的sCD16A的结合情况。按实施例6所示对选定的抗体测定其与表达CD16A的胞外结构域的细胞的结合情况。
实施例5与CD16A的结合情况的ELISA测定
进行夹心ELISA，以检测抗体与可溶性形式的CD16A的结合情况。

可溶性人CD16A
用pcDNA3.1衍生的表达载体从HEK-293表达可溶性形式的人CD16A，该表达载体含有正好在跨膜区之前被截短的CD16A基因。为构建载体，使用引物3A左 [gttggatcctccaactgctctgctacttctagttt](SEQ ID NO27)和3A右 [gaaaagcttaaagaatgatgagatggttgacact](SEQ ID NO28)，用BamHI和HindIII进行消化，扩增编码CD16A的cDNA，并克隆到多接头的Bam/HindIII位点处的载体pcDNA3.1(Novagen)中。将该构建物用以瞬时转染HEK-293细胞。对于一些测定，采用人IgG Sepharose柱亲和层析从条件培养基纯化分泌的产物。在一些测定中，定量条件培养基中的sCD16A的数量，使用未经纯化的sCD16A。不要求纯化是因为ELISA捕获抗体(LNK16 mAb)特异性结合抗原，使得在洗涤步骤中可以除去污染物。

sCD16A构建物的氨基酸序列如下所示。(下划线的信号序列在表达过程中被切除。注意最后七个残基源自载体pCDNA3.1而不是源自CD16A基因) MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNS TQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAP RWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYF CRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFKLAAARV (SEQID NO29) ELISA方案
首先在室温下，用100ng/孔的抗CD16A mAb LNK-16(Advanced ImmunoChemical，Long Beach CA；参见5th HumanLymphocyte Differentiation Antigens Workshop)(碳酸盐缓冲液中)将板包被2小时。可使用任何不会阻断3G8结合的抗sCD16A抗体。用PBS-T-BSA封闭30分钟后，以1/10的稀释比加入sCD16A条件培养基，在室温下温育16小时。或者，当使用纯化的sCD16A时，在PBS-T-BSA中稀释至50ng/ml的浓度。每孔加入0.05ml，在室温下温育至少2小时。

将板洗涤，然后加入重组抗体在PBS-T-BSA中的稀释液(从0.5μg/ml开始)，在室温下温育1小时。然后用抗人IgG-HRP缀合物和TMB底物测量重组抗体与捕获的sCD16A的结合情况。用稀硫酸终止显色后，在450nM下读板。

结合测定结果
本实施例证实人源化抗CD16A抗体结合CD16A的结合特性与嵌合3G8抗体的特性相同或相似。

基于比较结合研究，将重组抗体分类为以高、中等或低亲和力结合。高和中等结合亲和力的抗体在上文4节中讨论。具有hu3G8VH-9、10、11、13、15、21、38、39或41的VH结构域的重组抗体极少显示或不显示与sCD16A的结合。从这些数据看来，某些置换(或置换的组合)通常有害于结合。例如，VH位置52处的酪氨酸或天冬氨酸的置换(即52Y和52D)或者位置94处的苏氨酸的置换(94T)有害于结合。类似地，位置50处的亮氨酸和位置54处的天冬氨酸的组合(50L+54N)有害于结合，位置94处的精氨酸和位置101处的天冬氨酸的组合(94R+101D)也有害于结合。但是，当位置94是谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸或丙氨酸(但不是精氨酸)时，位置101处允许是天冬氨酸。此外，34V+94R+101D具有中等活性。这表明了位置34、94和101之间在维持高亲和力结合上的关系，并提示34V可能是特别重要的残基。同样，具有hu3G8VL-6、7、8、9、11、12、13和14的VL结构域的重组抗体极少显示或不显示与sCD16A的结合。从这些数据看来，某些置换(或置换的组合)通常有害于结合。例如，位置34处的丙氨酸的置换(34A)或位置92处的酪氨酸的置换(92Y)通常有害于结合。

示例性结合测定的结果在图1中显示。
实施例6抗体与表达CD16A的细胞的结合
用直接结合竞争测定法测定选定的人源化抗体结合CHO-K1细胞表达的CD16A的能力。

将表达融合到FcγRIIb跨膜和胞内结构域的FcγRIIIA胞外结构域的CHO-K1细胞用于细胞结合测定。将细胞以40,000个/孔的密度接种于96孔平底组织培养板(

MICROTESTTM组织培养板，96孔)，在37℃CO2培养箱中温育大约24小时。然后用25mM Hepes，75uMEDTA，11.5mM KCI，115mM NaCl，6mM MgSO4，1.8mM CaCl2，0.25％BSA(结合缓冲液)将板轻微洗涤三次。

对于非直接结合测定，然后将100μl的抗CD16A mAb系列稀释液(终浓度1ug/ml、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03、0.015、0ug/ml)加入到在结合缓冲液中的各孔中。然后将板在23℃下温育1小时，用结合缓冲液洗涤三次。接着向每孔加入50μl/孔的铕(EU)标记抗人IgG(100ng/ml)，将板在23℃下温育30分钟，然后用结合缓冲液洗涤三次。最后，加入100μl

增强溶液，即预定用于Eu3+/Sm3+的定量测定的酸性螯合去污剂溶液(PerkinElmer/Wallac)。振摇温育15分钟后，在VICTOR2仪器(PerkinElmer/Wallac)中对板进行时间分辨荧光(激发340nm；发射615nm)读数。测定的结果在图2中显示。

也将上述CHO-K1细胞用于竞争性测定中。用上述结合缓冲液洗涤后，将不同数量的纯化未标记单克隆抗体(1.2-75nM终浓度)与固定浓度的Eu-Ch3G8-N297Q(终浓度2.5nM)混合。然后将板在23℃下温育1小时，用结合缓冲液洗涤三次。加入100μl

增强溶液(PerkinElmer/Wallac)，振摇温育15分钟后，在VICTOR2仪器(PerkinElmer/Wallac)中对板进行时间分辨荧光(激发340nm；发射615nm)读数。测定的结果在图3中显示。

这些测定证实人源化抗CD16A单克隆抗体以高亲和力结合受转染细胞表面上的CD16A。Hu3G8-22.1-N297Q结合荷CD16A细胞的亲和力比Ch3G8-N297Q更高。
实施例7sCD16A与免疫复合物的结合的抑制 4-4-20与FITC-BSA的结合的测定
通过ELISA评估ch4-4-20或ch4-4-20(D265A)与FITC-BSA的结合。(Ch4-4-20除了它含有4-4-20的各个VH区和VL区而不是3G8的各个VH区和VL区外，其余与Ch3G8完全相同。因此，它保持对半抗原荧光素的高度亲和力和特异性。4-4-20在Bedzyk等，1989，J.Biol.Chem.2641565-9中描述。)将FITC-BSA(1ug/ml-50ng/孔)包被到碳酸盐缓冲液中的Nunc maxisorb免疫板上，让其结合大约16小时。用BSA封闭后，将ch4-4-20的各稀释液加入到各孔中，让其在室温下结合1小时。洗去未结合单克隆抗体后，加入HRP缀合的山羊抗人Ig第二抗体。一小时后将该第二抗体移取、洗涤和用TMB底物显影。加入酸性终止液后，将板在450nm下读数。ch4-4-20和ch4-4-20(D265A)均以高亲和力结合FITC-BSA(数据未显示)。

sFcR与ch4-4-20/FITC-BSA免疫复合物的结合的测定
用同样的方案，测定sFcR与ch4-4-20和FITC-BSA之间在ELISA板上形成的免疫复合物(IC)的结合。在这个测定中我们使用了生物素化sFcR或生物素化抗人G2单克隆抗体作为第二试剂，然后进行链霉亲和素-HRP检测。

鼠、嵌合和人源化3G8对sFcR与IC的结合的抑制
将ch4-4-20和sFcR的浓度固定，以使测定中产生大约90％最大信号。将sCD16A与鼠、嵌合或者人源化3G8的系列稀释液预混合，温育1小时后加入到含有免疫复合物的板中。将人源化或嵌合3G8的系列稀释液与sCD16A-G2-生物素温育1小时。然后将所得混合物加入到含有人IgG1嵌合形式的抗荧光素单克隆抗体4-4-20和FITC-BSA之间的免疫复合物的ELISA板。1小时后，用链霉亲和素-HRP缀合物和TMB显影检测可溶性受体与IC的结合。结果在图4中显示。这个测定表明人源化抗CD16A抗体是CD16A与免疫复合物中的IgG的结合的有效抑制剂。
实施例8抗CD16A单克降抗体批(panel)的分析
以标准方法用sCD16A对小鼠进行免疫和加强免疫后，产生了一批(a panel of)杂交瘤。用ELISA筛选八个96孔板，寻找用sCD16A直接包被板上的结合活性。这些孔中有93％显示阳性信号，对其将作进一步的扩增。FRCS显示这些孔中有37个对人血液细胞结合阳性。然后分析这些上清液阻断CD16A与免疫复合物的相互作用的能力和分析其结合位点(表位)与3G8的结合位点的相似性。各测定包括用嵌合3G8下调(down)进行的捕获ELISA和免疫复合物与sRIIIa-Ig的结合的抑制。根据这些测定，分离出结合和抑制特性类似于3G8的抗体，以及结合和/或抑制特性不同于3G8的单克隆抗体。

DJ130c(DAKO)和3G8在测定中用作对照。单克隆抗体DJ130c是市售单克隆抗体，其结合CD16的表位不同于3G8(Tatum和Schmidt)。这一单克隆抗体不会阻断FcγRIIIa-免疫复合物结合(Tamm和Schmidt)。在基于ELISA的抑制测定中，DJ130c增强了结合而不是抑制了结合。

数据表明该批单克隆抗体含有能结合与Ch3G8的相同的表位和阻断sCD16A与免疫复合物的结合的抗体(表3)。该批单克隆抗体还含有不结合与Ch3G8的相同的表位的抗体。大多数后一种抗体不阻断sCD16a与免疫复合物中的IgG的相互作用。
表3
实施例9体内血小板损耗的诱导
CD16A结合蛋白阻断自身抗体所诱导的人Fc-FcγRIII相互作用的体内活性，可用自身免疫疾病的动物模型进行评估。一个合适的模型是ITP和抗血小板单克隆抗体6A6的“被动(passive)小鼠模型”(参见Oyaizu等，1988，J.Exp.Med.1672017-22；Mizutani等，1993，Blood82837-44)。6A6是源自NZW x BSXB F1个体的IgG2a同种型单克隆抗体。在muFcγRIII-/-，huFcγRIIIA转基因小鼠中给予6A6会损耗其中的血小板，但在无人转基因的muFcγRIII-/-小鼠中却不会。参见Samuelsson等，2001，Science 291484-86。这个模型中可使用其它抗血小板单克隆抗体代替6A6。或者，也可以使用多克隆抗血小板抗体。

能赋予最大程度的抗血小板损耗保护作用的CD16A结合蛋白，可通过将CD16A结合蛋白给予muFcγRIII-/-，huFcγRIIIA转基因小鼠并测定单克隆抗体6A6诱导的血小板损耗的任何减少来鉴定。

可用6A6的嵌合人IgG1κ嵌合衍生物代替上述方案中的小鼠单克隆抗体进行相关的测定，使得引起损耗的单克隆抗体具有人同种型。为进行这个测定，将编码鼠抗血小板单克隆抗体6A6VH和VL区的各cDNA区段分别与人Cγ1和CκcDNA区段融合，制备嵌合6A6单克隆抗体(ch6A6)。所得基因在293细胞中共表达，通过A蛋白亲和层析然后是尺寸排阻层析纯化嵌合6A6。

为证明该嵌合6A6抗体能诱导血小板损耗，将ch6A6给予muFcγRIII-/-，huFcγRIIIA转基因小鼠。将ch6A6静脉内(i.v.)或腹膜内(i.p.)给予每只小鼠(0.1μg/g)。各小鼠在给予ch6A6后2小时、5小时、24小时和48小时放血，用Z2TM COULTER

颗粒计数器和孔径70μm的大小分析仪测定血浆血小板计数。计数大小在1.5至4μm之间的颗粒(对应于血小板)，对于每个浓度，将血小板计数对时间作图来进行数据分析。

腹膜内注射0.1μg/g ch6A6两小时后，大约75％的血小板被损耗。ch6A6注射后血小板数量保持低下达5小时，然后逐渐增加并在ch6A6注射后72小时恢复正常。

静脉内注射0.1μg/g ch6A6两小时后，大约60％的血小板被损耗。ch6A6注射后血小板数量保持低下达6小时，然后逐渐增加并在ch6A6注射后48小时恢复正常。
实施例10CD16A结合抗体保护小鼠免于血小板损耗的能力的分析
CD16A结合蛋白减少实验性ITP中的血小板损耗的能力可如下所述进行测定。将CD16A结合蛋白以0.5、1、2或5μg/g的浓度(于磷酸缓冲盐水PBS中)静脉内(i.v.)给予各组muFcγRIII-/-，huFcγRIIIA转基因小鼠。对照为单独PBS或非相关人IgGI(阴性对照)或人静脉免疫球蛋白(IVIG；阳性对照)。在CD16A结合蛋白或对照给予后1小时，通过静脉内或腹膜内给予每只小鼠0.1μg/g ch6A6引发ITP。各小鼠在ch6A6给予后2小时、5小时、24小时和48小时放血。用Z2TM COULTER

颗粒计数器和上述大小分析仪测定血浆血小板计数，对于每个所给予的结合蛋白浓度，将血小板技术对时间作图进行数据分析。

当muFcγRIII-/-huFcγRIIIA转基因小鼠在ch6A6腹膜内注射前1小时用鼠3G8(0.5μg/g)注射时，有33％的血小板在2小时点被损耗(图5)。然后血小板数量逐渐增加并在ch6A6注射后24小时恢复正常。当muFcγRIII-/-，huFcγRIIIA转基因小鼠在ch6A6静脉内注射前1小时用鼠3G8(0.5μg/g)注射时，有30％的血小板在2小时点被损耗(图6)。然后血小板数量快速增加并在ch6A6注射后5小时恢复正常。

这些结果类似于当给予人IVIG时所见的保护作用。当muFcγRIII-/-，huFcγRIIIA转基因小鼠在ch6A6腹膜内注射前1小时用人IVIG(1mg/g)注射时，有33％的血小板在2小时点被损耗(图5)。然后血小板数量逐渐增加并在ch6A6注射后24小时恢复正常。当muFcγRIII-/-，huFcγRIIIA转基因小鼠在ch6A6静脉内注射前1小时用人IVIG(1mg/g)注射时，有20％的血小板在2小时点被损耗(图6)。然后血小板数量快速增加并在ch6A6注射后5小时恢复正常。

图5和6所示的结果证实m3G8能保护小鼠免于ch6A6-介导的血小板损耗，且保护水平与IVIG所赋予的保护水平相似。

HEK-293细胞中所产生的重组小鼠3G8、具有人IgG1或IgG2恒定结构域的嵌合3G8(HEK-293和CHO-K1细胞中严生的ch3G8-γ1及HEK-293细胞中产生的ch3G8-γ2)和ch3G8-γ1变体(ch3G8-γ1D265A)的制品在这个实验中并不提供显著的保护作用。当muFcγRIII-/-，huFcγRIIIA转基因小鼠在ch6A6腹膜内注射前1小时用ch3G8γ1或γ2(0.5μg/g)注射时，有大约60％的血小板在5小时点被损耗(图7)。然后血小板的数量逐渐恢复正常。尽管损耗情况不如没有接受抗CD16A结合蛋白的小鼠中那么严重，但这些嵌合抗体即使提供保护作用，也比鼠3G8显著少得多。其中天冬氨酸265变成丙氨酸的ch3G8变体显示类似的结果。有趣的是，如实施例11所示，对ch3G8进行修饰产生无糖基化变体，能增加抗体的保护作用。
实施例11Ch3G8N297Q能保护小鼠免于ch6A6介导的血小板损耗
这样制备ch3G8-γ1的无糖基化型将编码ch3G8-γ1的表达多核苷酸突变以使残基297从天冬酰胺(N)变成谷氨酰胺(glutamine acid)(Q)，并表达该受编码抗体。残基297位于N连接糖基化位点，这个突变防止此位点的Fc结构域的糖基化。按对ch3G8-γ1的描述(参见上文实施例4)在HEK-293细胞中产生这一无糖基化抗体ch3G8 N297Q。用上述方案测试ch3G8-N297Q抵抗ch6A6介导的血小板损耗的能力。

当muFcγRIII-/-，huFcγRIIIA转基因小鼠在ch6A6腹膜内注射前1小时用1μg/g的无糖基形式的ch3G8(ch3G8 N297Q)注射时，大约有75％的血小板在2小时点被损耗(图8)。血小板水平增加得比在ch3G8N297Q不存在时要快，在ch6A6注射后24小时恢复正常。

当muFcγRIII-/-，huFcγRIIIA转基因小鼠在ch6A6静脉内注射前1小时注射1μg/g ch3G8 N297Q时，大约有60％的血小板在2小时点被损耗(图9)。血小板水平增加得比在ch3G8 N297Q不存在时要快，在ch6A6注射后48小时恢复正常。

当muFcγRIII-/-，huFcγRIIIA转基因小鼠在ch6A6静脉内注射前1小时注射ch3G8 N297Q(2μg/g)时，只有40％的血小板在2小时点被损耗(图9)。血小板水平增加得比在ch3G8 N297Q不存在时要快，在ch6A6注射后5小时恢复正常。

因此，ch3G8-N297Q总是能够显著改进血小板计数。3G8与效应细胞上的人CD16A的结合，能阻断CD16A与免疫复合物发生相互作用的能力并引发效应子功能如ADCC或吞噬作用。嵌合3G8分子和鼠3G8分子其结合CD16A的能力相似，且抑制sCD16A与体外免疫复合物的结合的能力也相似。虽然不想局限于具体的机制，但还是认为单克隆抗体的结合活性(因此还有阻断活性)被限制于抗体的Fab部分，huCD16A的阻断作用据认为是转基因小鼠ITP模型中的保护作用的机制所在。以上数据提示，Fc结构域的糖基化状态能影响抗CD16A抗体的体内保护能力。Fc结构域糖基化的除去(例如用D265A或N297Q突变或用人γ2 Fc结构域来进行)能减少或消除Fc与FcR的结合。在无糖基(N297Q)变体的情况中，补体固定也被破坏。
实施例12给予无糖基CD16A结合蛋白后的嗜中性白细胞水平
测试无糖基化CD16A结合蛋白对嗜中性白细胞水平的作用，并与糖基化CD16A结合蛋白的作用进行比较。将CD16A结合蛋白或者对照如非相关人IgG1(阴性对照)或鼠RB6-8C5(阳性对照)以5μg/g的浓度(在磷酸缓冲盐水PBS中)给予各组muFcγRIII-/-，huFcγRIIIB转基因小鼠。另一阴性对照只给予PBS。24小时后，将小鼠处以安乐死，收集血液、脾脏和骨髓。通过FACS分析嗜中性白细胞。染色实验在含3％FCS的RPMI中进行。用FITC缀合3G8(PharMingen)和R-PE缀合RB6-8C5(PharMingen)对鼠细胞进行染色。使用FACSCALIBURTM(BectonDickinson)以流式细胞术分析各样品。

腹膜内注射5μg/g ch3G8(如上所述制备)导致了鼠血液和脾脏中的嗜中性白细胞损耗(图10；右上图)。给予鼠3G8后也观察到类似的结果(结果未显示)。在ch3G8处理小鼠的骨髓中，嗜中性白细胞对CD16的染色弱，这可说明嵌合抗体对受体的占据或者说明脱落情况(图10；参见从右上图到左上图的转变)。与此对比，腹膜内注射5μg/g ch3G8N297Q并不导致鼠血液、脾脏或骨髓中的嗜中性白细胞损耗(图10)。在另外的实验中，人源化的糖基化3G8抗体与这种抗体的无糖基化形式相比，显示显著更多的循环血嗜中性白细胞损耗。
实施例13自身免疫性溶血性贫血模型
本实施例证明给予CD16A结合蛋白能防止自身免疫性溶血性贫血模型中的红细胞损耗。

评估了Hu3G8-5.1-N297Q单克隆抗体防止muFcγRIII-/-，huFcγRIIIa+小鼠中的抗体依赖性红细胞损耗的能力。Hu3G8-5.1-N297Q是无糖基抗体，具有重链Hu3G8VH-5和轻链Hu3G8VH-1及指定的天冬酰胺297的置换。在第0天将小鼠放血，用Z2TM COULTER

颗粒分析仪测定红细胞水平。然后在第二天给各有3只小鼠每组小鼠静脉内注射0.5mg/kg Hu3G8-5.1-N297Q或PBS。有一组小鼠没有接受任何化合物。1小时后，通过将鼠抗红细胞IgG2a mAb 34-3C腹膜内给予每只小鼠(2.5mg/kg)，在前两组小鼠中引起红细胞损耗。在给予34-3C后2小时、5小时、24小时和48小时将各小鼠放血，测定红细胞计数。将红细胞计数对时间作图进行数据分析。图11所示的数据证明了Hu3G8-5.1-N297Q在此模型中防止的红细胞损耗的能力。
实施例14抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的抑制
本实施例证明人源化3G8变体能在体外以类似于鼠3G8的活性抑制ADCC。

方法评估抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)的方案与先前描述的方案(Ding等，1998，Immunity 8403-11)类似。简单的说，将来自HER2过表达乳腺癌细胞系SK-BR-3的靶细胞标记以铕螯合物双(乙酰氧基甲基)2，2’6’，2”-三联吡啶-6，6”-二羧酸盐(

BATDA Reagent，Perkin Elmer/Wallac)。然后用嵌合抗HER2抗体(ch4D5，100ng/ml)或嵌合抗荧光素抗体(ch4-4-20，1ug/ml)调理(包被)标记的靶细胞。在抗荧光素抗体的情况中，SK-BR-3细胞在进行抗体调理前先用荧光素半抗原包被。将通过FICOLL-PAQUETM(Amersham Pharmacia)梯度离心的外周血单核细胞(PBMC)用作效应细胞(效应细胞∶靶细胞比ch4D5＝(37.5∶1)，ch4-4-20＝(75∶1))。在37℃，5％CO2下温育3.5小时后，收获细胞上清液，加入到酸性铕溶液(

Europium Solution，Perkin Elmer/Wallac)中。在时间分辨荧光计(VICTOR2 1420，Perkin Elmer/Wallac)中定量所形成的铕-TDA螯合物的荧光。通过将靶细胞分别与2％TX-100和单独介质温育，测定最大释放(MR)和自发释放(SR)。通过在抗体不存在下温育靶细胞和效应细胞，测量抗体非依赖性细胞毒性(AICC)。每个测定重复进行三次。如下计算平均特异性裂解百分数(ADCC-AICC)/(MR-SR)x100。

结果抗CD16A抗体的加入抑制了通过抗HER2/neu蛋白(ch4D5)(图12)或半抗原荧光素(ch4-4-20)(图13)的抗体介导的ADCC。对于所有受试3G8变体，在300ng/ml下对ch4D5介导ADCC的抑制作用大于50％，而同种型对照抗体在测定中没有作用。在抗荧光素抗体的情况中，对于鼠3G8(图13A)和人源化3G8变体(图13B)，在1ug/ml以上的浓度下抑制作用大约为50％，而同种型对照抗体和嵌合3G8的作用极低。
实施例15Hu3G8-5.1-N297Q的给予能防止huFcγRIIa+，huFcγRIIIa+小鼠中的免疫性血小板减少
本实施例证实给予抗CD16A抗体能抵抗CD32A介导的ITP。如同在FcγRIII-/-，hCD16A小鼠中一样，ch6A6抗体的给予能在FcγRIII-/-，hCD32A转基因小鼠中引起ITP。腹膜内注射0.1μg/g ch6A6后5小时，有大约80％的血小板被损耗(结果未显示)。在ch6A6注射后血小板数量保持低下达24小时，然后逐渐增加，在ch6A6注射后48小时恢复正常。如所预期，在ch6A6注射前1小时静脉内注射hu3G8-5.1(0.5μg/g)并不保护FcγRIII-/-，hCD32A小鼠免于ITP(数据未显示)。

如同在单转基因小鼠中一样，ch6A6在FcγRIII-/-，hCD16A，hCD32A双转基因小鼠中引起ITP。腹膜内注射0.1μg/g ch6A后5小时，有大约80％的血小板被损耗(图14)。在ch6A6注射后血小板数量保持低下达24小时，然后逐渐增加，在ch6A6注射后48小时恢复正常。

与FcγRIII-/-，hCD32A小鼠对比，hu3G8-5.1的给予保护了FcγRIII-/-，hCD16A，hCD32A小鼠免于ITP。当在腹膜内注射ch6A6前1小时注射1μg/g h3G85.1时观察到完全保护作用；而给予0.75μg/g或0.5μg/g的h3G8-5.1则产生部分保护作用(图14)。因此，数据表明尽管CD32A能介导ITP，注射1μg/g的h3G8-5.1能完全和出乎意料地保护小鼠免于血小板损耗。
实施例16用CHO-S细胞系中产生的Hu3G8-5.1-N297Q防止血小板损耗
在CHO-S细胞系中产生Hu3G8-5.1-N297Q。用实施例13所述的方案测定此抗体在FcγRIII-/-，hCD16A单转基因小鼠中抵抗ITP的能力。如图15所示，在腹膜内注射ch6A6前1小时给予0.5mg/kg或以上的CHO-S细胞中产生的Hu3G8-5.1-N297Q能完全保护小鼠免于ITP。
实施例17无糖基化人源化抗体的治疗作用
如上所述通过在时间0时腹膜内注射0.1μg/g ch6A6在小鼠中诱发ITP。两小时后，测定血浆中的血小板数量以确认ITP的存在。腹膜内注射ch6A6三小时后，给小鼠静脉内注射不同浓度的hu3G8-5.1-N297Q(箭头)。结果(图16A)表明，在Hu3G8-5.1-N297Q注射后血小板数量快速恢复正常，而在未处理小鼠中血小板数量保持低下。这些结果证明hu3G8-5.1-N297Q抗体的给予能用来治疗小鼠模型中的ITP。

在本实验中，通过在时间0时腹膜内注射0.1μg/g ch6A6诱发ITP。两小时后，测定血浆中的血小板数量以确认ITP的存在。腹膜内注射ch6A6三小时后，给小鼠静脉内注射0.5μg/g的hu3G8-22.1-N297Q或hu3G8-22.43-N297Q(箭头)。结果表明，在Hu3G8-22.1-N297Q注射后血小板数量快速恢复正常，而在未处理小鼠和处理以Hu3G8-22.43-N297Q的小鼠中血小板数量保持低下(图16B)。这些数据表明hu3G8-22.1-N297Q可用来治疗小鼠模型中的ITP。
实施例18Hu3G8-22.1-N2970对muFcγRIII-/-，huFcγRIIIA转基因小鼠中的AHA的治疗作用
在本实验中，在第0天通过腹膜内注射50ug小鼠抗RBC IgG2amAb 34-3C诱发AHA。在第1天，测定血液中的红细胞数量以确认AHA的存在。两小时后，给小鼠静脉内注射不同浓度的Hu3G8-22.1-N297Q(箭头)。结果表明在Hu3G8-22.1-N297Q注射后红细胞数量保持稳定，而未处理小鼠中的红细胞数量继续下降(图17)。Hu3G8-22.1-N297Q的最佳浓度是0.5μg/g。在第7天所有小鼠中的红细胞数量恢复正常。对照小鼠每天进行放血但不进行注射，以确定反复放血对红细胞数量的影响。小鼠模型中的这些结果表明hu3G8-22.1-N297Q可用来治疗AHA。Hu3G8-22.1-N297Q能防止自身抗体造成的更多红细胞损耗，因此能保护小鼠免于贫血。
表4 表4A＊ VH序列 *表4A中的字母指表1中的序列B-H。
表4B FR1 表4C CDR1 表4D FR2 表4E CDR2 表4F FR3 表4G CDR3 表4H FR4 表5 表5A＊ VL序列 *表5A中的字母指表3中的序列B-H。
表5B FR1 表5C CDR1 表5D FR2 表5E CDR2 表5F FR3 表5G CDR3 表5H FR4









实施例18在特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者中进行的GMA-161的I期、非盲、两中心、单剂量、剂量递增、安全性、耐受性、免疫原性研究
GMA-161这种抗Fcγ受体III(FcγRIII，CD16A)人源化抗体，正被开发用来阻断脾脏和肝脏巨噬细胞对抗体包被血小板的吞噬作用。已用鼠抗CD16A mAb 3G8在难治性ITP患者中进行了几个临床研究。虽然在大多数患者中观察到血小板计数的升高，但细胞因子释放综合征、短暂嗜中性白细胞减少和人抗鼠抗体(HAMA)反应阻止了进一步的临床开发。GMA-161除了是“人源化的”外，它从3G8修饰得到，还能降低其Fc结构域固定补体或结合淋巴细胞、嗜中性白细胞或NK细胞上的受体的能力。

患者患者须已确诊ITP至少6个月。优选患者在相隔至少6个周的2次测定中血小板计数须＜50,000/mm3，其中1次测定在开始研究处理前7天内进行。

GMA-161的给予患者在第0天将接受单次静脉内输注GMA-161，并进行为期7天的监测，进行血液样品收集和安全观察。患者接受剂量为0.1mg/kg体重的GMA-161治疗。GMA-161是蛋白质浓度为5mg/mL(25mg/小瓶)的液体溶液剂。GMA-161在含5mM磷酸钠、1.7mM磷酸钾、154mM氯化钠的缓冲液(pH 7.2)中。

免疫学评估和血小板计数评估在下文指定的各个时间点收集免疫学评估样品。还监测血小板计数。在给予GMA-161后2小时、5小时、24小时和48小时收集血液样品，用颗粒计数器和孔径70μm的大小分析仪Z2TM COULTER

测定血浆血小板计数。对于每个浓度，将相对血小板水平(实际血小板计数除以时间0时的血小板计数)对时间作图进行数据分析。

第0天(输注前)、第7天、第21天和第28天抗血小板测定、抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体、抗心磷脂抗体(ACA)、淋巴细胞亚群(包括自然杀伤细胞)和血清免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)浓度以及血清细胞因子测定(例如白介素-6[IL-6]、IL-8和肿瘤坏死因子α[TNFα])。如果患者显示细胞因子释放综合征的征候或症状，在输注后30分钟收集血液进行细胞因子测定。

第0天(输注前)和第7天血清CD16A及C3和C4补体。在第0天收集输注前抗GMA-161抗体血清。当Genzyme ImmunologyLaboratory测出血液GMA-161水平不再干扰测定时，开始输注后抗GMA-161抗体测定。

对患者的成功治疗将显示在GMA-161给予后血小板水平明显提高，无血小板损耗征候，副作用极低，优选没有细胞因子释放综合征。最大耐受剂量因此可在剂量递增研究中确定。
实施例19在特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者中进行的GMA-161的I期、非盲、两中心、单剂量、剂量递增、安全性、耐受性、免疫原性研究
GMA-161这种抗Fcγ受体III(FcγRIII，CD16A)人源化抗体，正被开发用来阻断脾脏和肝脏巨噬细胞对抗体包被血小板的吞噬作用。已用鼠抗CD16A mAb 3G8在难治性ITP患者中进行了几个临床研究。虽然在大多数患者中观察到血小板计数的升高，但细胞因子释放综合征、短暂嗜中性白细胞减少和人抗鼠抗体(HAMA)反应阻止了进一步的临床开发。GMA-161除了是“人源化的”外，它从3G8修饰得到，还能降低其Fc结构域固定补体或结合淋巴细胞、嗜中性白细胞或NK细胞上的受体的能力。

患者患者须已确诊ITP至少6个月。优选患者在相隔至少6个周的2次测定中血小板计数须＜50,000/mm3，其中1次测定在开始研究处理前7天内进行。

GMA-161的给予患者在第0天将接受单次静脉内输注GMA-161，并将进行为期7天的监测，进行血液样品收集和安全观察。患者将接受剂量为0.3mg/kg体重的GMA-161治疗。GMA-161是蛋白质浓度为5mg/mL(25mg/小瓶)的液体溶液剂。GMA-161在含5mM磷酸钠、1.7mM磷酸钾、154mM氯化钠的缓冲液(pH 7.2)中。

免疫学评估和血小板计数评估在下文指定的各个时间点收集免疫学评估样品。还监测血小板计数。在给予GMA-161后2小时、5小时、24小时和48小时收集血液样品，用颗粒计数器和孔径70μm的大小分析仪Z2TM Coulter

测定血浆血小板计数。对于每个浓度，将相对血小板水平(实际血小板计数除以时间0时的血小板计数)对时间作图，进行数据分析。

第0天(输注前)、第7天、第21天和第28天抗血小板测定、抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体、抗心磷脂抗体(ACA)、淋巴细胞亚群(包括自然杀伤细胞)和血清免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)浓度以及血清细胞因子测定(例如白介素-6[IL-6]、IL-8和肿瘤坏死因子α[TNFα])。如果患者显示细胞因子释放综合征的征候或症状，在输注后30分钟收集血液进行细胞因子测定。

第0天(输注前)和第7天血清CD16A及C3和C4补体。在第0天收集输注前抗GMA-161抗体血清。当Genzyme ImmunologyLaboratory测出血液GMA-161水平不再干扰测定时，开始输注后抗GMA-161抗体测定。

成功的患者治疗将显示在GMA-161给予后血小板水平明显提高，无血小板损耗征候，副作用极低，优选没有细胞因子释放综合征。最大耐受剂量因此可在剂量递增研究中确定。
实施例20在特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者中进行的GMA-161的I期、非盲、两中心、单剂量、剂量递增、安全性、耐受性、免疫原性研究
GMA-161这种抗Fcγ受体III(FcγRIII，CD16A)人源化抗体，正被开发用来阻断脾脏和肝脏巨噬细胞对抗体包被血小板的吞噬作用。已用鼠抗CD16A mAb 3G8在难治性ITP患者中进行了几个临床研究。虽然在大多数患者中观察到血小板计数的升高，但细胞因子释放综合征、短暂嗜中性白细胞减少和人抗鼠抗体(HAMA)反应阻止了进一步的临床开发。GMA-161除了是“人源化的”外，它从3G8修饰得到，还能降低其Fc结构域固定补体或结合淋巴细胞、嗜中性白细胞或NK细胞上的受体的能力。

患者患者须已确诊ITP至少6个月。优选患者在相隔至少6个周的2次测定中血小板计数须＜50,000/mm3，其中1次测定在开始研究处理前7天内进行。

GMA-161的给予患者在第0天将接受单次静脉内输注GMA-161，并将进行为期7天的监测，进行血液样品收集和安全观察。患者将接受剂量为1.0mg/kg体重的GMA-161治疗。GMA-161是蛋白质浓度为5mg/mL(25mg/小瓶)的液体溶液剂。GMA-161在含5mM磷酸钠、1.7mM磷酸钾、154mM氯化钠的缓冲液(pH 7.2)中。

免疫学评估和血小板计数评估在下文指定的各个时间点收集免疫学评估样品。还监测血小板计数。在给予GMA-161后2小时、5小时、24小时和48小时收集血液样品，用颗粒计数器和孔径70μm的大小分析仪Z2TM Coulter

测定血浆血小板计数。对于每个浓度，将相对血小板水平(实际血小板计数除以时间0时的血小板计数)对时间作图，进行数据分析。

第0天(输注前)、第7天、第21天和第28天抗血小板测定、抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体、抗心磷脂抗体(ACA)、淋巴细胞亚群(包括自然杀伤细胞)和血清免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)浓度以及血清细胞因子测定(例如白介素-6[IL-6]、IL-8和肿瘤坏死因子α[TNFα])。如果患者显示细胞因子释放综合征的征候或症状，在输注后30分钟收集血液进行细胞因子测定。

第0天(输注前)和第7天血清CD16A及C3和C4补体。在第0天收集输注前抗GMA-161抗体血清。当Genzyme ImmunologyLaboratory测出血液GMA-161水平不再干扰测定时，开始输注后抗GMA-161抗体测定。

成功的患者治疗将显示在GMA-161给予后血小板水平明显提高，无血小板损耗征候，副作用极低，优选没有细胞因子释放综合征。最大耐受剂量因此可在剂量递增研究中确定。
实施例21在特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者中进行的GMA-161的I期、非盲、两中心、单剂量、剂量递增、安全性、耐受性、免疫原性研究
GMA-161这种抗Fcγ受体III(FcγRIII，CD16A)人源化抗体，正被开发用来阻断脾脏和肝脏巨噬细胞对抗体包被血小板的吞噬作用。已用鼠抗CD16A mAb 3G8在难治性ITP患者中进行了几个临床研究。虽然在大多数患者中观察到血小板计数的升高，但细胞因子释放综合征、短暂嗜中性白细胞减少和人抗鼠抗体(HAMA)反应阻止了进一步的临床开发。GMA-161除了是“人源化的”外，它从3G8修饰得到，还能降低其Fc结构域固定补体或结合淋巴细胞、嗜中性白细胞或NK细胞上的受体的能力。

患者患者须已确诊ITP至少6个月。优选患者在相隔至少6个周的2次测定中血小板计数须＜50,000/mm3，其中1次测定在开始研究处理前7天内进行。

GMA-161的给予患者在第0天将接受单次静脉内输注GMA-161，并将进行为期7天的监测，进行血液样品收集和安全观察。患者将接受剂量为3.0mg/kg体重的GMA-161治疗。GMA-161是蛋白质浓度为5mg/mL(25mg/小瓶)的液体溶液剂。GMA-161在含5mM磷酸钠、1.7mM磷酸钾、154mM氯化钠的缓冲液(pH 7.2)中。

免疫学评估和血小板计数评估在下文指定的各个时间点收集免疫学评估样品。还监测血小板计数。在给予GMA-161后2小时、5小时、24小时和48小时收集血液样品，用颗粒计数器和孔径70μm的大小分析仪Z2TM Coulter

测定血浆血小板计数。对于每个浓度，将相对血小板水平(实际血小板计数除以时间0时的血小板计数)对时间作图，进行数据分析。

第0天(输注前)、第7天、第21天和第28天抗血小板测定、抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体、抗心磷脂抗体(ACA)、淋巴细胞亚群(包括自然杀伤细胞)和血清免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)浓度以及血清细胞因子测定(例如白介素-6[IL-6]、IL-8和肿瘤坏死因子α[TNFα])。如果患者显示细胞因子释放综合征的征候或症状，在输注后30分钟收集血液进行细胞因子测定。

第0天(输注前)和第7天血清CD16A及C3和C4补体。在第0天收集输注前抗GMA-161抗体血清。当Genzyme ImmunologyLaboratory测出血液GMA-161水平不再干扰测定时，开始输注后抗GMA-161抗体测定。

成功的患者治疗将显示在GMA-161给予后血小板水平明显提高，无血小板损耗征候，副作用极低，优选没有细胞因子释放综合征。最大耐受剂量因此可在剂量递增研究中确定。
＊＊＊
应认识到，本文描述的实施例和实施方案只出于说明目的，本领域技术人员按照这些实施例和实施方案可想到各种修改方案或变化，这些修改方案和变化应包括在本申请的精神和范围当中以及所附权利要求的范围当中。本文引述的所有出版物(包括序列检索号和相应的注释)、专利和专利申请，出于所有目的通过引用整体结合到本文中，引用程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被特地和单独指出通过引用结合到本文中。
序列表
<110>Macrogenics，Inc.
<120>METHODS OF TREATING AUTOIMMUNE DISEASE USING
HUMANIZED ANTI-CD16A ANTIBODIES
<130>11183-041-228
<140>
<141>
<150>60/698,623
<151>2005-07-11
<160>120
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>354
<212>DNA
<213>小鼠
<400>1
caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagg acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120
cagccttcag ggaagggtct agagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgacaagcgc 180
tataatccag ccctgaagag ccgactgaca atctccaagg atacctccag caaccaggta 240
ttcctcaaaa tcgccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcaaata 300
aaccccgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca354
<210>2
<211>354
<212>PRT
<213>小鼠
<400>2
Cys Ala Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Ala Thr
20 25c30
Ala Thr Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly
35 40 45
Ala Cys Cys Cys Thr Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly Ala Cys Thr Thr
50 55 60
Gly Thr Thr Cys Thr Thr Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Thr Thr
65 70 75 80
Thr Thr Cys Ala Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Thr Thr Cys Thr
85 90 95
Gly Gly Thr Ala Thr Gly Gly Gly Thr Gly Thr Ala Gly Gly Cys Thr
100 105 110
Gly Gly Ala Thr Thr Cys Gly Thr Cys Ala Gly Cys Cys Thr Thr Cys
115 120 125
Ala Gly Gly Gly Ala Ala Gly Gly Gly Thr Cys Thr Ala Gly Ala Gly
130 135 140
Thr Gly Gly Cys Thr Gly Gly Cys Ala Cys Ala Cys Ala Thr Thr Thr
145 150 155 160
Gly Gly Thr Gly Gly Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Ala Ala
165 170 175
Gly Cys Gly Cys Thr Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys
180 185 190
Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Gly Ala
195 200 205
Cys Ala Ala Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Thr Ala Cys
210 215 220
Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Thr Ala
225 230 235 240
Thr Thr Cys Cys Thr Cys Ala Ala Ala Ala Thr Cys Gly Cys Cys Ala
245 250 255
Gly Thr Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala
260 265 270
Thr Ala Cys Thr Gly Cys Cys Ala Cys Ala Thr Ala Cys Thr Ala Cys
275 280 285
Thr Gly Thr Gly Cys Thr Cys Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Cys Cys
290 295 300
Cys Cys Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Thr Thr Gly Cys Thr Thr Ala
305 310 315 320
Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys Thr
325 330 335
Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Thr Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly
340 345 350
Cys Ala
<210>3
<211>333
<212>DNA
<213>小鼠
<400>3
gacactgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg atagttttat gaactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctacatccaa tctagaatct 180
gggatcccag ccaggtttag tgccagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatac tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333
<210>4
<211>333
<212>PRT
<213>小鼠
<400>4
Gly Ala Cys Ala Cys Thr Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys
1 5 10 15
Ala Ala Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Thr Thr
20 25 30
Gly Gly Cys Thr Gly Thr Gly Thr Cys Thr Cys Thr Ala Gly Gly Gly
35 40 45
Cys Ala Gly Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr
50 55 60
Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Ala
65 70 75 80
Ala Ala Gly Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Thr Thr Thr Gly Ala Thr
85 90 95
Gly Gly Thr Gly Ala Thr Ala Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Gly Ala
100 105 110
Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala
115 120 125
Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Cys Ala Cys Cys Cys
130 135 140
Ala Ala Ala Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Thr Ala Thr Ala
145 150 155 160
Cys Thr Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala Ala Thr Cys Thr Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys
180 185 190
Ala Gly Gly Thr Thr Thr Ala Gly Thr Gly Cys Cys Ala Gly Thr Gly
195 200 205
Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Cys Thr Thr
210 215 220
Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Ala Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala Thr
225 230 235 240
Cys Cys Thr Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly
245 250 255
Ala Thr Ala Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Cys Thr Ala Thr Thr Ala
260 265 270
Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Ala Thr
275 280 285
Gly Ala Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Thr Ala Cys Ala Cys Gly Thr
290 295 300
Thr Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala
305 310 315 320
Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala
325 330
<210>5
<211>1580
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>5
gctagcgttt aaacttaagc ttgttgacta gtgagatcac agttctctct acagttactg 60
agcacacagg acctcaccat gggatggagc tgtatcatcc tcttcttggt agcaacagct 120
acaggtaagg ggctcacagt agcaggcttg aggtctggac atatatatgg gtgacaatga 180
catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gttaccctga aagagtctgg 240
ccctgggata ttgcagccct cccagaccct cagtctgact tgttctttct ctgggttttc 300
actgaggact tctggtatgg gtgtaggctg gattcgtcag ccttcaggga agggtctaga 360
gtggctggca cacatttggt gggatgatga caagcgctat aatccagccc tgaagagccg 420
actgacaatc tccaaggata cctccagcaa ccaggtattc ctcaaaatcg ccagtgtgga 480
cactgcagat actgccacat actactgtgc tcaaataaac cccgcctggt ttgcttactg 540
gggccaaggg actctggtca ctgtgagctc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc 600
cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa 660
ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt 720
gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac 780
cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag 840
caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc 900
accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc 960
caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag 1020
ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc 1080
caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac 1140
cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc 1200
cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca 1260
ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg 1320
cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc 1380
ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta 1440
cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt 1500
gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa 1560
atgagtgcgg ccgcgaattc 1580
<210>6
<211>895
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>6
gctagctgag atcacagttc tctctacagt tactgagcac acaggacctc accatgggat 60
ggagctgtat catcctcttc ttggtagcaa cagctacagg taaggggctc acagtagcag 120
gcttgaggtc tggacatata tatgggtgac aatgacatcc actttgcctt tctctccaca 180
ggtgtccact ccgacactgt gctgacccaa tctccagctt ctttggctgt gtctctaggg 240
cagagggcca ccatctcctg caaggccagc caaagtgttg attttgatgg tgatagtttt 300
atgaactggt accaacagaa accaggacag ccacccaaac tcctcatcta tactacatcc 360
aatctagaat ctgggatccc agccaggttt agtgccagtg ggtctgggac agacttcacc 420
ctcaacatcc atcctgtgga ggaggaggat actgcaacct attactgtca gcaaagtaat 480
gaggatccgt acacgttcgg aggggggacc aagcttgaga tcaaacgaac tgtggctgca 540
ccatcggtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt 600
gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac 660
gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc 720
tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca caaagtctac 780
gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt caacagggga 840
gagtgttagt tctagagtcg actctagagg atccccgggt accgagctcg aattc 895
<210>7
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
ccgcgaattc tggccaggtt accctgagag agtctggccc tgcgctggtg aagcccacac 60
ag 62
<210>8
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8
gcgctggtga agcccacaca gaccctcaca ctgacttgta ccttctctgg gttttcactg 60
agcacttctg gtatgggtgt 80
<210>9
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
tggattcgtc agcctcccgg gaaggctcta gagtggctgg ca 42
<210>10
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10
tgccagccac tctagagcct tcccgggagg ctgacgaatc ca 42
<210>11
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
gtcctcacaa tgaccaacat ggaccctgtg gatactgcca catactactg tgctcggata 60
aaccccgcct gg 72
<210>12
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>12
catgttggtc attgtgagga ctacctggtt tttggaggta tccttggaga t 51
<210>13
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>13
ggctgagctc acagtgacca gagtcccttg gccccag 37
<210>14
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>14
gtgtaggctg gattcgtcag cctcccg 27
<210>15
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
gacgaatcca gcctacaccc ataccagaag tgc 33
<210>16
<211>354
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>16
caggttaccc tgagagagtc tggccctgcg ctggtgaagc ccacacagac cctcacactg 60
acttgtacct tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120
cagcctcccg ggaaggctct agagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgacaagcgc 180
tataatccag ccctgaagag ccgactgaca atctccaagg atacctccaa aaaccaggta 240
gtcctcacaa tgaccaacat ggaccctgtg gatactgcca catactactg tgctcggata 300
aaccccgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtgag ctca354
<210>17
<211>1580
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>17
gctagcgttt aaacttaagc ttgttgacta gtgagatcac agttctctct acagttactg 60
agcacacagg acctcaccat gggatggagc tgtatcatcc tcttcttggt agcaacagct 120
acaggtaagg ggctcacagt agcaggcttg aggtctggac atatatatgg gtgacaatga 180
catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gttaccctga gagagtctgg 240
ccctgcgctg gtgaagccca cacagaccct cacactgact tgtaccttct ctgggttttc 300
actgagcact tctggtatgg gtgtaggctg gattcgtcag cctcccggga aggctctaga 360
gtggctggca cacatttggt gggatgatga caagcgctat aatccagccc tgaagagccg 420
actgacaatc tccaaggata cctccaaaaa ccaggtagtc ctcacaatga ccaacatgga 480
ccctgtggat actgccacat actactgtgc tcggataaac cccgcctggt ttgcttactg 540
gggccaaggg actctggtca ctgtgagctc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc 600
cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa 660
ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt 720
gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac 780
cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag 840
caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc 900
accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc 960
caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag 1020
ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc 1080
caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac 1140
cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc 1200
cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca 1260
ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg 1320
cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc 1380
ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta 1440
cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt 1500
gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa 1560
atgagtgcgg ccgcgaattc 1580
<210>18
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
actctttggc tgtgtctcta ggggagaggg ccaccatcaa ctgcaaggcc agccaaagtg 60
ttg63
<210>19
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
ctctccacag gtgtccactc cgacatcgtg atgacccaat ctccagactc tttggctgtg 60
tctcta 66
<210>20
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
ggtgagggtg aagtctgtcc cagacccact gccactaaac ctgtctggga ccccagattc 60
tagattggat g 71
<210>21
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒
<400>21
tgacagtaat aaactgccac atcctcagcc tgcaggctgc tgatggtgag ggtgaagtct 60
gtcccag67
<210>22
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒
<400>22
gcggcaagct tggtcccctg tccgaacgtg tacggatcct cattactttg ctgacagtaa 60
taaactgcca c 71
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒
<400>23
cgagctagct gagatcacag ttctctctac 30
<210>24
<211>898
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>24
cgagctagct gagatcacag ttctctctac agttactgag cacacaggac ctcaccatgg 60
gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtaagggg ctcacagtag 120
caggcttgag gtctggacat atatatgggt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc 180
acaggtgtcc actccgacat cgtgatgacc caatctccag actctttggc tgtgtctcta 240
ggggagaggg ccaccatcaa ctgcaagtcc agccaaagtg ttgattttga tggtgatagt 300
tttatgaact ggtaccaaca gaaaccagga cagccaccca aactcctcat ctatactaca 360
tccaatctag aaactggggt cccagacagg tttagtggca gtgggtctgg gacagacttc 420
accctcacca tcagcagcct gcaggctgag gatgtggcag tttattactg tcagcaaagt 480
aattcggatc cgtacacgtt cggacagggg accaagcttg agatcaaacg aactgtggct 540
gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 600
gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 660
aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 720
acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc 780
tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 840
ggagagtgtt agttctagag tcgactctag aggatccccg ggtaccgagc tcgaattc898
<210>25
<211>333
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>25
gacactgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg atagttttat gaactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctacatccaa tctagaatct 180
gggatcccag ccaggtttag tgccagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatac tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300
acgttcggag gggggaccaa gcttgagatc aaa 333
<210>26
<211>895
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>26
gctagctgag atcacagttc tctctacagt tactgagcac acaggacctc accatgggat 60
ggagctgtat catcctcttc ttggtagcaa cagctacagg taaggggctc acagtagcag 120
gcttgaggtc tggacatata tatgggtgac aatgacatcc actttgcctt tctctccaca 180
ggtgtccact ccgacactgt gctgacccaa tctccagctt ctttggctgt gtctctaggg 240
cagagggcca ccatctcctg caaggccagc caaagtgttg attttgatgg tgatagtttt 300
atgaactggt accaacagaa accaggacag ccacccaaac tcctcatcta tactacatcc 360
aatctagaat ctgggatccc agccaggttt agtgccagtg ggtctgggac agacttcacc 420
ctcaacatcc atcctgtgga ggaggaggat actgcaacct attactgtca gcaaagtaat 480
gaggatccgt acacgttcgg aggggggacc aagcttgaga tcaaacgaac tgtggctgca 540
ccatcggtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt 600
gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac 660
gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc 720
tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca caaagtctac 780
gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt caacagggga 840
gagtgttagt tctagagtcg actctagagg atccccgggt accgagctcg aattc 895
<210>27
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>27
gttggatcct ccaactgctc tgctacttct agttt 35
<210>28
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>28
gaaaagctta aagaatgatg agatggttga cact 34
<210>29
<211>210
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>29
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Lys Leu Ala Ala Ala
195 200 205
Arg Val
210
<210>30
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>30
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg
20 25 30
<210>31
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>31
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser
20 25 30
<210>32
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>32
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser
20 25 30
<210>33
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>33
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg
20 25 30
<210>34
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>34
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser
20 25 30
<210>35
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>35
Thr Ser Gly Met Gly Val Gly
1 5
<210>36
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>36
Thr Ser Gly Val Gly Val Gly
1 5
<210>37
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>37
Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10
<210>38
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>38
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10
<210>39
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>39
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>40
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>40
His Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>41
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>41
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>42
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>42
His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>43
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>43
His Ile Trp Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>44
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>44
Leu Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>45
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>45
His Ile Phe Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>46
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>46
Leu Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>47
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>47
His Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>48
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>48
Leu Ile Trp Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>49
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>49
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val Phe Leu Lys
1 5 10 15
Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln
20 25 30
<210>50
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>50
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210>51
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>51
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln
20 25 30
<210>52
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>52
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr
20 25 30
<210>53
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>53
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys
20 25 30
<210>54
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>54
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala
20 25 30
<210>55
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>55
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His
20 25 30
<210>56
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>56
Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210>57
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>57
Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His
20 25 30
<210>58
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>58
Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln
20 25 30
<210>59
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>59
Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5
<210>60
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>60
Ile Asn Pro Ala Trp Phe Asp Tyr
1 5
<210>61
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>61
Ile Asn Pro Ala Tyr Phe Ala Tyr
1 5
<210>62
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>62
Ile Asn Pro Ala Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210>63
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>63
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210>64
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>64
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210>65
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>65
Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys
20
<210>66
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>66
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210>67
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>67
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Phe Met Asn
1 5 10 15
<210>68
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>68
Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Phe Met Asn
1 5 10 15
<210>69
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>69
Lys Ser Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Phe Met Asn
1 5 10 15
<210>70
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>70
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn
1 5 10 15
<210>71
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>71
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Phe Leu Asn
1 5 10 15
<210>72
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>72
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Phe Met Ala
1 5 10 15
<210>73
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>73
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Ala
1 5 10 15
<210>74
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>74
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210>75
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>75
Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210>76
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>76
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210>77
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>77
Trp Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210>78
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>78
Thr Thr Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210>79
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>79
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210>80
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>80
Asp Ala Ser Asn Leu Ala Thr
1 5
<210>81
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>81
Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser
1 5
<210>82
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>82
Ser Thr Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210>83
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>83
Ser Thr Ser Asn Leu Gln Ser
1 5
<210>84
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>84
Thr Thr Ser Asn Leu Gln Ser
1 5
<210>85
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>85
Thr Thr Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210>86
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>86
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210>87
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>87
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210>88
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>88
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210>89
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>89
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210>90
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>90
Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210>91
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>91
Gln Gln Ser Asn Ser Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210>92
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>92
Gln Gln Ser Asn Glu Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210>93
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>93
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210>94
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>94
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210>95
<211>528
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>95
cgagctagct gagatcacag ttctctctac agttactgag cacacaggac ctcaccatgg 60
gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtaagggg ctcacagtag 120
caggcttgag gtctggacat atatatgggt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc 180
acaggtgtcc actccgacat cgtgatgacc caatctccag actctttggc tgtgtctcta 240
ggggagaggg ccaccatcaa ctgcaaggcc agccaaagtg ttgattttga tggtgatagt 300
tttatgaact ggtaccaaca gaaaccagga cagccaccca aactcctcat ctatactaca 360
tccaatctag aatctggggt cccagacagg tttagtggca gtgggtctgg gacagacttc 420
accctcacca tcagcagcct gcaggctgag gatgtggcag tttattactg tcagcaaagt 480
aatgaggatc cgtacacgtt cggacagggg accaagcttg agatcaaa 528
<210>96
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>96
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210>97
<211>897
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>97
cgagctagct gagatcacag ttctctctac agttactgag cacacaggac ctcaccatgg 60
gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtaagggg ctcacagtag 120
caggcttgag gtctggacat atatatgggt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc 180
acaggtgtcc actccgacat cgtgatgacc caatctccag actctttggc tgtgtctcta 240
ggggagaggg ccaccatcaa ctgcaaggcc agccaaagtg ttgattttga tggtgatagt 300
tttatgaact ggtaccaaca gaaaccagga cagccaccca aactcctcat ctatactaca 360
tccaatctag aatctggggt cccagacagg tttagtggca gtgggtctgg gacagacttc 420
accctcacca tcagcagcct gcaggctgag gatgtggcag tttattactg tcagcaaagt 480
aatgaggatc cgtacacgtt cggacagggg accaagcttg agatcaaacg aactgtggct 540
gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 600
gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 660
aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 720
acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc 780
tacgctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg 840
gagagtgtta gttctagagt cgactctaga ggatccccgg gtaccgagct cgaattc 897
<210>98
<211>218
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>98
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210>99
<211>528
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>99
cgagctagct gagatcacag ttctctctac agttactgag cacacaggac ctcaccatgg 60
gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtaagggg ctcacagtag 120
caggcttgag gtctggacat atatatgggt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc 180
acaggtgtcc actccgacat cgtgatgacc caatctccag actctttggc tgtgtctcta 240
ggggagaggg ccaccatcaa ctgcaagtcc agccaaagtg ttgattttga tggtgatagt 300
tttatgaact ggtaccaaca gaaaccagga cagccaccca aactcctcat ctatactaca 360
tccagtctag aatctggggt cccagacagg tttagtggca gtgggtctgg gacagacttc 420
accctcacca tcagcagcct gcaggctgag gatgtggcag tttattactg tcagcaaagt 480
aattcggatc cgtacacgtt cggacagggg accaagcttg agatcaaa 528
<210>100
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>100
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Ser Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210>101
<211>898
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>101
cgagctagct gagatcacag ttctctctac agttactgag cacacaggac ctcaccatgg 60
gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtaagggg ctcacagtag 120
caggcttgag gtctggacat atatatgggt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc 180
acaggtgtcc actccgacat cgtgatgacc caatctccag actctttggc tgtgtctcta 240
ggggagaggg ccaccatcaa ctgcaagtcc agccaaagtg ttgattttga tggtgatagt 300
tttatgaact ggtaccaaca gaaaccagga cagccaccca aactcctcat ctatactaca 360
tccagtctag aatctggggt cccagacagg tttagtggca gtgggtctgg gacagacttc 420
accctcacca tcagcagcct gcaggctgag gatgtggcag tttattactg tcagcaaagt 480
aattcggatc cgtacacgtt cggacagggg accaagcttg agatcaaacg aactgtggct 540
gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 600
gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 660
aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 720
acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc 780
tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 840
ggagagtgtt agttctagag tcgactctag aggatccccg ggtaccgagc tcgaattc898
<210>102
<211>218
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>102
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Ser Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210>103
<211>571
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>103
gctagcgttt aaacttaagc ttgttgacta gtgagatcac agttctctct acagttactg 60
agcacacagg acctcaccat gggatggagc tgtatcatcc tcttcttggt agcaacagct 120
acaggtaagg ggctcacagt agcaggcttg aggtctggac atatatatgg gtgacaatga 180
catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gttaccctga gagagtctgg 240
ccctgcgctg gtgaagccca cacagaccct cacactgact tgtaccttct ctgggttttc 300
actgagcact tctggtatgg gtgtaggctg gattcgtcag cctcccggga aggctctaga 360
gtggctggca cacatttggt gggatgatga caagcgctat aatccagccc tgaagagccg 420
actgacaatc tccaaggata cctccaaaaa ccaggtagtc ctcacaatga ccaacatgga 480
ccctgtggat actgccacat actactgtgc tcggataaac cccgcctggt ttgcttactg 540
gggccaaggg actctggtca ctgtgagctc a 571
<210>104
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>104
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>105
<211>1580
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>105
gctagcgttt aaacttaagc ttgttgacta gtgagatcac agttctctct acagttactg 60
agcacacagg acctcaccat gggatggagc tgtatcatcc tcttcttggt agcaacagct 120
acaggtaagg ggctcacagt agcaggcttg aggtctggac atatatatgg gtgacaatga 180
catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gttaccctga gagagtctgg 240
ccctgcgctg gtgaagccca cacagaccct cacactgact tgtaccttct ctgggttttc 300
actgagcact tctggtatgg gtgtaggctg gattcgtcag cctcccggga aggctctaga 360
gtggctggca cacatttggt gggatgatga caagcgctat aatccagccc tgaagagccg 420
actgacaatc tccaaggata cctccaaaaa ccaggtagtc ctcacaatga ccaacatgga 480
ccctgtggat actgccacat actactgtgc tcggataaac cccgcctggt ttgcttactg 540
gggccaaggg actctggtca ctgtgagctc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc 600
cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa 660
ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt 720
gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac 780
cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag 840
caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc 900
accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc 960
caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag 1020
ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc 1080
caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac 1140
cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc 1200
cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca 1260
ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg 1320
cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc 1380
ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta 1440
cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt 1500
gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa 1560
atgagtgcgg ccgcgaattc 1580
<210>106
<211>528
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>106
cgagctagct gagatcacag ttctctctac agttactgag cacacaggac ctcaccatgg 60
gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtaagggg ctcacagtag 120
caggcttgag gtctggacat atatatgggt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc 180
acaggtgtcc actccgacat cgtgatgacc caatctccag actctttggc tgtgtctcta 240
ggggagaggg ccaccatcaa ctgcaagtcc agccaaagtg ttgattttga tggtgatagt 300
tttatgaact ggtaccaaca gaaaccagga cagccaccca aactcctcat ctatactaca 360
tccaatctag aaactggggt cccagacagg tttagtggca gtgggtctgg gacagacttc 420
accctcacca tcagcagcct gcaggctgag gatgtggcag tttattactg tcagcaaagt 480
aattcggatc cgtacacgtt cggacagggg accaagcttg agatcaaa 528
<210>107
<211>448
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>107
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210>108
<211>571
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>108
gctagcgttt aaacttaagc ttgttgacta gtgagatcac agttctctct acagttactg 60
agcacacagg acctcaccat gggatggagc tgtatcatcc tcttcttggt agcaacagct 120
acaggtaagg ggctcacagt agcaggcttg aggtctggac atatatatgg gtgacaatga 180
catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gttaccctga gagagtctgg 240
ccctgcgctg gtgaagccca cacagaccct cacactgact tgtaccttct ctgggttttc 300
actgagcact tctggtatgg gtgtaggctg gattcgtcag cctcccggga aggctctaga 360
gtggctggca cacatttggt gggatgatga caagcgctat aatccagccc tgaagagccg 420
actgacaatc tccaaggata cctccaaaaa ccaggtagtc ctcacaatga ccaacatgga 480
ccctgtggat actgccacat actactgtgc tcaaataaac cccgcctggt ttgcttactg 540
gggccaaggg actctggtca ctgtgagctc a 571
<210>109
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>109
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>110
<211>1580
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>110
gctagcgttt aaacttaagc ttgttgacta gtgagatcac agttctctct acagttactg 60
agcacacagg acctcaccat gggatggagc tgtatcatcc tcttcttggt agcaacagct 120
acaggtaagg ggctcacagt agcaggcttg aggtctggac atatatatgg gtgacaatga 180
catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gttaccctga gagagtctgg 240
ccctgcgctg gtgaagccca cacagaccct cacactgact tgtaccttct ctgggttttc 300
actgagcact tctggtatgg gtgtaggctg gattcgtcag cctcccggga aggctctaga 360
gtggctggca cacatttggt gggatgatga caagcgctat aatccagccc tgaagagccg 420
actgacaatc tccaaggata cctccaaaaa ccaggtagtc ctcacaatga ccaacatgga 480
ccctgtggat actgccacat actactgtgc tcaaataaac cccgcctggt ttgcttactg 540
gggccaaggg actctggtca ctgtgagctc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc 600
cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa 660
ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt 720
gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac 780
cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag 840
caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc 900
accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc 960
caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag 1020
ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc 1080
caagacaaag ccgcgggagg agcagtacca gagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac 1140
cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc 1200
cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca 1260
ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg 1320
cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc 1380
ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta 1440
cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt 1500
gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa 1560
atgagtgcgg ccgcgaattc 1580
<210>111
<211>448
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>111
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210>112
<211>571
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>112
gctagcgttt aaacttaagc ttgttgacta gtgagatcac agttctctct acagttactg 60
agcacacagg acctcaccat gggatggagc tgtatcatcc tcttcttggt agcaacagct 120
acaggtaagg ggctcacagt agcaggcttg aggtctggac atatatatgg gtgacaatga 180
catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gttaccctga gagagtctgg 240
ccctgcgctg gtgaagccca cacagaccct cacactgact tgtaccttct ctgggttttc 300
actgagcact tctggtgtgg gtgtaggctg gattcgtcag cctcccggga aggctctaga 360
gtggctggca cacatttggt gggatgatga caagcgctat tctccatccc tgaagagccg 420
actgacaatc tccaaggata cctccaaaaa ccaggtagtc ctcacaatga ccaacatgga 480
ccctgtggat actgccacat actactgtgc tcggataaac cccgcctact ttgcttactg 540
gggccaaggg actctggtca ctgtgagctc a 571
<210>113
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>113
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asn Pro Ala Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser
115
<210>114
<211>1580
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>114
gctagcgttt aaacttaagc ttgttgacta gtgagatcac agttctctct acagttactg 60
agcacacagg acctcaccat gggatggagc tgtatcatcc tcttcttggt agcaacagct 120
acaggtaagg ggctcacagt agcaggcttg aggtctggac atatatatgg gtgacaatga 180
catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gttaccctga gagagtctgg 240
ccctgcgctg gtgaagccca cacagaccct cacactgact tgtaccttct ctgggttttc 300
actgagcact tctggtgtgg gtgtaggctg gattcgtcag cctcccggga aggctctaga 360
gtggctggca cacatttggt gggatgatga caagcgctat tctccatccc tgaagagccg 420
actgacaatc tccaaggata cctccaaaaa ccaggtagtc ctcacaatga ccaacatgga 480
ccctgtggat actgccacat actactgtgc tcggataaac cccgcctact ttgcttactg 540
gggccaaggg actctggtca ctgtgagctc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc 600
cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa 660
ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt 720
gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac 780
cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag 840
caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc 900
accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc 960
caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag 1020
ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc 1080
caagacaaag ccgcgggagg agcagtacca gagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac 1140
cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc 1200
cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca 1260
ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg 1320
cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc 1380
ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta 1440
cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt 1500
gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa 1560
atgagtgcgg ccgcgaattc 1580
<210>115
<211>448
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>115
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asn Pro Ala Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210>116
<211>254
<212>PRT
<213>人(Homo Sapien)
<400>116
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245 250
<210>117
<211>254
<212>PRT
<213>人(Homo Sapien)
<400>117
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245 250
<210>118
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>118
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Ser Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210>119
<211>218
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>119
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Ser Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210>120
<211>448
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>120
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 44权利要求
1.一种包含这样的VH结构域和VL结构域的抗CD16A抗体，该VH结构域包含源自小鼠3G8抗体重链的互补决定区(CDR)，该VL结构域包含源自小鼠3G8抗体轻链的CDR，其中至少一种所述CDR与相应的小鼠CDR在至少一个选自以下的位置有差别VH结构域中，CDR1中位置34处的Val、CDR2中位置50处的Leu、CDR2中位置52处的Phe、CDR2中位置54处的Asn、CDR2中位置60处的Ser、CDR2中位置62处的Ser、CDR3中位置99处的Tyr和CDR3中位置101处的Asp，VL结构域中，CDR1中位置24处的Arg；CDR1中位置25处的Ser；CDR1中位置32处的Tyr；CDR1中位置33处的Leu；CDR1中位置34处的Ala；CDR2中位置50处的Asp、Trp或Ser；CDR2中位置51处的Ala；CDR2中位置53处的Ser；CDR2中位置55处的Ala或Gln；CDR2中位置56处的Thr；CDR3中位置92处的Tyr；CDR3中位置93处的Ser和CDR3中位置94处的Thr。
2.权利要求1的抗体，所述抗体其Fc区缺乏效应子功能或效应子功能减低。
3.权利要求2的抗体，所述抗体包含源自人IgG1的Fc区。
4.权利要求3的抗体，其中对应于Fc区的残基297的氨基酸不是天冬酰胺。
5.权利要求2的抗体，所述抗体是单链抗体。
6.权利要求1的抗体，所述抗体是四聚抗体。
7.权利要求6的抗体，所述抗体包含具有Hu3G8VH-22的VH结构域的序列的VH结构域。
8.权利要求7的抗体，所述抗体包含具有Hu3G8VL-I或Hu3G8VL-43的VL序列的VL结构域。
9.权利要求1的抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO113序列的重链可变区和具有SEQ ID NO96、100或118序列的轻链可变区。
10.一种人源化抗CD16A抗体，所述抗体缺乏效应子功能或效应子功能减低，且包含小鼠抗体3G8的所有六个互补决定区。
11.权利要求10的抗体，所述抗体所包含的VH结构域包含具有SEQ ID NO51序列的FR3结构域。
12.权利要求10的抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO109或104序列的重链可变区和具有SEQ ID NO96序列的轻链可变区。
13.一种减少哺乳动物中的有害免疫应答的方法，所述方法包括给予哺乳动物权利要求2或10的抗体。
14.一种治疗哺乳动物中的有害免疫应答而又不在哺乳动物中引起严重嗜中性白细胞减少、任选而又不在哺乳动物中引起中度嗜中性白细胞减少的方法，其中所述方法包括给予哺乳动物权利要求2或10的抗体。
15.权利要求14的方法，其中所述有害免疫应答是由自身免疫疾病引起的炎性反应。
16.权利要求15的方法，其中治疗有害免疫应答包括抵抗抗体介导的血小板损耗。
17.一种在需要减少有害免疫应答的哺乳动物中减少该应答的方法，所述方法包括给予哺乳动物包含源自人IgG重链的Fc区的CD16A结合蛋白，其中所述Fc区缺乏效应子功能或被修饰以减少与Fc受体的结合。
18.权利要求17的方法，其中所述CD16A结合蛋白是人源化单克隆抗体。
19.权利要求18的方法，其中所述抗体包含源自人IgG1的Fc区。
20.权利要求19的方法，其中所述Fc区的位置297处的氨基酸残基不被糖基化。
21.权利要求20的方法，其中所述Fc区的位置297处的氨基酸残基不是天冬酰胺。
22.权利要求18的方法，其中所述抗体是人源化形式的3G8抗体。
23.权利要求18的方法，其中所述抗体抑制3G8抗体对CD16A的结合。
24.权利要求18的方法，其中所述抗体包含这样的VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含源自小鼠3G8抗体重链的互补决定区(CDR)，该VL结构域包含源自小鼠3G8抗体轻链的CDR，其中至少一种所述CDR与相应的小鼠CDR在至少一个选自以下的位置有差别VH结构域中，CDR1中位置34处的Val、CDR2中位置50处的Leu、CDR2中位置52处的Phe、CDR2中位置54处的Asn、CDR2中位置60处的Ser、CDR2中位置62处的Ser、CDR3中位置99处的Tyr和CDR3中位置101处的Asp，VL结构域中，CDR1中位置24处的Arg；CDR1中位置25处的Ser；CDR1中位置32处的Tyr；CDR1中位置33处的Leu；CDR1中位置34处的Ala；CDR2中位置50处的Asp、Trp或Ser；CDR2中位置51处的Ala；CDR2中位置53处的Ser；CDR2中位置55处的Ala或Gln；CDR2中位置56处的Thr；CDR3中位置92处的Tyr；CDR3中位置93处的Ser和CDR3中位置94处的Thr。
25.权利要求18的方法，其中所述抗体包含具有Hu3G8VH-22的VH结构域的序列的VH结构域。
26.权利要求18的方法，其中所述抗体包含具有Hu3G8VL-1或Hu3G8VL-43的VL结构域的序列的VL结构域。
27.权利要求25的方法，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO113序列的重链可变区和具有SEQ ID NO96、100或118序列的轻链可变区。
28.权利要求18的方法，其中所述抗体所包含的VH结构域包含具有SEQ ID NO51序列的FR3结构域。
29.权利要求18的方法，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO109序列的重链可变区和具有SEQ ID NO96序列的轻链可变区。
30.权利要求18的方法，其中所述有害免疫应答是由自身免疫疾病引起的炎性反应。
31.权利要求18的方法，其中所述有害免疫应答是特发性血小板减少性紫癜或自身免疫性溶血性贫血。
32.一种减少哺乳动物中的有害免疫应答的方法，所述方法包括给予哺乳动物有效量的能通过与抗CD16A抗体的VL和/或VH结构域的相互作用特异性结合CD16A的抗CD16A抗体，其中所述抗CD16A抗体缺乏效应子功能或效应子功能减低。
33.权利要求32的方法，其中所述抗CD16A抗体包含一个或多个氨基酸修饰，使得与Fc受体的结合被减少。
34.权利要求32的方法，其中所述抗CD16A抗体包含这样的VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含源自小鼠3G8抗体重链的互补决定区(CDR)，该VL结构域包含源自小鼠3G8抗体轻链的CDR，其中所述抗体缺乏具有效应子功能的Fc区。
35.权利要求32的方法，其中所述抗CD16A抗体包含这样的VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含源自小鼠3G8抗体重链的互补决定区(CDR)，该VL结构域包含源自小鼠3G8抗体轻链的CDR，其中所述抗体在Fc区中包含一个或多个氨基酸修饰，使得与Fc受体的结合被减少。
36.权利要求32或35的方法，其中所述抗CD16A抗体包含源自人IgG1的Fc区，其中对应于所述Fc区的CH2结构域的位置297的氨基酸不是天冬酰胺。
37.权利要求32或35的方法，其中所述抗CD16A抗体包含源自人IgG1的Fc区，其中对应于所述Fc区的CH2结构域的位置297的氨基酸不被糖基化。
38.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体以大约0.1-30.0mg/kg哺乳动物体重的剂量给予。
39.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体以大约0.1-20.0mg/kg哺乳动物体重的剂量给予。
40.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体以大约0.1-10.0mg/kg哺乳动物体重的剂量给予。
41.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体以大约0.1-5.0mg/kg哺乳动物体重的剂量给予。
42.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体以大约0.1-3.0mg/kg哺乳动物体重的剂量给予。
43.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体以大约1.0-30.0mg/kg哺乳动物体重的剂量给予。
44.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体以大约1.0-20.0mg/kg哺乳动物体重的剂量给予。
45.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体以大约1.0-10.0mg/kg哺乳动物体重的剂量给予。
46.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体以大约1.0-5.0mg/kg哺乳动物体重的剂量给予。
47.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体以大约1.0-3.0mg/kg哺乳动物体重的剂量给予。
48.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体以大约5.0-30.0mg/kg哺乳动物体重的剂量给予。
49.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体以大约5.0-20.0mg/kg哺乳动物体重的剂量给予。
50.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体以大约0.1mg/kg哺乳动物体重的剂量给予。
51.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体以大约0.3mg/kg哺乳动物体重的剂量给予。
52.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体以大约1.0mg/kg哺乳动物体重的剂量给予。
53.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体以大约3.0mg/kg哺乳动物体重的剂量给予。
54.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体每天给予至少一次。
55.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体在至少10天时间里每天给予至少一次。
56.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体的给予为每周一次、每周两次、每两周一次、每月一次、每六周一次、每两月一次、每年两次或每年一次。
57.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体以局部、口服、静脉内、皮肤内或皮下方式给予哺乳动物。
58.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体在至少一小时时间里静脉内给予哺乳动物。
59.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体在至少30分钟时间里静脉内给予哺乳动物。
60.权利要求32-35任一项的方法，其中所述抗CD16A抗体在至少15分钟时间里静脉内给予哺乳动物。
61.一种抗体，所述抗体与权利要求2或10的抗体竞争结合，或者和权利要求2或10的抗体一样结合相同的表位。
62.一种CD16A结合蛋白，所述结合蛋白包含的氨基酸序列与权利要求4的抗体的氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性。
63.一种减少患者中的首剂副作用的方法，所述方法包括给予有效量的能通过与抗CD16A抗体的VL和/或VH结构域的相互作用特异性结合CD16A的抗CD16A抗体，其中所述抗体通过减少或消除其Fc区与一种或多种FcγR的结合来减少或消除至少一种与首剂副作用有关的症状。
64.一种减少患者中的首剂副作用的方法，所述方法包括给予有效量的包含这样的VH结构域和VL结构域的抗CD16A抗体，该VH结构域包含源自小鼠3G8抗体重链的互补决定区(CDR)，该VL结构域包含源自小鼠3G8抗体轻链的CDR，其中所述抗体通过减少或消除其Fc区与一种或多种FcγR的结合来减少或消除至少一种与首剂副作用有关的症状。
65.权利要求63或64的方法，其中所述抗CD16A抗体包含源自人IgG1的Fc区，其中对应于所述Fc区的CH2结构域的位置297的氨基酸不是天冬酰胺。
66.权利要求63或64的方法，其中所述抗CD16A抗体包含源自人IgG1的Fc区，其中对应于所述Fc区的CH2结构域的位置297的氨基酸不被糖基化。
67.权利要求63的方法，其中所述抗CD16A抗体包括源自人IgG1的Fc区，其中对应于所述Fc区的CH2结构域的位置297的氨基酸不被糖基化，且其中所述抗CD16A抗体与权利要求65的抗CD16A抗体竞争结合，或者和权利要求65的抗CD16A抗体一样结合相同的表位。
68.权利要求63或64的方法，其中所述抗CD16A抗体在Fc区中包含一种或多个氨基酸修饰。
69.权利要求68的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包括在所述Fc区的CH2结构域或铰链区中的修饰。
70.权利要求68的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包括在位置234、235或者同时在这两个位置的突变。
71.权利要求68的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包括位置233处的氨基酸被脯氨酸置换；或者位置238处的氨基酸被精氨酸置换；或者位置265处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置265处的氨基酸被谷氨酸置换；或者位置270处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置270处的氨基酸被天冬酰胺置换；或者位置297处的氨基酸被丙氨酸或谷氨酰胺置换；或者位置298处的氨基酸被脯氨酸或天冬酰胺置换；或者位置299处的氨基酸被除丝氨酸或苏氨酸以外的任何氨基酸置换；或者位置265处的氨基酸被丙氨酸置换和位置297处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置265处的氨基酸被丙氨酸置换和位置297处的氨基酸被谷氨酰胺置换；或者位置265处的氨基酸被谷氨酸置换和位置297处的氨基酸被丙氨酸置换；或者位置265处的氨基酸被谷氨酸置换和位置297处的氨基酸被谷氨酰胺置换。
72.权利要求63或64的方法，其中所述首剂副作用是细胞因子释放综合征。
73.权利要求30的方法，其中所述有害免疫应答是由类风湿性关节炎(RA)引起的炎性反应。
74.权利要求30的方法，其中所述有害免疫应答是由系统性红斑狼疮(SLE)引起的炎性反应。
75.权利要求32的方法，其中所述有害免疫应答是由系统性红斑狼疮(SLE)引起的炎性反应。
76.权利要求32的方法，其中所述有害免疫应答是由特发性血小板减少性紫癜(ITP)引起的炎性反应。
77.权利要求32的方法，其中所述有害免疫应答是由类风湿性关节炎(RA)引起的炎性反应。
78.一种在需要减少有害免疫应答的哺乳动物中减少该应答的方法，所述方法包括给予哺乳动物包含源自人IgG重链的Fc区的CD16A结合蛋白，其中所述Fc区其效应子功能减低或者所述Fc区被修饰以减少与Fc受体的结合。
79.一种能通过与抗CD16A抗体的VL和/或VH结构域的相互作用特异性结合CD16A的抗CD16A抗体，其中所述抗体其效应子功能减低。
80.一种能通过与抗CD16A抗体的VL和/或VH结构域的相互作用特异性结合CD16A的抗CD16A抗体，其中所述抗体通过减少或消除抗体的Fc区与至少一种补体相关受体的结合来减少至少一种与首剂副作用有关的症状。
全文摘要
本发明描述了可用于减少有害免疫应答的CD16A结合蛋白。在一个方面，用任选缺乏效应子功能的人源化抗CD16A抗体治疗免疫疾病如特发性血小板减少性紫癜和自身免疫性溶血性贫血。
文档编号C07K16/00GK101627054SQ200680033093
公开日2010年1月13日 申请日期2006年7月11日 优先权日2005年7月11日
发明者N·图埃伦, L·S·约翰逊, E·邦维尼, K·E·斯泰因 申请人:马克罗基因公司