专利名称：：肽-免疫球蛋白缀合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及肽-免疫球蛋白缀合物(peptide-immunoglobulin曙conjugate)，其中两个或者两个以上的肽净皮分别缀合到免疫球蛋白的轻链或重链的一个末端。这些肽在氨基酸水平上可以是不同的、相似的或者相同的。与肽缀合的免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白(notfunctionableimmunoglobulin)。
背景技术：
：人免疫缺陷病毒(HIV)对细胞的感染通过病毒膜与将被感染的细胞的细胞膜融合的过程而实现。对于此过程提出了一个一般性的模式病毒包膜糖蛋白复合物(gpl加/gp41)与位于将被感染的细胞的细胞膜上的细胞表面受体相互作用。gpl20与例如CD4受体以及诸如CCR-5或CXCR-4的共受体相结合，引起gpl20/gp41复合物的构象的改变。这种构象改变的结果是gp41蛋白能够插入到靶细胞的膜中。这种插入是膜融合过程的开始。已知由于天然发生的多态性，不同HIV林之间的gp41蛋白的^J^酸序列不同。但是可以识别出相同的结构域构造，确切地，从N端到C端的方向为融合信号、两个七肽重复序列结构域(HR1，HR2)和跨膜结构域。据称该融合(fusion或fusogenic)结构域参与了插入细胞膜和细胞膜的解体。该HR区由多段包括7个氨基酸(七肽)的序列构成(例如参见Shu，W"etal"Biochemistry38(1999)5378-5385)。除了七肽，还有一个或多个类亮氨酸拉链基序。这个组成解释了gp41蛋白以及同样地衍生自这些结构域的肽的巻曲螺旋结构的形成。巻曲螺旋通常是由两个或两个以上相互作用的螺旋组成的寡聚物。具有自gp41的HR1或HR2结构域推导的^酸序列的肽在体外和体内是细胞摄取HIV的有效抑制剂(例如参见如US5，464，933、US5,656,480、US6,258,782、US6,348,568或US6,656,906中所述的肽)。例如，T20(也称为DP178，Fuzeon,—种HR2肽)和T651(US6,479,055)是非常有效的HIV感染的抑制剂。采用例如氨基酸替代或化学交联的方法，已经尝试增强HR2衍生肽的效力(Sia，S.K.等，PNASUSA99(2002)14664-14669;Otaka，A.等Angew.Chem.Int.Ed.41(2002)2937-2940)。肽缀合到某些分子上可以改变其药物代谢动力学性质，例如可以提高这种肽缀合物的血清半衰期。报道的缀合物例如为PEG化的白细胞介素6(EP0442724)、PEG化的促红细胞生成素(WO01/02017)、包含内皮抑制素和免疫球蛋白的嵌合分子(US2005/008649)、基于分泌抗体的融合蛋白(US2002/147311)、包含白蛋白的融合多肽(US2005/0100991、Ajk清白蛋白US5,876,969)、PEG化的多肽(US2005/0114037)和干扰素融合物。这些方法的目的是融合例如多肽和免疫球蛋白以便组合免疫球蛋白的抗原决定特性和多肽的生物活性。因此缀合物的免疫球蛋白部分展示靼向功能，并且多肽部分提供生物活性。例如已经报道包括白树毒素和抗体的免疫毒素(WO94/26910)、修饰的转铁蛋白-抗体融合蛋白(US2003/0226155)、抗体-细胞因子融合蛋白(US2003/0049227)和由具有免疫刺激的、膜转运的或同嗜性的活性的肽和抗体组成的融合蛋白(US2003/0103984)。在WO2004/085505中报道了由化学连接到大分子上的生物活性化合物组成的长效的生物活性缀合物。
发明内容本发明的目的是提供肽-免疫球蛋白缀合物，其中多于一个的肽缀合到所述的免疫球蛋白上。本发明包括肽-免疫球蛋白缀合物，其中该免疫球蛋白由两个重链或两个重链和两个轻链组成，其中该免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白，其中通过肽键将免疫球蛋白链的g末端氨基酸缀合到肽的氨基末端氨基酸上，或者将肽的泉基末端氨基酸缀合到免疫球蛋白链的氨基末端氮基酸上，并且其中该缀合物具有下述的通式免疫球蛋白-[肽n其中n是从2至8的整数。在一个实施方案中，该肽是生物活性肽。i在另一个实施方案中，该肽由肽接头和生物活性肽组成。在一个实施方案中，,合物的肽的氨基酸序列彼此间具有90%或者更高的同一性。在另外一个实施方案中，该免疫球蛋白或者是G类免疫球蛋白(IgG)或者是E类免疫球蛋白(IgE)。在另一个实施方案中，该生物活性多肽是抗融合(antifusogenic)肽。在再一实施方案中，该非功能性的免疫球蛋白是以l(T5mo1/1或者更高的Ko值结合人抗原的免疫球蛋白。在再一实施方案中，该非功能性的免疫球蛋白是如下的免疫球蛋白a)其重链和/或轻链缺少一个或者多个构架区或/和高变区的部分或者全部，或者b)其重链和/或轻链无可变区，或者c)其对人抗原具有l(T5mo1/1或者更高的结合亲和性，或者d)其对人抗原具有10-5mo1/1或者更高的结合亲和性，并且对非人类抗原具有1(T"mol/l或者更低的结合亲和性。本发明进一步包括用于制备本发明的缀合物的方法，由此该方法包括在适于表达该缀合物的条件下培养含有包含一个或者多个编码本发明的缀合物的核酸分子的一种或者多种表达载体的细胞，以及从细胞或者培养基中回收该缀合物。本发明还包括含有本发明的缀合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物。本发明进一步包括本发明的缀合物在制备用于治疗病毒感染的药物中的用途。在一个实施方案中，该病毒感染是HIV感染。本发明还包括使用本发明的缀合物治疗需要抗病毒治疗的患者的方法。发明详述本发明包括肽-免疫球蛋白缀合物，其中该免疫球蛋白由两个重链或者两个重链和两个轻链组成，其中该免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白，其中肽键将免疫球蛋白链的羧基末端氨基酸缀合到肽的氨基末端氨基酸上，或者将肽的氛基末端氨基酸缀合到免疫球蛋白链的氨基末端氨基酸上，并且其中该缀合物具有下逸的通式，其中该[肽]部分在此通式中的位置不表示该肽连接到免疫球蛋白上的缀合位置，即，M酸位置，免疫球蛋白-[肽n其中n是从2至8的整数。在本发明的范围中，一些使用的术语具有如下定义"基因"指表达肽、多肽或者蛋白质所必需的，例如在染色体上或者在质粒上的片段。除编码区之外，基因还含有其他功能性元件，包括启动子、内含子和终止子。"结构基因"指不带信号序列的基因编码区。"抗融合肽"是抑制与膜融合相关的事件或者膜融合事件本身的肽，包括例如，抑制由膜融合导致的、病毒对未感染细胞的感染。这些抗融合肽优选是线性肽。例如，其可以衍生自gp41的胞外域，例如，DP107或DP178。这些肽的实例可以见于US5,464,933、US5，656，480、US6,013,263、US6,017,536、US6，020，459、US6,093,794、US6,060,065、US6,258,782、US6,348,568、US6,479,055、US6，656，卯6、WO1996/19495、WO1996/40191、WO1999/59615、WO2000/69卯2和WO2005/067960。例如，这些肽的氨基酸序列包含或者可以选择自US5,464,933的SEQIDNO:1至10;US5,656,480的SEQIDNO:1至15;US6,013,263的SEQIDNO:1至10和16至83的群体；US6，017，536的SEQIDNO:1至10，20至83和139至149;US6,093,794的SEQIDNO:1至10,17至83和210至214;US6,060,065的SEQIDNO:1至10，16至83和210至211;US6,258,782的SEQIDNO:1286和1310;US6,348,568的SEQIDNO:1129，1278-1309，1311和1433;US6,479,055的SEQIDNO:1至10和210至238;US6,656,906的SEQIDNO:1至171，173至216，218至219，222至228，231，233至366，372至398，400至456，458至498,500至570，572至620，622至651，653至736，739至785，787至811，813至815，816至823，825，827至863，865至875，877至883，885，887至8卯，892至981，986至999,1001至1003，1006至1018，1022至1024，1026至1028，1030至1032，1037至1076，1078至1079，1082至1117，1120至1176,1179至1213，1218至1223,1227至1237，1244至1245，1256至1268，1271至1275，1277，1345至1348，1350至1362，1364，1366，1368，1370，1372，1374至1376，1378至1379，1381至1385，1412至1417,1421至1426，1428至1430，1432，1439至1542，1670至1682,1684至1709,1712至1719，1721至1753,1755至1757，或者WO2005/067960的SEQIDNO:5至95。抗融合肽具有由5至100个氨基酸，优选地10至75个氨基酸，并且更优选地15至50个M酸组成的M酸序列。本文4吏用的术语"生物活性分子"指有机分子，例如诸如肽、蛋白、核蛋白、粘蛋白、脂蛋白、合成的多肽或者蛋白质的生物大分子，当施用于人工生物系统诸如使用细胞系和病毒的生物试验中时，或者当体内给予动物包括但不限于鸟类和包括人类在内的哺乳动物时，生物活性分子引起生物效应。该生物效应可以是，但不限于酶的抑制、激活或者别构修饰、受体的结合(在结合位点或者在周围)、受体的阻断或激活或者信号的触发。"表达载体"是编码待在宿主细胞中表达的蛋白质的核酸分子。典型地，表达栽体包括原核质粒扩增单位，例如对于大肠杆菌，包括复制起点，以及选择标记、真核选择标记，以及一个或多个用于表达目的基因的表达盒，每个表达盒包括启动子、结构基因和转录终止子，包括多聚腺苷酸化信号。基因表达通常被置于启动子的控制下，并且这样的核酸被称为"可操作地连接"(operablylinked)在启动子上。相似地，如果调控元件调节核心启动子的活性，则该调控元件与核心启动子可操作地连接。"多顺反子转录单位"是其中有多于一个的结构基因处于相同的启动子控制下的转录单位。"分离的肽"是基本上没有污染性细胞组分的多肽，该细胞组分例如是碳水化合物、脂类或者天然与该及bf目关的其他的蛋白质杂质。典型地，分离的肽的制品含有高度纯化形式的肽，即至少大约80%的纯度，至少大约90%的纯度，至少大约95%的纯度，大于95%的纯度或者大于99%的纯度。一种证实某蛋白制品含有分离的肽的方法是在该蛋白制品经过十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色凝胶后出现单一的条带。然而，术语"分离的"不排除存在相同肽的可选物理形式诸如二聚体或者糖基化或者衍生化的形式。如本文使用的，术语"免疫球蛋白"指由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质和其衍生物或者片段。组成免疫球蛋白的不同的多肽基于其重量被称为轻链和重链。公认的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以以多种形式存在。每个重链和轻链都包含可变结构域(区)(通常是该多肽链的M端部分)。免疫球蛋白的轻链或者重链的可变结构域包含不同的片段，即4个构架区(FR)和三个高变区(CDR)。每个重链和轻链多肽链都包括恒定区(通常为该多肽链的羧基端部分)。重链的恒定结构域/区介导抗体结合至i)携带Fc-y受体(FcYR)的细胞，例如吞噬细胞，或者ii)携带新生儿Fc受体(FcRn)，也称为Brambell受体的细胞。其还介导与一些因子，包括诸如组分(Clq)的经典补体系统的因子，的结合。根据本发明的免疫球蛋:白包括至少两个重链多肽。任选地，两个轻链多肽可以存在。根据本发明的免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白。本发明中使用的术语"非功能性的免疫球蛋白"指以如下KD值结合人抗原的免疫球蛋白，所述KD值(结合亲和性)为l(T5mol/1或者更高(例如1(T311101/1)，优选KD值为10"mol/1或者更高。用诸如表面等离子体共振技术(Biacore)等标准的结合试验可以测定结合亲和性。不必将此结合亲和性看作一个确切的值，其仅仅是一个参考点。其用于确定和/或选择对人耙标/抗原显示出不具有免疫球蛋白典型的特异性靶结合并且因此无人类治疗活性的免疫球蛋白，即例如，非功能性的免疫球蛋白是不发生序列特异性抗原/表位结合的免疫球蛋白。同时，例如基于离子相互作用的非特异性相互作用，完全可能存在。这不排除该免疫球蛋白显示出对非人类靼标/抗原的特异性耙结合。此非人抗原的特异耙结合与10-7mol/1或更低的(例如1(T1Gmol/1)KD值相关，优选与10—8mol/1或更低的KD值相关。用于本申请的术语"接头"或者"肽接头"指天然和/或合成来源的肽接头。其由线性M酸链构成，其中20种天然存在的M酸是单体构件。该链具有1至50个氨基酸的长度，优选介于3和25个氨基酸之间的长度。接头可以包含重复的氨基酸序列或者天然多肽的序列，例如具有铰链功能的多肽。接头具有通过允许缀合到免疫球蛋白上的肽正确折叠并且恰当呈现从而确保其能够实施其生物学活性的功能。优选的接头是被设计为富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基的"合成的肽接头"。这些残基以例如最多5个氨基酸的小的重复单元的方式排列，例如GGGGS，QQQQG或SSSSG。这种小的重复单元可以重复二至五次以形成多聚体单元。在该多聚体单元的氨基末端和/或氛基末端可以添加最多六个额外的任意天然氨基酸。其他合成的肽接头由重复次数在10至20次之间的单一氨基酸组成，例如在接头SSSSSSSSSSSSSSS中的丝氨酸。在氨基末端和/或羧基末端各可以存在最多六个额外的任意天然氨基酸。本申请中使用的术语"氨基酸"指天然的羧基a-M酸，其包括丙氨酸(三字母代码ala，单字母代码A)，精氨酸Urg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸、(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln,Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his,H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met,M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr,T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。本领域技术人员已知的、可用于实施本发明的方法和技术公开在例如Ausubel，F.M.编辑的CurrentProtocolsinMolecularBiology,VolumesItoIII(1997)，Wiley和Sons;Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)。本发明包括免疫球蛋白缀合物，其中该免疫球蛋白的末端中的至少两个与肽缀合。免疫球蛋白被划分为五种不同的类别IgA(A类免疫球蛋白)、IgD、IgE、IgG和IgM。在这些类别之间，免疫球蛋白在其整体结构上不同。可以发现构件上的相似性。所有的免疫球蛋白由成对的多肽链构成，该对包含所谓的免疫球蛋白轻链多肽(简称轻链)和所谓的免疫球蛋白重链多肽(简称重链)。IgG类的免疫球蛋白的共同结构在图1中显示。在诸如免疫球蛋白等由不同的亚基组成的复杂蛋白质中，由于模块化的结构而可获得多于一个的氨基端和多于一个的氛基端。例如，G类或者E类免疫球蛋白，各拥有两:对的重链和轻链。由于这种组成，在这些免疫球蛋白中，即在一个免疫球蛋白分子中，存在4个氨基端和4个羧基端。这允许最多8个肽缀合到一个IgG或IgE上，即，M端(N端)和M端(C端)的数目总和。本发明的免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白。即使其结合人类抗原，由于缺乏针对人类抗原的功能性可变结构域，而将具有UK5mol/l或更高的Ku值。这不排除非人类抗原以l(T7mol/1或更低的KD值被特异地结合。免疫球蛋白提供一个支架，肽通过遗传学方式与其连接。因此，具有非功能性可变结构域或者缺少一个或者多个可变结构域区域的全部或者部分并因此不具有任何抗原结合能力的免疫球蛋白也可以作为非功能性的免疫球蛋白而用于本发明。在免疫球蛋白链的末端引入的肽与整个的免疫球蛋白相比较，其大小是小的。例如，最小的免疫球蛋白，即，G类免疫球蛋白，具有大约150kDa的分子量；修饰物具有小于12.5kDa的大小，等价于大约100个氨基酸，通常小于7.5kDa，等价于大约60个氨基酸。通过分子生物学技术在核酸水平上将肽引入免疫球蛋白。缀合到免疫球蛋白上的,肽具有5至100个M酸残基的M酸序列，优选具有10至75个氨基鹾残基，更优选具有15至50个氨基酸残基。缀合到免疫球蛋白的多肽可以选自生物活性分子/肽。当将这些分子施用于人工生物系统、活细胞或者诸如鸟类或包括人类的哺乳动物的活的生物体时，其引起生物学效应。这些生物活性化合物包括，但不限于酶、受体、免疫球蛋白等等的激动剂以及拮抗剂、表现细胞毒性的、抗病毒的、抗细菌的或者抗癌的活性的耙向试剂以及抗原。优选的生物活性肽选自抗融合肽。本发明的免疫球蛋白缀合物可以用于制药、治疗或者诊断应用。生物活性肽可以选自但不限于例如hedgehog蛋白、骨形成蛋白、生长因子、促红细胞生成素、血小板生成素、G-CSF、白细胞介素和干扰素、蛋白质激素、抗病毒肽、抗融合肽、抗血管生成肽及细胞毒素肽等等。当多于一个的肽与免疫j求蛋白末端缀合时，存在不同的分布。可以缀合到免疫球蛋白上的肽的数目从一个至免疫球蛋白多肽链的氨基和羧基末端的总数。如果单一个肽缀合到免疫球蛋白上，该肽可以占据免疫球蛋白的任何一个末端。同样的，如果最大可能数目的肽缀合到免疫球蛋白上，则所有的末端都将被单一一个肽占据。如果缀合到免疫球蛋白上的肽的数目大于一但是小于最大可能数目，肽在免疫球蛋白末端可以有不同的分布。例如，如果四个肽缀合到G或者E类免疫球蛋白上，可以存在五种不同的组合(参见表1)。在两个组合中，属于一个类型的所有末端(即免疫球蛋白链的所有的四个氨基末端或者所有的四个羧基末端)每个各缀合一个肽。其他末端则没有被缀合。这导致将〗，务饰/缀合分配到免疫球蛋白的一个区域中的一种实施方案。在其他情况中，多肽缀合到多个两种不同的末端上。在这些组合中，缀合的肽被分配到免疫球蛋白的不同区域。在任一种情况中，发生缀合的末端的总数是4。表1:四个肽缀合到由四个多肽链组成的免疫球蛋白的末端的可能组合<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>本发明包括其中至少两个末端缀合有肽的免疫球蛋白。该缀合的肽本身不衍生自免疫球蛋白。缀合的肽的氨基^列可以是不同的、相似的或者相同的。通常，M酸序列是不同的，即具有小于90%的氛基酸同一性。在一个实施方案中，^J^酸序列的同一性为90%至小于100%;这些^J^酸序列以及相应的肽被定义为是相似的。在劣一个实施方案中，肽具有100%的^#列同一性，这使得它们是相同的。尽管缀合的肽可以显示一定程度的同源性或者同一性，但是它们还可以具有不同的M酸序列总长。肽和免疫球蛋白之间的缀合在核酸水平上实施。因此两个氨基酸之间的肽键使该肽和该免疫球蛋白缀合在一起。因此或者是肽的羧基末端的氨基酸缀合到免疫球蛋白链的氨基末端的氨基酸上，或者是免疫球蛋白链的g末端的氨基酸缀合到肽的^J^末端的氨基酸上。本发明的肽-免疫球蛋白缀合物的再一特征是可以由一个或者多个核酸分子，优选地由两个至八个核酸分子编码完整的缀合物。这使得免疫球蛋白缀合物能够重组产生。对于本发明的肽-免疫球蛋白缀合物的重组制备，需要两个或者两个以上编码不同多肽的核酸分子，优选需要两个至八个核酸分子。这些核酸分子编码缀合物的不同的免疫球蛋白多肽链，并且在下文中被称为结构基因。它们可以是同一个表达盒中的部分或者可以位于不同的表达盒中。缀合物的组装优选在其分泌之前并因此在表达细胞中发生。因此，优选编码缀合物的多肽链的核酸分子在相同的宿主细胞中表达。通常而言，对于未缀合的免疫球蛋白的制备，需要两个结构基因，一个编码轻链以及另一个编码重链。对于肽-免疫球蛋白缀合物的制备，需要另外的编码缀合的免疫球蛋白轻链和/或重链的结构基因。图12中显示一个示例，其中显示了一个免疫球蛋白和两个不同的肽的所有肽-免疫球蛋白缀合物。本发明的由缀合相同的肽的两个重链组成的免疫球蛋白，由一个或者两个结构基因编码。在两个肽都缀合到重链的相同末端氨基酸上时，使用一个结构基因。在一个肽缀合到笫一重链的氨基末端的氨基酸上而且另一个肽缀合到第二重链的皿末端的氨基酸上时，使用两个结构基因。再一示例是这样的缀合物，其中轻链的两个氨基末端缀合了不同或相似的肽。在这种情况中，不得不使用三个结构基因(图ll)。一个结构基因编码未缀合的重链(结构基因2)，一个结构基因编码缀合肽1的第一轻链(结构基因1)，以及一个结构基因编码缀合肽2的第二轻链(结构基因3)。对于这些绪构基因，可以设计位于一个或者多个表达载体(质粒)上的一个或者多个表ii盒。当在前述实例中缀合的肽是相同的时，仅仅需要两个结构基因，即一个编码未缀合的重链和另一个编码氨基端发生缀合的轻链(参见图11:结构基因1和3是相同的)。优选该肽-免疫球蛋白缀合物的所有三个构件在相同的细胞中表达。假设免疫球蛋白链进行统计学组装，可以实现四种不同的免疫球蛋白缀合物。在这些中，免疫球蛋白2和免疫球蛋白2a是相同的，并且因此三种不同的免疫球蛋白缀合物被分泌到培养基中。如果所有三个结构基因以化学计量方式表达，则免疫球蛋白1、免疫球蛋白2和免疫球蛋白3之间的比例是1:2:1。通过增强或者降低这些结构基因中的一+或者多个的表达，可以使所组装的缀合物的比例向优选的缀合物(1、2或者3)移动。方法是本领域技术人员已知的，例如使用具有不同的启动子强度的启动子。在肽相同的情况中，仅仅有一种免疫球蛋白缀合物形成并且分泌到培养基中。可以通过本领域技术人员已知的方法分离和纯化获得的免疫球蛋白缀合物的混合物。这些方法已经良好建立并广泛应用于免疫球蛋白纯化，并且这些方法可以单独使用或者联合使用。这些方法例如有使用微生物衍生的蛋白的亲和层析法(例如蛋白A或者蛋白G亲和层析)、离子交换层析法(例如阳离子交换(羧甲M脂)、阴离子交换(M乙基树脂)和混合模式的交换层析)、亲硫吸附(例如使用P巯基乙醇和其它的SH配体)、疏水相互作用或者芳族基因吸附层析(例如使用苯基-琼脂糖、aza-arenophilic树脂或者间氨基苯硼酸)、金属螯合亲和层析(例如使用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、分子大小排阻层析和制备型电泳方法(例:i口凝胶电;^、毛细管电^0(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。图13和14显示不同的缀合物，其可以通过使用缀合到轻链的氨基末端的第一肽以及缀合到重链的氯基末端的第二肽获得。在这种情况中，从四种不同的结构基因开始可以产生十种不同的免疫球蛋白缀合物。与未缀合的應M目比较，肽-免疫球蛋白缀合物显示出改进的药物动力学特性，例如半衰期(即最初量的肽的一半从血流中被清除掉和/或代谢掉所需要的时间)。同时，因为缀合的肽通过其缀合的免疫球蛋白被呈递和固定在彼此邻近的区域，故使用本发明的肽-免疫球蛋白缀合物可以增加缀合的肽的局部浓度。也可以提供缀合到相同的免疫球蛋白上的多于一种(即两种或者两种以上)的不同的肽。之前概述的本发明的免疫球蛋白缀合物的特性取决于缀合的肽的生物活性。因此该肽必需采取其天然的三维结构以^便能够与其靶标相互作用，并且该肽应该以恰当的方式呈现并不受限制地^皮接近。为了防止空间干扰，缀合的肽可以由肽接头和生物活性肽组成(关于肽接头参见表2)。表2肽接头<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>所有的肽接头可以由核酸分子编码并因此可以重组表达。由于接头本身是肽，生物活性肽通过在两个氨基酸之间形成的肽键而与接头连接。肽接头被引入到生物活性肽^生物活性肽待缀合的免疫球蛋白链之间。因此从氨基末端到氛基末端的方向上而言存在不同的可能序列a)生物活性肽-肽接头-免疫球蛋白多肽链，或者b)免疫球蛋白多肽链-肽接头-生物活性肽，或者c)生物活性肽-肽接头-免疫球蛋白多肽链-肽接头-生物活性肽，其中该生物活性肽可以是相同的或者不同的，并且其中该肽接头可以存在或者不存在，即在C端至N端的方向上可能的序列包括d)生物活性肽-免疫球蛋白多肽链，或e)免疫球蛋白多肽链-生物活性肽，或者f)生物活性肽-免疫球蛋白多肽链-生物活性肽。使用本领域技术人员已知的重组工程方法，免疫球蛋白缀合物可以在核l基因水平上进行特制。编码免疫球蛋白的核酸序列是已知的并且可以例如从基因组数据库中获得。同样地，生物活性肽的核酸序列也是已知的体密码而从其M^列推导出。用于表达本发明的缀合物的表达载体(质粒)，其构建所需要的元件为天然的和/或修饰的和/或缀合形式的免疫球蛋白轻链的表达盒、天然的和/或修饰的和/或缀合形式的免疫球蛋白重链的表达盒、选择标记、大肠杆菌(E.coli.)复制以及选择单元。这些表达盒包括启动子、结构基因、编码分泌信号序列的DNA片段和终止子。这些元件以可操作连接的方式组装在一个编码免疫球蛋白缀合物的所有链的表达载体(质粒)上，或者组装在两个或者两个以上分别编码免疫球蛋白缀合物的一个或者多个链的表达载体(质粒)上。为了表达编码的多肽，将表达载体(质粒)导入合适的宿主细胞。优选在诸如CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、K562细胞、BHK细胞、PER.C6细胞等的哺乳动物细胞中制^"白。载体的调控元件必须按其在选定的宿主细胞中可以发挥功能的方式来选择。为了表达，可以将含有编码免疫球蛋白缀合物的一个或多个链的(一种或多种)载体(质粒)的宿主细胞，培养在适于表达该链的条件下。所表达的免疫球蛋白链进行功能性组装。完全加工后的肽-免疫球蛋白缀合物分泌到培养基中。缀合物的免疫球蛋白部分提供肽附着的支架。该免疫球蛋白是非功能性的免疫J求蛋白，即其以10-5mo1/1或更高的(例如l(T3mol/l)Ko值(结合亲和性)结合人类抗原。属于此定义的免疫球蛋白例如是重链和/或轻链缺少一个或者多个构架区或/和高变区的一部分或者全部的免疫球蛋白、重链和/或轻链没有可变结构域(区)的免疫球蛋白、对于非人类抗原具有io-7mol/l或者更低的(例如10_1<)11101/1)Ko值的免疫球蛋白。提供下述实施例、序列表和附图用于帮助理解本发明，本发明的真正保护范围由后附权利要求说明。可以理解在不偏离本发明的精神的情况下，可以对列出的方法进行修改。图1:IgG类免疫球蛋白的共同结构。图2:抗IGF-lRyl重^Ji载体4818的质粒图i普。图3:抗IGF-1Rk轻链表达载体4802的质粒图i普。图4:重链恒定区基因载体4962的质粒图谱。图5:修飾的抗IGF-1Ry1重^^达载体4961的质粒图i普。图6:修饰的抗IGF-1Rk轻^^达载体4964的质粒图i普。图7:修饰的抗IGF-1R轻链表达栽体4963的质粒图镨。图8:亲和纯化的免疫球蛋白缀合物的SDS-PAGE凝胶的考马斯蓝染色图；根据表6进行样品排列。图9:在HEK293EBNA细胞中瞬时表达之后对细胞培养物上清液中的轻链的免疫检测；根据表6进行样品排列。图10:在HEK293EBNA细胞中瞬时表达之后对细胞培养物上清液中的重链的免疫检测；根据表6进行样品排列。图11:轻链的两个氨基末端缀合了不同或者相似的肽的肽-免疫球蛋白缀合物。图12:由一个免疫球蛋白和两个不同的肽组成的肽-免疫球蛋白缀合物。图13和14:第一肽缀合到免疫球蛋白的轻链的M末端，并且第二肽缀合到免疫球蛋白的重链的g末端的肽-免疫球蛋白缀合物。实施例材料和方法关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat，E.A.等，(1991)SequencesofProteinsofIm加nologicalInterest,FifthEd.,NIHPublicationNo91-3242中给出。根据EU编号对抗体链的氨基酸进行编号(Edelman，G.M.等，PNAS63(1969)78-85;Kabat，E.A.等，(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEd.，NIHPublicationNo91-3242。重组DNA4支术使用如Sambrook，J.等，Molecularcloning:Alaboratorymanual;ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989中描述的标准方法操作DNA。根据厂商的说明使用分子生物学试剂。蛋白质测定使用在氨基酸序列的基础上计算的摩尔消光系数，通过在280nm测定光密度(OD)而确定肽-免疫球蛋白缀合物的蛋白质浓度。DNA序列测定通过在MediGenomixGmbH(Martinsried，德国)上实施的双链测序而测定DNA序列。DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理寸吏用10.2版本的GCG，s(GeneticsComputerGroup,Madison,Wisconsin)软件包和8.0版本的Infomax，sVectorNTIAdvancesuit进行序列的创建、作图、分析、注解和说明。基因合成通过MedigenomixGmbH(Martinsried，德国)从化学合成的寡核苷酸制备需要的基因片段。边侧带有限制性内切酶单酶切位点的100-600bp长度的基因片段通过寡核苷酸退火和连接，包括PCR扩增而组装，并且随后通过A突出端克隆入pCR2.1-TOPO-TA克隆载体(Invitrogen)。通过DNA测序对亚克隆的基因片段的DNA序列进行确i人。免疫球蛋白缀合物的亲和纯化才艮据已知的方法寸吏用蛋白A-SepharoseCL-4B(AmershamBioscience)通过亲和层析纯化已表达和分泌的肽-免疫球蛋白缀合物。简而言之，离心(10,000xg，10分钟)和通过0.45pm滤器过滤后，含有免疫球蛋白缀合物的澄清的培养物上清液施加到用PBS緩沖液(10mMNa2HP04，1mMKH2P04，137mMNaCl和2.7mMKCl，pH7.4)平衡的蛋白A-SepharoseTMCL-4B柱上。使用PBS平衡緩冲液和pH5.5的0.1M柠檬酸盐緩冲液洗去未结合的蛋白质。使用pH3.0的0.1M的柠檬酸盐緩冲液洗脱免疫球蛋白缀合物，并且使用lMTris碱中和含有免疫球蛋白缀合物的级分。然后，4°C，免疫球蛋白缀合物在PBS緩冲液中进行充分透析，使用配备有Biomax-SK膜(Millipore)的ultrafree离心过滤装置进行浓缩，然后储存在0。C的冰水浴中。实施例1制备表达质粒连接编码胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)抗体(在下文也称为抗IGF-IR或IR)轻链可变区(VL)和人K轻链恒定区(CL)(序列参见US2005/0008642)的基因片段，对编码抗IGF-IR重链可变区(VH)和人yl重链恒定区(CHl-铰链区-CH2-CH3)的基因片段也进行连接。a)载体4818载体4818是用于在HEK293EBNA细胞中瞬时表达抗IGF-IR抗体重链(以基因组方式组织的表达盒；外显子-内含子的组织方式)的表达质粒，其包括下述功能元件除了抗IGF-1R-重链表达盒之外，此载体还含有-作为选择标记的潮霉素抗性基因，-EB病毒(EBV)的复制起点oriP,-来自pUC18载体的复制起点，其允许本质粒在大肠杆菌中复制，和-赋予大肠杆菌氨节青霉素抗性的p-内酰胺酶基因。抗IGF-lRyl重链基因的转录单位由下述元件组成-来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，-合成的5，-非翻译区(UT)，-包括信号序列内含子(信号序列1、内含子、信号序列2[Ll-内含子-L2])的鼠免疫球蛋白重链信号序列；誦克隆的抗IGF-1R可变重链编码片段，在5，末端(L2信号序列)安排有Bsml限制性内切酶单酶切位点，以及在3'末端安排有剪切供体位点和Notl限制性内切酶单酶切位点，-包括小鼠重链增强子元件(部分JH3，JH4)的小鼠/人重链杂合内含子2(Neuberger，M.S.,EMBOJ.2(1983)1373-1378),-基因组人yl重链基因恒定区，-人yl免疫球蛋白多聚腺苷酸化("polyA")信号序列，和-分别在5，-和3，-末端的AscI和SgrAI限制性内切酶单酶切位点。图2显示抗IGF-lRyl重链表达载体4818的质粒图语。b)载体4802链(cDNA)的表达质粒，其包括下述功能元件除了抗IGF-1Rk轻^^达盒之外，此载体还含有:-作为选择标记的潮霉素抗性基因，-EB病毒(EBV)的复制起点oriP，-来自pUC18载体的复制起点，其允许本质粒在大肠杆菌中复制，和-赋予大肠杆菌氨爷青霉素抗性的P-内酰胺酶基因。抗IGF-1Rk轻链基因的转录单位由下述元件组成-来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，-克隆的抗IGF-lR可变轻链cDNA，包括-天然5，-UT，和-在5，-末端安排有BglII限制性内切酶单酶切位点的人免疫球蛋白种系基因的天然轻链信号序列，-人k轻链基因恒定区，-人免疫球蛋白k多聚腺苷酸化信号("polyA")序列，-分别在5，-和3，-末端的Ascl和Fsel限制性内切酶单酶切位点。图3显示了抗IGF-1RK轻链表达栽体4802的质粒图镨。c)质粒4962载体4962作为用于组^JJi质粒4965、4966和4967的基础结构。这些质粒使得修饰的抗体重链(没有可变结构域的N末端缀合，cDNA组织方式)能够在HEK293EBNA细胞中瞬时表达。质粒4962包括下述功能元件除了Yl重链恒定区的表达盒之外，本载体还含有-作为选择标记的潮霉素抗性基因，-EB病毒(EBV)的复制起点oriP,-来自pUC18载体的复制起点，其允许本质粒在大肠杆菌中复制，-赋予大肠杆菌氨千青霉素抗性的(5-内酰胺酶基因。yl重链恒定区基因(CHl-铰链区-CH2-CH3)的转录单位由下述元件组成-来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，-包括在5，末端的BglII限制性内切酶单酶切位点和在3'末端的Nhel限制性内切酶单酶切位点(Nhel位点在CH1N末端内)的合成接头(SEQ<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>-人重链基因恒定区(CHl-4^^-CH2-CH3，cDNA组织方式)，-人免疫球蛋白多聚腺苷酸化信号("polyA")序列，画分别在5，-和3，-末端的Ascl和Fsel限制性内切酶单酶切位点。重链恒定区基因载体4962的质粒图镨在图4中显示。d)质粒4961载体4961作为用于组装表达质粒4970至4975的基础结构。这些质粒使得修饰的抗体重链(C末端缀合)可以在HEK293EBNA细胞中瞬时表达。基础载体4961是用于在HEK293EBNA细胞中瞬时表达抗IGF-1R抗体重链(以基因组方式组织的表达盒)的表达质粒。其包括下述功能元件除了抗IGF-1Ry1重链^表达盒之外，本载体还含有-作为选择标记的潮霉素抗性基因，-EB病毒(EBV)的复制起点oriP，-来自pUC18载体的复制起点，其允许本质粒在大肠杆菌中复制，-赋予大肠杆菌氨千青霉素抗性的p-内酰胺酶基因。抗IGF-lRyl重链基因的转录单位由下述元件组成-来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，-合成的5，-UT，-包括信号序列内含子(Ll、内含子、L2)的鼠免疫球蛋白重链信号序列；-克隆的抗IGF-1R可变重链编码片段，在5，末端(L2信号序列)安排有Bsml限制性内切酶单酶切位点，以及在3，末端安排有剪切供体位点和的Notl限制性内切酶单酶切位点，-包括小鼠重链增强子元件(部分犯3,JH4)的小鼠/人重链杂合内含子2(Neuberger,M.S.,EMBOJ.2(1983)1373-1378)，-基因组人Yl重链基因恒定区和轻孩i修饰的CH3-IgG,多聚腺苷酸化(pA)连接区(SEQIDNO:14，插入HindIII和Nhel限制性内切酶单酶切位点)CH3工gGlpA...ctaagcttgtccccgggcaaaTGAgtgctagcgccggcaagcc......LeuSerLeuSerProGlyLiysHind工工INhe工-人免疫球蛋白多聚腺苷酸化("polyA")信号序列，-分别在5，-和3，-末端的AscI和FseI限制性内切酶单酶切位点图5显示修饰的抗IGF-lRyl重链表达载体4961的质粒图i普。e)质粒4964载体4964作为组^^达质粒4976和4977的基础结构。这些质粒^f吏得修饰的抗IGF-1R抗体轻链(N末端缀合)能够在HEK293EBNA细胞中瞬时表达。质粒4964是表达质粒4802的变体。抗IGF-lRK-轻链基因的转录单位如下所示进行修饰天然的轻链信号序列由5，末端安有BglII限制性内切酶单酶切位点、3，末端安有Nhel限制性内切酶单酶切位点的合成接头代替，该接头直接连接在VL区(SEQIDNO:15)上。I-VL-IGF-IR...3g3tctatatatat5Lt3tgct3gcgaaattgtgttg3c3..AlaSerGlu工leVal:LeuThr...BglIINhe工图6显示修饰的抗IGF-1Rk轻链表达载体4964的质粒图语。f)质粒4969表达质粒4968和4969f汙生自抗IGF-1R抗体轻链的表达质粒4802。该质粒编码修饰的抗体轻链片段(没有可变区的N端缀合；多肽-接头-k链的恒定区)。为了构建质粒4968和4969，将BglII限制性内切酶单酶切位点引入CMV启动子的3'末端，并且将Bbsl限制性内切酶单酶切位点引入到抗IGF-1R抗体轻链恒定区(SEQIDNO:16)的内部。卜-C-kBbs工cgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttc...ArgThrValAlaAlaProSerValPhe工lePhe...g)质粒4963载体4963作为组^达载体4978和4979的基础结构。这些质粒使得修饰的抗IGF-1R抗体轻链(C末端缀合)能够在HEK293EBNA细胞中瞬时表达。质粒4963是表达质粒4802的变体。抗IGF-1Rk轻链基因的转录单位如下进行修饰曙在C画k-Ig-kpA连结区对人k轻链恒定区基因进行轻微修饰(插入HindIII和Kasl限制性内切酶单酶切位点，SEQIDNO:17)。.C-kIg-k-pA...AaaagcttcaacaggggagagtgtTGAagggagaggcgccccca...LysSerPheAsnArgGlyGluCysHind工IIKasl图7显示修饰的抗IGF-1R轻^^达载体4963的质粒图镨。实施例2制备最终的表达质粒使用已知的重组方法和技术，通过连接相应的核酸片段，已组装免疫球蛋白融合基因(重链和轻链)，其包含免疫球蛋白基因片段、任选的接头基因片段和多肽基因片段。编码肽接头和多肽的核酸序列分别通过化学合成方法合成，并且然后连接入大肠杆菌质粒。通过DNA测序对该亚克隆核酸序列进行验证。所使用的免疫球蛋白多肽链(全长重链或轻链)，或者，免疫球蛋白多肽链片段(抗体轻链或重链的恒定区)、多肽缀合的位置(N或C末端)、所使用的接头和所使用的多肽在表2(第3页)、表3和表3a中列出。表3:所使用的蛋白质和多肽；M^列以及位置的编号如BH8参照林中的一样(Ratner，L.等，Nature313(1985)277-284;基因座HIVH3BH8;来自法国的HIV-1分离林LAI/IIIB克隆BH8)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表3a:用于免疫球蛋白缀合物基因构建的化学制备的基因片段<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表4中列出了用于构建瞬时表达修饰的免疫球蛋白多肽轻链和重链(表达盒)的最终表达质粒的组分，以及对应的所使用的基础质粒、克隆位点、编码缀合的免疫球蛋白多肽的插入核酸序列。表4:用于构建所使用的表达质粒的组分<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表5中列出使用的具有HIV-1抑制特性的多肽(T-651,T-2635和HlV-lgp41胞外域变体)、使用的用于连接免疫球蛋白轻链或重链与生物活性肽的肽接头、从编码的氨基酸序列推导出的推导的修饰抗体链的分子表5:使用的多肽以及修饰的免疫球蛋白多肽链的推导的分子量的一览表<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>实施例3在HEK293EBNA细胞中瞬时表达免疫球蛋白变体通过瞬时转染在DMEM培养基(Dulbecco，smodifiedEagle'smedium,Gibco)中贴壁生长的HEK293-EBNA细胞(表达EB病毒核抗原的人胚胎肾细胞系293，美国典型培养物保藏中心保藏号ATCC#CRL-10852)而产生重组免疫球蛋白变体，该DMEM培养基补充有10%超低IgG的FCS(胎牛血清，Gibco)，2mM谷氨酰胺(Gibco)，1%体积比(v/v)的非必需氨基酸(Gibco)和250pg/mlG418(RocheMolecularBiochemicals)。为了转染，4吏用转染试剂FugeneTM6(RocheMolecularBiochemicals)，使用比例为试剂(jal)与DNA(jag)的比为3:1至6:1。从两种不同的质粒表达免疫球蛋白的轻链和重链，使用的轻链与重链编码质粒的摩尔比从1:2至2:1。在转染后的第4至11天收集含有免疫球蛋白变体的细胞培养物上清液。纯化前将上清液储存在0°C的水水浴中。Meissner，P.等，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中给出了关于例如在HEK293细胞中重组表iiA免疫球蛋白的一般信息。实施例4通过SDSPAGE、Western印迹转移和4吏用免疫球蛋白特异性抗体缀合物进行的检测，实施表达分析通过十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)处理表达并分泌的肽-免疫球蛋白缀合物，并且将分离的免疫球蛋白缀合物链从凝胶转移至膜上，并随后通过免疫学方法进行检测。SDS-PAGELDS样品緩沖液，四倍浓度Ux):4g甘油，0.682gTris碱，0.666gTris-盐酸，0.8gLDS(十二烷J^危酸锂)，0.006gEDTA(乙二胺四乙酸)，0.75ml的1%重量比(w/w)ServaBlueG250水溶液，0.75ml的1%重量比(w/w)苯酚红溶液，补加水至总体积10ml。离心含有分泌的肽-免疫球蛋白缀合物的培养液以除去细胞和细胞碎片。等分的澄清上清液与1/4体积(v/v)的4xLDS样品緩冲液以及1/10体积(v/v)的0.5M1，4-二硫苏糖醇(DTT)混合。然后将样品在70°C孵育10min并通过SDS-PAGE分离蛋白质。根据厂商的说明使用NuPAGE预制胶系统(Invitrogen)。具体地，使用10%NuPAGENovexBis-Tris预制胶(pH6.4)和NuPAQEMOPS电泳緩冲液。Western印迹转移緩冲液39mM甘氨酸，48mMTris-盐酸，0.04%重量比(w/w)SDS和20%体积比甲醇(v/v)。SDS-PAGE电泳后，才艮据Burnette的Semidry画Blotting-Method方法，将分离的免疫球蛋白缀合物多肽链电泳转移到硝酸纤维素滤膜上(孔径大小:0.45|nm)(Burnette,W.N"Anal.Biochem.112(1981)195-203)。免疫学检测TBS緩冲液50mMTris-盐酸，150mMNaCl，调整至pH7.5。封闭溶液TBS緩沖液中1%(w/v)的Western封闭试剂(RocheMolecularBiochemicals)。TBST緩沖液含有0.05%体积比(v/v)的Tween-20的lxTBS緩冲液。为了进行免疫学检测，western印迹膜在室温TBS緩冲液中振荡孵育两次5分钟，以及在封闭溶液中振荡孵育一次90分钟。免疫球蛋白缀合物多肽链的检测重链为了检测肽-免疫球蛋白缀合物的重链，使用纯化的缀合过氧化物酶的兔抗人IgG抗体(DAKO，CodeNo.P0214)。轻链使用纯化的缀合了过氧化物酶的兔抗人k轻链抗体(DAKO，CodeNo.P0129)检测肽-免疫球蛋白缀合物的轻链。为了可视化抗体轻链和重链，首先将洗涤和封闭后的Western印迹膜与1:10，000稀释的、纯化的缀合了过氧化物酶的兔抗人IgG抗体(对于重链)或者纯化的缀合了过氧化物酶的兔抗人K轻链抗体(对于轻链)，在lOml封闭溶液中，在4。C振荡孵育过夜。室温使用TBTS緩冲液洗涂膜三次和用TBS緩冲液洗涤一次IO分钟之后，使用可以产生化学发光的M苯二酰肼/过氧化物溶液(Lumi-LightPLUSWesternBlotting底物，RocheMolecularBiochemicals)对Western-印迹膜进行显影。因此，在10ml氨基苯二酰肼/过氧化物溶液中孵育膜10秒至5分钟，然后使用Lumi-ImagerFl分析仪(RocheMolecularBiochemicals)检测发射的光和/或用X光片记录。使用LumiAnalyst软件(3.1版本)定量斑点的强度。免疫印迹的多重染色通过将膜在含有100mMP-巯基乙醇和20%(w/v)SDS的1MTris-盐酸緩沖液(pH6.7)中70。C孵育1小时，可以从染色的印迹上除去用于检测的过氧化物酶标记的二抗偶联物。经过这个处理之后，该印迹可以用不同的二抗第二次进行染色。在第二次检测之前，印迹用TBS緩冲液室温振荡洗涤三次，每次10分钟。表6a至6c列出样品的排列。表6a:SDSPAGE凝^/Western印迹-^i^1的样品排列<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表6b:SDSPAGE凝M7Western印迹省胶2的样品排列<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表6c:SDSPAGE凝胶/Western印迹一凝胶3的样品排列<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>实施例5组装的免疫球蛋白缀合物的检测通过亲和结合到蛋白人SepharoseCL-4B上纯化和浓缩免疫球蛋白缀合物多肽含有一种或者多种质粒的HEK293EBNA细胞在适于瞬时表达位于质粒上的免疫球蛋白多肽链结构基因的条件下培养6至10天。向1.8mlEppendorf管中1ml的澄清的培养物上清液，加入0.1ml蛋白A-SepharoseTMCL-4B(AmershamBiosciences)悬浮液(1:1(v/v)的蛋白A-SepharoseTM在PBS緩冲液中的悬浮液，(PBS緩冲液为10mMNa2HP04,1mMKH2P04，137mMNaCl和2.7mMKCl，pH7.4))。该悬浮液在室温振荡孵育1至16个小时。之后，通过离心沉淀Sepharose珠(30s，5000rpm)并且弃掉上清液。随后Sepharose沉淀物用1.6mlPBS緩冲液，1.6ml0.1M柠檬酸盐緩冲液pH5.0和1.6ml蒸馏水分别洗涤。使用0.1mllxLDS-PAGE样品緩冲液在70。C从Sepharose珠上提取蛋白A结合的免疫球蛋白5至10min。如实施例4所描述的，通过SDS-PAGE分离和考马斯亮蓝染色进行分析。结果瞬时表达后的重链和轻链的表达/分泌分析图8a-c:亲和纯化的免疫球蛋白缀合物的SDS-PAGE凝胶的考马斯亮蓝染色，根据表6进行样品的排列。免疫球蛋白多肽链的检测图9a-c:在HEK293EBNA细胞中瞬时表达后免疫检测细胞培养物上清液中的轻链。图lOa-c:在HEK293EBNA细胞中瞬时表达后免疫检测细胞培养物上清液中的重链。从图8a-c，9a-c和lOa-c可以推导出免疫球蛋白轻链和重链瞬时表达并分泌到培养基中。在免疫球蛋白链含有一个或者几个糖基化位点的情况中，最终的肽-免疫球蛋白缀合物和相应地单个的免疫球蛋白缀合物链没有确切的分子量，而是具有取决于糖基化程度的一个分子量分布。这导致在SDS-PAGE上，代表一种免疫球蛋白缀合逸的所有分子不一致地迁移，并因此使得条带#>宽。由于免疫球蛋白与蛋白A的亲和结合仅仅;L^于重链的Fc部分的相互作用，并且因为除了重链外在SDS-PAGE和考马斯染料染色后还检测到轻链，故可以作出免疫球蛋白缀合物已经正确组装并且由轻链和重链组成的结论。实施例64吏用人IgGELISA定量表达的重链4吏用夹心ELISA测定在细胞培养物上清液中免疫球蛋白缀合物的重链多肽的浓度，该EUSA使用生物素酰化的抗人IgGF(ab，)2片段作为捕获试剂并使用过氧化物物缀合的抗人IgGF(ab，)2抗体片段用于检测。链霉亲和素包被的96-孔板(PierceReacti-BindTMStreptavidinCoatedPolystyreneStripPlates,CodeNo.15121)用稀释緩冲液(稀释緩冲液含有0.5%重量体积比的牛血清白蛋白的PBS緩沖液)中的0.5照/ml生物素酰化的山羊多克隆抗人IgGF(ab，)2抗体片段(F(ab，)2<h-Fc>Bi;Dianova，CodeNo.109-066-098)捕获抗体(0.1ml/孑L)，通过在室温下(RT)振荡孵育1小时而包被。之后，使用多于0.3ml洗涤緩冲液洗涤板三次(洗涤緩冲液含有1%重量体积比(w/v)的Tween20的PBS)。含有IgG免疫球蛋白缀合物的细胞培养物上清液(样品)在稀释緩冲液中系列稀释(两倍)至浓度为0.5-20ng/ml，加入板中并在室温摇晃孵育1小时。稀释緩冲液中的纯化的抗IGF-IR标准抗体(0.5-20ng/ml)用于产生IgG蛋白标准曲线。用0.3ml/孔的洗涤緩冲液洗涤板三次之后，使用过氧化物酶缀合的、山羊多克隆抗人F(ab，)2特异性IgG的F(ab，)2片段[F(ab，)2<h-Fcr>POD;Dianova,CodeNo.109-036-098检测与人Fey结合的复合物。用0.3ml/孔的洗涤緩冲液洗涤板三次，用ABTS(2，2，-连氮基-双-(3-乙基苯并瘗唑啉-6-磺酸)过氧化物酶底物溶液(RocheMolecularBiochemicals,CodeNo.1684302)对板进行显色。10-30分钟之后，在TecanSpectrafluorplus板读数机(TecanDeutschlandGmbH)上扣除试剂空白(孵育緩冲液+ABTS溶液)确定在405nm和4卯nm的吸光度。对于背景校正，根据公式I，从405nm的吸光度中减去490nm的吸光度。所有的样品至少以一式两份重复测试，并且将来自两次或者三次吸光度测量的数值进行平均。样品的IgG含量从标准曲线上计算。公式I:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>实施例7活病毒抗病毒实验为了活NL-BaI病毒的生产，将质粒pNL-Bal(USNIHAidsReagentProgram)转染到培养在Dulbecco氏改良的极限培养基(DMEM)中的HEK293FT细胞系中，该培养基含有10%胎牛血清(FCS),100U/mL青霉素，100ng/mL链霉素，2mML-谷氨酰胺和0.5mg/mLgeniticin(所有的培养基来自Invitrogen/Gibco)。在转染后两天收集含有病毒颗粒的上清液，采用通过0.45nm孔径的PES(聚醚砜(polyethersulfon))过滤器(Nalgene)过滤除去细胞碎片，并等分储存在-80。C。为了对实验性能进行标化，使用病毒原种的等分样品感染JC53-BL(USNIHAidsReagentProgram)细胞，产生大约每孔1.5x105RLU(相对光单位)。在96孔板中系列稀释测试的肽-免疫球蛋白缀合物、包括抗CCR5单克隆抗体2D7(PharMingen;CCR5，趋化因子受体；HIV-1感染的共受体)的参考抗体和参考肽(T-651和T-2635)。该实验一式四份实施。每个板含有细胞对照和病毒对照孔。等价于1.5x105RLU的病毒原种添加到每个孔中，然后2.5x104个JC53-BL细胞加入到每个孔中，使得每孔的最终实验体积是200^1。在37。C,卯％相对湿度，5。/。C02的情况下孵育3天后，吸出培养基，将50^1的Steady-GloLuciferaseAssaySystem(萦光素酶检测系统)(Promega)加入到每个孔中。在室温孵育10分钟后，在发光计(Luminoskan，ThermoElectronCorporation)上读取实验板。在减去背景之后，计算每个剂量点的萤光素酶活性的抑制百分数，通过使用用于Excel的XLfit曲线拟合软件(3.0.5版本，Buildl2;Microsoft)测定IC50。表7:肽和肽-免疫球蛋白缀合物的抗病毒活性化合物抗病毒活，性在20ng/mL的抑制百分数或IC5。(ng/mL)参考抗体l(<IGF-1R>)无活性参考抗体2(无作用的)n.d.参考抗体3(无作用的)n.d.T-6510.4jig/mLT-26350.5ng/mL参考抗CCR52D72.3ing/mL4970/480220%4972/480243%4974/480212.5ng/mL4976/481838%4965/4968实施例8单周期抗病毒实验为了产生假型NL-Bal病毒，质粒pNL4-3Aenv(在env基因中具有缺失的HIVpNL4-3基因组构建体)和pCDNA3.1/NL-BALenv[含有NL-Balenv基因的pcDNA3.1质粒(从NIBSCCentralizedFacilityforAIDSReagents获得)共转染到培养在Dulbecco，氏改良的极限培养基(DMEM)中的HEK293FT细胞系(Invitrogen)中，该培养基含有10%胎牛血清(FCS)，100U/mL青霉素，100ng/mL链霉素，2mML-谷氨酰胺和0.5mg/mLgenkicin(所有培养基来自Invitrogen/Gibco)。在转染后两天收集含有假型病毒的上清液，采用通过0.45nm孔径的PES(聚醚砜)过滤器(Nalgene)过滤除去细胞碎片，并等分储存在-80。C。为了对实验性能进行标化，使用病毒原种的等分样品感染JC53-BL(USNIHAidsReagentProgram)细胞，产生大约每孔1.5x10sRLU(相对光单位)。在96孔板中系列稀释测试的肽-免疫球蛋白缀合物、参考抗体和参考肽(T-20,T-651和T-2635)。该实验一式四份实施。每个板含有细胞对照和病毒对照孔。等价于1.5x10sRLU的病毒原种添加到每个孔中，然后2.5x104个JC53-BL细胞加入到每个孔中，使得每孔的最终实验体积是200^1。在37。C，90%相对湿度，5%<:02的情况下孵育3天后，吸出上清液，将50nl的Steady-GloLuciferaseAssaySystem(萤光素酶检测系统)(Promega)加入到每个孔中。在室温孵育10分钟后，在发光计(Luminoskan，ThermoElectronCorporation)上读取实验板。在减去背景之后，计算每个剂量点的萤光素酶活性的抑制百分数，通过使用用于Excel的XLfit曲线拟合软件(3.0.5版本，Buildl2;Microsoft)测定ICso值。表8:肽和肽-免疫球蛋白缀合物的抗病毒活性<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>在外周血单核细胞(PBMC)中的抗病毒实验才艮据生产厂商的i兌明书，通过Ficoll-Paque(Amersham，Piscataway，NewJersey,USA)密度梯度离心从血沉棕黄层(buffy-coats)(获得自斯坦福血液中心(StanfordBloodCenter))中分离人PBMC。简而言之，从血沉棕黄层中转移血液到50ml锥形管中，并用无菌的Dulbecco，s磷酸緩沖盐溶液(Invitrogen/Gibco)稀释为50ml的终体积。25ml的稀释血液转移到两个50ml锥形管中，将12.5ml的Ficoll-PaquePlus(AmershamBiosciences)小心地铺在下面并且在室温下450xg在不带制动的情况下离心20分钟。将白细胞层小心的转移到新的50ml锥形管中并使用PBS洗涤两次。为了移除剩余的红细胞，在室温使用ACK裂解緩冲液(Biosource)与细胞孵育5分钟，并且用PBS再洗涤一次。计数PBMC并且以2-4x106细胞/ml的浓度在RPMI1640中37。C孵育24h，该RPMI1640含有10%FCS(Invitrogen/Gibco)，1%青霉素/链霉素，2mML-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠和2ng/ml植物凝血素(Invitrogen)。在检测前使细胞与5单位/ml人IL曙2(RocheMolecularBiochemicals)孵育最少48h。在96孔圆底板中，在存在系列稀释的测试肽-免疫球蛋白缀合物、参考免疫球蛋白和参考肽(T-20,T-651和T-2635)的情况下，使用THIV-1JR-CSF病毒(Koyanagi，Y.，等，Science236(1987)819-822)感染1x105PBMC。使用的病毒的量等价于1.2ngHIV-1p24抗原/孔。一式四份进行感染。在37。C孵育板6天。在MicrosoftExcelFit(3.0.5版本Buildl2;equation205;Microsoft)中使用具有一个结合位点的S形剂量反应模型，通过p24ELISA(HIV-1p24ELISA#NEK050B)在感染结束时检测病毒的产量。表9:肽和肽-免疫球蛋白缀合物的抗病毒活性<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>无作用的抗体对于不存在于该检测系统中的抗原具有特异的结合活性(KD小于108mol/l)实施例10测定多肽的结合亲合性通过使用BIAcore3000仪器(Pharmacia,Uppsala,Sweden)以等离子体表面共振(SPR)在25。C检测基于HIV-1gp41蛋白的HR1-HR2相互作用(HR，七肽重复序列l和2区)的多肽的结合亲合性。已经良好建立了BIAcore⑧系统用于分子相互作用的研究。其能够连续地实时监测配体/分析物的结合，并因此可以测定结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡常数(KD)。SPR技术是基于测定接近于金涂覆的生物感受器芯片表面的折射率。折射率的改变表明由固定的配体与以溶液注射的分析物的相互作用所引起的表面上的质量改变。如果分子结合表面上固定的配体，则质量增加，在解离的情况中，质量降低。结合实验通过三次连续的1分钟注射含有1MNaCl的50mMNaOH预洗涤传感器芯片SA(SensorChipSA(SA，链霉亲合素))。然后将生物素酰化的HR1肽，生物素-T-2324(SEQIDNO:37)固定在SA包被的传感器芯片上。为了避免质传限制(masstransfer〖imitation),将溶解在HBS國P緩沖液(10mMHEPES，pH7.4，150mMNaCl，0.005%(v/v)表面活性剂P20)中的最低可能值的HR1肽(约200RU，共振单位)加载在SA芯片上。在开始测量之前，使用0.5%(w/v)十二烷^P危酸钠(SDS)以50nL/min的流速务，冲一分钟而第一次再生该芯片。将待分析的含有HR2HIV-1gp41的多肽首先以大约1mg/mL的浓度溶解在50mMNaHC03,pH9中，然后用HPS-P緩冲液稀释以获得范围从25至1.95nM的多个浓度。;样品的接触时间是5分钟(结合期)。然后用HBS-P洗涤芯片表面5分钟(解离期)。所有的相互作用在精确的25°C(标准温度)进行。在一个测量周期中样品储存在12。C。以每秒一个信号的检测速率对信号进行检测。样品以50nL/min的流速以递增的浓度注射在HR1缀合的生物感受器元件上。以50nL/min的流速用0.5%(w/v)SDS溶液洗涤1分钟再生该表面。使用BIAevaluation4.1软件包，通过分析使用多个不同的浓度获得的传感图曲线而确定定义为ka/ka的平衡常数(KD)。通过从HR2-HR1相互作用的值中减去含有HR2的多肽与无链霉亲合素的表面相互作用的反应值而校正非特异性结合。数据的拟合遵循1:1Langmuir结合模型。多肽的去糖基化含有HR2的多肽样品以大约2mg/ml的浓度溶解在PBS緩冲液中，通过与肽-N4唐苦酶F(PNGaseF，Prozyme，SanLeandro，CA)在37。C孵育12-24小时而去糖基化(除去N-聚糖)，其中每毫克N糖基化的多肽使用50mUPNGaseF。表10a:示例性的含有HR2的多肽与HR1的结合常数<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表10b:含有HR2的多肽与HR1的示例性K『值<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>权利要求1.肽-免疫球蛋白缀合物，其特征在于a)所述的免疫球蛋白由两条重链组成，或者由两条重链和两条轻链组成，b)所述的免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白，c)所述的缀合物具有下述通式免疫球蛋白-[肽]n其中n是从2至8的整数，d)肽键使肽的羧基末端氨基酸缀合到免疫球蛋白链的氨基末端氨基酸上，或者使免疫球蛋白链的羧基末端氨基酸缀合到肽的氨基末端氨基酸上。2.根据权利要求l的缀合物，其特征在于所述的肽是生物活性肽。3.根据权利要求l的缀合物，其特征在于所述的肽由肽接头和生物活性肽组成。4.根据权利要求l-3任一项的缀合物，其特征在于所述肽彼此间具有90%或者更高的M酸序列同一性。5.根据权利要求l-4任一项的缀合物，其特征在于该免疫球蛋白是G类免疫球蛋白(IgG)或者是E类免疫球蛋白(IgE)。6.根据权利要求2-5任一项的缀合物，其特征在于所述的生物活性肽是抗融合肽。7.根据权利要求l-6任一项的缀合物，其特征在于所述的非功能性的免疫球蛋白是以10_5mol/l或者更高的Ko值(结合亲和性)结合人类抗原的免疫球蛋白。8.根据权利要求l-6任一项的缀合物，其特征在于所述的非功能性的免疫球蛋白是a)其中重链和/或轻链缺少一个或多个构架区或/和高变区的一部分或者全部的免疫球蛋白，或者b)其中重链和/或轻链没有可变区的免疫球蛋白，或者c)对于人类抗原具有l(T5mol/l或者更高的结合亲和性的免疫球蛋白，或者d)对于人类抗原具有1(T5mol/l或者更高的结合亲和性，并且对于非人类抗原具有10-7mo1/1或者更低的结合亲和性的免疫球蛋白。9.用于生产根据权利要求l的缀合物的方法，其特征在于该方法包括a)在适于表达该缀合物的条件下培养含有一种或者多种质粒的细胞，其中所述质粒含有一个或者多个编码根据权利要求1的缀合物的核酸分子，b)从细胞或者培养基中回收该缀合物。10.药物组合物，其含有根据权利要求1至8之任一项的缀合物，或者其药学上可接受的盐以及药学上可接受的赋形剂或者栽体。11.根据权利要求1至8任一项的缀合物在制备用于治疗病毒感染的药物中的用途。12.根据权利要求ll的用途，其特征在于该病毒感染是HIV感染。13.根据权利要求1至"8任一项的缀合物在治疗需要抗病毒治疗的患者中的用途。14.根据权利要求1至8任一项的缀合物，其特征在于所述的肽具有90%至小于100%的#^酸序列同一性。15.根据权利要求1至8和14之任一项的缀合物，其特征在于所述的非功能性的免疫球蛋白是其中重链和/或轻链缺少一个或者多个构架区或/和高变区的一部分或者全部的免疫球蛋白，和/或是其中重链和/或轻链无可变区的免疫球蛋白。全文摘要本发明涉及肽-免疫球蛋白缀合物，其中免疫球蛋白多肽链的末端中至少有两个与肽缀合，由此所述肽可以是不同的、相似的或者相同的。该缀合在核酸水平上实现。文档编号C07K19/00GK101291956SQ200680039224公开日2008年10月22日申请日期2006年10月19日优先权日2005年10月21日发明者E·科佩茨基,R·舒马赫,S·桑库拉特利,S·费舍尔申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司