专利名称：氟虫腈人工半抗原及合成方法、抗原和抗体及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及选择一种具有-COOH的、又最大可能包含氟虫腈原有结构的化合物作为氟 虫腈半抗原制备的人工抗原、人工抗体以及抗体的用途。
背景技术：
本发明属于农药小分子化合物(分子量小于1000道尔顿)免疫化学和残留分析技术
领域，涉及有机合成，免疫化学及生物化学等，依靠免疫学、免疫化学基本原理和生物技 术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原， 免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测 识别的标记物的放大作用，定量地检测样本中超微量小分子目标分析物，具有特异、灵敏、 准确、快速、方便、廉价等特点，该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工全 抗原及抗体的制备，因此，目标分析物分子免疫学特性以及如何通过化学或生化技术突出 和利用这些特性是该领域极为重要的研究内容，这一技术目前已成为农药残留痕量分析研 究的一个崭新领域，被列为当前优先研究、开发和利用的农药残留分析技术，世界粮农组
织(FAO)已向许多国家推荐此项技术，美国化学将免疫分析与气相色谱，液相色谱共同 列为农药残留分析的支柱技术。
影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的选择性(或特异性)与亲和性，这些性质 又决定于免疫半抗原分子的结构，因此，免疫半抗原的分子设计与合成是建立小分子免疫 化学分析的关键步骤。农药小分子必须与大分子物质连接后才能刺激动物产生特异性抗 体，这已成为小分子免疫分析的基本模式。因此，半抗原的合成与鉴定试验是产生特异性 抗体和建立农药残留快速检测技术研究最基础和最关键的步骤。理想的半抗原一方面应具
备待测物的特征结构，特别是立体化学特征，另一方面半抗原与载体连接后应保证待测物 的特征结构能最大程度地为免疫活性细胞识别和结合，以制备出具有预期选择性的抗体。 ①半抗原通常由待测物衍生化制备，或由原料合成，待测物的代谢或降解产物往往是有用 的半抗原；②除待测物特征结构外，在半抗原的未端需有可直接或间接与载体蛋白质偶联 的活性基团；③在活性基团与载体之间，必须有一定长度的间隔臂，以便使半抗原突出于
载体表面，易为有机免疫系统识别；④间隔臂应远离待测物的特征结构部分和官能团；⑤ 半抗原的设计应考虑到农药原药和有毒理学意义的代谢物，以及测定对象是单一的农药或 某一类农药；⑥机体的免疫应答是个十分复杂的生化过程，半抗原诱导的抗体的选择性和 亲合性尚难预测，多数情况下宜合成几种结构的半抗原进行研究。
氟虫腈，商品名锐劲特，是拜耳作物科学公司(原罗纳普朗克农化公司)于1987年 开发出来的一种苯基吡唑类杀虫剂，其杀虫谱广，对害虫以胃毒作用为主，兼有触杀和一 定的内吸作用，对蚜虫、叶蝉、飞虱、鳞翅目幼虫、蝇类和鞘翅目等重要害虫有很高的杀 虫活性，对作物无药害，与常规农药无交互抗性。适用于水稻、蔬菜、棉花、烟草、马铃 薯、甜菜、大豆、油菜、茶叶、苜蓿、甘蔗、高粱、玉米、果树、森林、观赏植物、公共 卫生、畜牧业、贮存产品及地面建筑等防除各类作物害虫和卫生害虫。该品种同时获得多 国专利，全球销售额突破l亿美元，成为农药杀虫剂中支柱产品之一，在90个国家销售。
氟虫腈对水稻二化螟、稻飞虱、蝗虫、小菜娥等害虫有较好的防治效果。随着该农药 在全球的销量不断上升，以及人们对农药的误用、滥用，环境样品中氟虫腈的残留情况日 趋严重。而且该农药具有慢性神经毒性作用，300mg/kg的经口剂量可致小鼠甲状腺癌，被 定为C类致癌物质。尤其是该农药对水生甲壳类动物鱼、虫下、蟹的毒性特高(剧毒)，对 蜜蜂的毒性也相当高(高毒)，并且在环境中代谢缓慢，其中有两种代谢产物的毒性高出 母体农药对哺乳动物毒性的10倍以上，且在生物体脂肪内有富集作用，是一种生态环境 毒副作用较大的农药，需要对其进行严格的监控。
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种能最大程度保留了氟虫腈的化学结 构，又由具有可调节长度的连接臂的半抗原制备的人工抗原、人工抗体；以及此类抗原、
抗体的用途。
本发明提供一种氟虫腈人工半抗原，是最大程度包含氟虫腈的结构，又具有可以与氨
基酸偶联的基团-COOH，它的分子结构式为
本发明的氟虫腈人工半抗原FHS的合成方法，是通过这样的技术方案来实现的-以氟虫腈原药1为原料，通过与丁二酸酐反应得到4- G-腈基-l- (2， 6-二氯-4-(三
发明内容
氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亚磺酰基)-111-吡唑-5-胺基)-4-氧代丁酸，即化合物2， 反应路线如下所示
本发明的氟虫腈半抗原化合物FHS的合成方法进一步描述如下 氟虫腈原药与丁二酸酐(克分子比为1: 3)于吡啶溶剂中，在4-二甲氨基吡啶(DMAP) 的催化下，60 70t下反应24小时，反应结束后，旋转蒸发干溶剂，调酸后乙酸乙酯提 取有机物；乙酸乙酯层用饱和盐水洗涤至中性后用7 8^NaHC03溶液提取，NaHC03水层调 酸后用乙酸乙酯提取水层；该乙酸乙酯层经无水NaS04干燥，浓縮，硅胶板分离(乙酸乙酯石油醚甲酸二20: 80: 1.0，体积比，下同)，得白色固体物质氟虫腈半抗原FHS。 本发明还提供了上述半抗原化合物的用途是用作动物免疫的抗原体系的原料。 基于上述氟虫腈人工半抗原FHS制成的氟虫腈人工抗原分子结构式为白质的结合比在5: 1 100: 1;该蛋白质可选用牛血清白蛋白或卵清蛋白。
本发明还提供了氟虫腈特异性抗体，是用上述氟虫腈人工抗原免疫小白鼠或兔子所得到的、能与氟虫腈发生特异性免疫反应的单克隆或多克隆免疫球蛋白G。
本发明同时提供了上述氟虫腈特异性抗体的用途，用于建立氟虫腈快速检测的直接和
间接竞争酶联免疫吸附分析技术、并进一步开发成氟虫腈残留分析的直接竞争或间接竞争
酶联免疫吸附测定试剂盒，可用于快速检测食品、农产品(蔬菜、稻米等)和环境样品中 (土壤样品或水样品)氟虫腈的残留量。
为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的
以合成出的半抗原化合物FHS与蛋白质偶联制备人工抗原，包括免疫抗原和包被抗
原，然后按照常规方法用免疫抗原对兔子、白鼠等动物进行免疫， 一段时间后对活体动物<formula>formula see original document page 5</formula>为半抗原，与蛋白质共价偶联合成的，其中半抗原与蛋
进行少量采血检验，当检验动物体内的抗血清的效价达到一定程度时，杀灭动物，制备大 量抗体(多抗血清采用兔子颈动脉放血；单抗采用取脾融合后高通量筛选能分泌特异性抗 体的细胞株，后体外大量制备小鼠腹水)，用此氟虫腈的多克隆或单克隆抗体建立酶联免 疫吸附法(ELISA):
(l).将所述半抗原FHS与抗体分别与辣根过氧化物酶共价偶联制备酶标半抗原和酶标 抗体。用所述的包被抗原或抗体包被聚苯乙烯微孔板，加入待测样品(或氟虫腈标样)与 酶标记物的混合液，氟虫腈、酶标记物与包被在微孔表面的包被原或抗体发生竞争性免疫 结合反应，洗涤去除游离物，加入酶的底物和显色剂，酶促显色反应的强度与结合在包被 原或抗体上的酶标记物的量成正比，与样品(或标样)中氟虫腈的含量成反比，据此建立 氟虫腈直接竞争酶联免疫吸附分析技术。
(2)用所述的包被抗原包被聚苯乙烯微孔板，加入待测样品(或氟虫腈标样)再加入 所述抗体稀释液，氟虫腈与包被在微孔表面的包被原与抗体发生竞争性免疫结合反应，洗 涤去除游离物，加入酶标二抗，孵育、洗涤后加入酶的底物和显色剂，酶促显色反应的强 度与结合在包被原或抗体上的酶标记物的量成正比，与样品(或标样)中氟虫腈的含量成 反比，据此建立氟虫腈间接竞争酶联免疫吸附分析技术。
用本发明的抗原体系免疫动物，所得的抗体的效价、特异性、亲和力都比较好。采用 ELISA方法检测氟虫腈，最低检测限可达7.6ug/L(0.0076ppm)，检测灵敏度高。
具体实施例方式
实施例1氟虫腈半抗原的合成
一种氟虫腈人工半抗原FHS，分子结构式为
是用作动物免疫的抗原体系的原料。
上述氟虫腈人工半抗原FHS合成方法如下
250ml三口烧瓶中加入4.51g96.7X的氟虫腈原药(0.01mol)，3.0g丁二酸酐(0.03mo1)， 200ml吡啶(用KOH干燥重蒸过的)，搅拌均匀后加入0.6g4-二甲氨基吡啶(DMAP)，反 应体系抽真空，通入N2气，磁力搅拌60-70'C反应24小时。待反应液冷却后，旋转蒸发
干溶剂，得棕色油状物，加入50ml稀盐酸将剩余的吡啶除去，再加入30ml乙酸乙酯溶解 其中的油状物，转移至250ml分液漏斗分层，水层再用乙酸乙酯提取2次，30ml/次；合 并乙酸乙酯层，用饱和盐水洗涤至中性后用7 8XNaHC(V溶液提取4次，30ml/次；30ml 乙醚去杂，NaHC03水层用浓盐酸调至ra至3-4，然后用乙酸乙酯提取水层3次，30ml/次； 该乙酸乙酯层经无水NaS04干燥，浓縮称重得1.3g。收率为24.2%。硅胶板分离(乙酸乙 酯石油醚甲酸=20: 80: 1.0)，得白色固体物质氟虫腈半抗原FHS。 半抗原化合物FHS (即化合物2)的结构鉴定
取上述合成的产物分别经ESI-MS和'H-NMR测定其分子结构。质谱(MS， +cESI) 测定结果m/z为535 (M-H)+(100%),537 (M+2-H) + (66.7%)，可以看出化合物2的分子量 为536，分子中含有两个C1。
核磁共振氢谱数据ifiNMR (400MHz, CDC13, Sppm):
2.45 (t, 2H, -C玩)；2.56 (t, 2H, -COOHC玩)；7.12 ， (s, 2H,-Ar77); 10.21 (s, 1H,國N//)。 元素分析(％，计算值)C: 35,84 (35.76); H: 1.59 (1.50); N: 10.52 (10.43) 经质谱和核磁共振氢谱证明该化合物为4- G-腈基-l- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)
-4-(三氟甲基亚磺酰基)-111-吡唑-5-胺基)-4-氧代丁酸，分子式为Q6HsN4Cl2F6S04)，即
化合物2。
实施例2氟虫腈人工抗原及抗体的制备
一种氟虫腈人工抗原，分子结构式为
这种氟虫腈人工抗原，是由氟虫腈半抗原FHS与蛋白质偶联制备的，半抗原FHS分
1 100: 1，该蛋白质可选用牛血清白蛋白或卵清蛋白。
一种氟虫腈特异性抗体，是将上述氟虫腈人工抗原免疫白鼠或兔子所得到的、能与氟 虫腈发生特异性免疫反应的单克隆或多克隆免疫球蛋白G。用于检测食品、农产品和环境
NH — CO—(CH2)2—CO—NH—蛋白质
，其中半抗原化合物与蛋白质的结合比为5:
样品中氟虫腈的残留量；环境样品为土壤样品或水样品。 上述氟虫腈人工抗原、抗体制作方法如下
1、 免疫原的合成与纯化
免疫原的合成利用碳二亚胺法。将50 80微摩尔半抗原FHS，溶解在1 2mL 的N， N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的二环已基碳二亚胺和N —羟 基琥珀酰亚胺，让其在室温下反应过夜后，离心，取上清液500 800pL加入到4 8mL15 20mg/mL的牛血清蛋白的碳酸盐缓冲溶液中，加入时应缓慢，然后在伴有 磁力搅拌情况下反应4 6小时，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2 4次，然后用0.8 0.9%生理盐水透析，分装保存于—2(TC的冰箱中。
人工抗原的鉴定
按合成氟虫腈免疫抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，分别进行紫外 (200nm 400nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其结合 比。
经计算结果如下半抗原FHS与BSA的结合比为8:1。
2、 包被抗原的合成
包被抗原的合成利用混合酸酐法。将50 80微摩尔半抗原FHS，溶解在1 2mL 的N， N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的正三丁胺和氯甲酸异丁酯， 让其在室温下反应1小时后，取500 800nL反应液加入到4 8mL15 20mg/mL的 卵清蛋白的碳酸盐缓冲溶液中，加入时应缓慢，然后在伴有磁力搅拌情况下反应2 6小时，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2 4次，然后用0.8 0.9% 生理盐水透析，分装保存于一20'C的冰箱中。
人工抗原的鉴定
按合成氟虫腈免疫抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，分别进行紫外 (200nm 400nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其结合 比。经计算结果如下半抗原FHS与OVA的结合比为11:1。
3、 抗体的制备 1)多抗制备-
实验选用半周岁左右，体重为2 3公斤，健康的雄性家兔。每种免疫原免疫三 只兔子(由浙江省中医学院负责兔子的饲养工作)，分别编号为兔子1 3。
实验免疫剂量基础免疫为0.5 ~ 1.0mg/kg，加强免疫剂量为1.0 1.5mg/kg，用 生理盐水稀释适量FHS-BSA，加入等体积弗氏完全佐剂(加强免疫时采用弗氏不完 全佐剂)，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌 肉注射相结合的方法。背部皮下免疫6点，大腿肌肉注射2点，3周后进行加强免 疫，以后每隔2周再次加强免疫。从第三次免疫开始，每次免疫后第8天，从兔子 耳缘静脉采血，测定效价和特异性。
待免疫血清效价上去后，就可进行采血。本实验采用颈动脉取血法。采血后， 将采血瓶放置于37'C温箱中半小时，待瓶中的血液凝固，然后用接种针沿瓶内壁将 血块与玻璃脱离，再放到4。C冰箱中3 4小时，待血块收缩后，用毛细吸管将血清 吸入试管中，离心，分离出血清。
2)单抗制备
实验选用6-10周龄的BALB/C小鼠，20-22g，免疫5-10只小鼠。取6—8周龄 体重18-20gBALB/C雌性小鼠，将制备的FHS-BSA与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳 化后，经背腹部皮下多点注射，剂量为5(^g/每只，以后每隔3周，取抗原(与一免等剂 量)和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔和皮下注射加强免疫，加强免疫共4次， 末免以加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。后经3-4次有限稀释法 克隆筛选得到一株细胞株5B6，经多次体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长， 并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于抗体制备和液氮保存。
抗体的纯化
辛酸-硫酸铵盐析法是一个经典的方法。辛酸在偏酸性的条件下能将血清中除IgG以外 的蛋白质都沉淀下来中，上清液中只有IgG。辛酸加入因抗体的来源不同而不同，人血清 为70ul/ml，兔血清为75ul/ml,小鼠血清为40ul/ml，小鼠腹水为33ul/ml。这种方法IgG的回 收率达卯％以上。最后将抗体制成冻干粉，分装，-20匸保存。
抗血清效价测定
免疫原复合物按常规方法免疫了三只兔子。从加强免疫第二次开始，在每次免 疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价。第5
次免疫后，兔子获得了高效价的抗体，抗血清的效价为1: 6.4xl04 (指OD49加m值
等于l.O时的稀释倍数)。
BALB/C小鼠腹腔注射降植垸0.3ml/只，7—10天后同法注射单克隆细胞(5B6)
"106 2><106个(0.4ml/只)，待小鼠腹腔明显胀大后抽取腹水，离心除去油脂沉淀 后，即得小鼠腹水McAb,腹水采用辛酸-硫酸铵法纯化，腹水效价为1: 2.56x105。 抗体的特异性
用具有多种抗原决定簇的免疫原(蛋白质或多肽)制备的抗体，其中含的抗体 分子往往是混合体。当有甲、乙两种抗原，其分子结构中具有相同或部分相同的抗 原决定簇时，甲抗原可与乙抗原的抗体反应，而乙抗原也可与甲抗原抗体反应，称 为交叉反应。抗体的特异性就是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结 合能力的比较。常用交叉反应活性作为评价的重要标准。交叉反应越小，抗体的特 异性则越好。
将特异性抗原及其类似物做系列稀释，分别与同一种FHS-BSA抗体，按制作标 准曲线同样方法制作标准曲线，并在曲线上找出抑制率50%的剂量和类似物抑制率 50%时的用量。然后计算出各类似物的交叉反应率。
抗FHS-BSA抗体(多抗为例)对各类似物的交叉反应率氟虫腈100%,乙硫 氟虫腈6.4%,氟虫脲0.44%,伏虫隆0.27%,氟乐灵0.36%,三氟氯氰菊酯<0.82%, 定虫隆1.3% 。
由此可知，所制备的抗体的特异性较强。
实施例3氟虫腈酶联免疫吸附测定方法建立与鉴定
1、 氟虫腈ELISA测定方法的建立及其工作条件和基本参数
将所述半抗原FHS与抗体分别与辣根过氧化物酶共价偶联制备酶标半抗原和酶标抗 体。用所述的包被抗原或抗体包被聚苯乙烯微孔板，加入待测样品(或氟虫腈标样)与酶 标记物的混合液，氟虫腈、酶标记物与包被在微孔表面的包被原或抗体发生竞争性免疫结 合反应，洗涤去除游离物，加入酶的底物和显色剂，酶促显色反应的强度与结合在包被原 或抗体上的酶标记物的量成正比，与样品(或标样)中氟虫腈的含量成反比，因而可根据 已知量农药的标准线和待检样品的抑制率，推算出待测农药的浓度。
2、 酶标抗体的制备
采用改良过碘酸钠法，将抗体与等量的辣根过氧化物酶(HRP)偶联。偶联物加入甘 油，混匀，分装，-20°〇保存。
3、 酶标半抗原的制备
采用混合酸酐法，半抗原被活化后偶联到HRP上，反应液中HRP的浓度为10mg/ml (半
抗原FHS与HRP的摩尔比为20: 1)。反应完后加入等体积的甘油，混匀，分装，-20 °C保存。
4、 抗原抗体最适工作浓度的确定(例包被抗体法，下同)
用方阵滴定法，同时稀释特异性抗体和酶标半抗原。在同一包被抗体浓度下， 随着酶标半抗原的稀释，所得的OD值呈下降趋势，同样在同一酶标半抗原稀释浓 度下，随着包被抗体浓度的下降，所得OD值也呈下降趋势。通常选择OD值1.0 左右时的抗体和酶标半抗原浓度作为工作浓度。从实验可知，当抗FHS-BSA抗体 (FHS-Ab) 4.lPg'ml/1，酶标半抗原FHS-HRP浓度为1.51^g'ml/1时OD值约等于 1.0。
5、 标准曲线和检测灵敏度
从低温冰箱中取出FHS -Ab，使之完全解冻后用包被液稀释成工作浓度下的包 被抗体溶液(FHS-Ab: 4.1^mL—1)。 96孔微量反应板用蒸馏水洗涤后，每孔加入 上述包被液100pL，于37'C温箱中孵育2h。甩掉包被液，用PBST缓冲液洗涤，每 孔加入封闭液300pL，于37'C温箱中孵育0.5h。甩掉封闭液，用PBST缓冲液洗涤， 加入预先配制的氟虫腈各浓度标准液50pL/孔，每浓度4孔重复，再加入预先配制 的对应的酶标半抗原稀释液(FHS-HRP酶标半抗原1.5ngTnl/1) 50pL/孔，设不加 药对照和空白对照。放入37'C温箱中孵育lh，甩去孔内液体，用PBST溶液洗涤。 加入OPD-过氧化氢底物溶液1 ，3 7 。C温箱中孵育15min后加入2mol/L H2S04
50pL/孔终止反应。在酶联仪上测定4卯nm波长下的吸光值。根据抑制与农药浓度 之间的半对数关系作图即得到标准曲线。
ELISA方法的标准曲线以抑制率与农药浓度的半对数曲线表示，抑制率以下式 、，幼 , 、 (ODmax-ODmin) -(ODx-ODmin)
计算抑制率(％) <formula>formula see original document page 11</formula>
<formula>formula see original document page 11</formula>
式中ODmax为不加药时的吸光值，ODx为农药X时的吸光值，ODmin为空白 对照孔的吸光值。
由上述公式计算得氟虫腈各浓度的抑制率，作图。用FHS-Ab抗体测定时， 150-43.2ng'I/1， I2o = 7.6lig丄"。从图中还可知，氟虫腈在3-500ng'I/1范围内，抑制 率与氟虫腈浓度的对数值呈显著的线性关系，FHS -Ab的相关系数为r=0.9833。
6、 精密度
在ELISA实验中，常采用批内和批间误差来表示其精密度。
1) 批内误差以标准曲线的批内平均变异系数来表示。标准曲线各剂量点的 批内平均变异系数CV%=4.6 %。
2) 批间误差以5块不同板上的测定结果进行平均，求得标准曲线各剂量点 的批间平均变异系数CV% = 11.0%。
从批内和批间的数据可以看出，氟虫腈含量高的样品在测定过程中，其重复性 较好，批内批间的变异也较小，且批内批间相差也较小。
7、添加回收率试验
样品前处理方法
水样:水样经过滤，分别添加氟虫腈的标准溶液，使水样中氟虫腈含量分别为lOpg丄-1 和2(^g，1/1 ，设0水平的对照备用。
土样土样风干后过40目筛，称取l.Og(精确至O.OOlg)过筛样品，加入氟虫腈标准 液，使土样中的氟虫腈含量分别为10^ig.L"和5(Hig.L/1，设O水平的对照，再以2mL乙 腈旋涡震荡提取lmin。离心(4000卬m,5min)，吸取lmL上清液，氮气吹干，精确加入一 定量的PBS (含10%甲醇)，旋涡震荡lmin，备用。
稻米称取5g预先捣碎的样品，加入3mL水，搅拌成均匀湿粉状，静置30min， 加入氟虫腈标准液，使样品中的氟虫腈含量分别为50pg丄"和100(ig'L—、设O水平的对 照，再以10ml乙腈震荡提取lmin，加入lg氯化钠和4g硫酸镁，振摇1 min，离心(4000rpm, 5min)，吸取lml上清液，氮气吹干，加入一定量的PBS (含10%甲醇)，旋涡震荡lmin，
备用o
ELISA测定回收率
在已包被好的96孔板内每孔加入系列提取浓縮液50pL，重复4孔，再每孔加 入酶标半抗原稀释液50pL，空白对照孔加入100pL PBST，同时作标准曲线。盖好 板，37'C孵育1小时，甩去孔内液体，用PBST溶液洗涤。加入OPD-过氧化氢底物 溶液100^L/孔，37。C温箱中孵育15min后加入2mol/L H2SO4 50pL/孔终止反应。在 酶联仪上测定490nm波长下的吸光值。根据各添加样品的抑制率，查标准曲线计算 出氟虫腈浓度并计算回收率。
以FHS-Ab建立的ELISA方法，经分析可知，该方法对水样lO^g'I/1添加，平 均回收率为卯.2%，平均变异系数为9.85%， 20Pg丄"添加，平均回收率为86.7%，
平均变异系数为4.53%;该方法对土样10Pg丄"添加，平均回收率为72.3%，平均 变异系数为12.1%， 20Pg丄"添加，平均回收率为81.2%，平均变异系数为7.8%; 该方法对稻米样50Pg丄"添加，平均回收率为75.4%，平均变异系数为11.4%， 100Pg丄"添加，平均回收率为112.0%，平均变异系数为8.1%，均符合农药残留分 析的要求，可用来实现氟虫腈在环境及蔬菜样品中农药残留的快速检测。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明 不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直 接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1、一种氟虫腈人工半抗原，其特征在于它的分子结构式为
2、 一种如权利要求1所述的氟虫腈人工半抗原的合成方法，其特征在于包括下列步骤-克分子比为1:3的氟虫腈原药与丁二酸酐于吡啶溶剂中，在4-二甲氨基吡啶的催化下，60 70GC下搅拌反应24小时,生成4- (3-腈基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基 亚磺酰基)-1H-吡唑-5-胺基)-4-氧代丁酸。
3、 一种氟虫腈人工抗原，其特征在于它的分子结构式为<formula>formula see original document page 2</formula>
4 、 一种氟虫腈特异性抗体，其特征在于是用分子结构式为<formula>formula see original document page 2</formula>的氟虫腈人工抗原免疫白鼠或兔子所得到的、能与氟虫腈发生特异性免疫反应的单克隆或多克隆免疫球蛋白G。
5、 一种如权利要求4所述的氟虫腈特异性抗体的用途，其特征在于用于检测样品中氟 虫腈的残留量。
全文摘要
本发明公开了一种氟虫腈人工半抗原，其分子结构式为(Ⅰ)，本发明还公开了上述氟虫腈人工半抗原的合成方法。本发明还公开了一种氟虫腈人工抗原，其分子结构式为(Ⅱ)，以及用该人工抗原制成的氟虫腈特异性抗体；该种抗体能用于检测样品中氟虫腈的残留量。
文档编号C07K14/76GK101100456SQ200710070228
公开日2008年1月9日 申请日期2007年7月26日 优先权日2007年7月26日
发明者朱国念, 王春梅, 程敬丽, 郭逸蓉 申请人:浙江大学