幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体及其应用的制作方法

专利名称：：幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及重组单克隆抗体，特别涉及一种幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体及其应用。
背景技术：
：自1983年Warren和Marshall从胃粘膜组织中发现幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)以来,大量研究已经表明该菌是引起慢性胃炎和胃溃疡的最常见原因，在胃溃疡的复发及胃癌的发生中起到重要作用。Hp的感染非常普遍，发展中国家高于发达国家，发展中国家流行特征为儿童期易感型，婴幼儿甚至出生几个月的新生儿都可能受到感染，并以每年3-10%的速度上升，因各种体检未将Hp感染的检查作为常规指标，多为引起临床症状就诊时才发现，一旦感染，将终身受累，自愈率几乎为零。感染者中慢性胃炎的发病率为45-85%、消化性溃疡为10-20%、胃癌和淋巴瘤为40.61/10万。在我国普通人群中的感染率为50-80%，并以每年1-2%的速度增加。预防Hp感染，对保护人群健康具有重要的现实意义。目前，已发现Hp的毒力因子有多种，如鞭毛、黏附因子、尿素酶、蛋白水解酶、毒素相关蛋白、细胞空泡毒素(vacuolatingcytotoxinA，VacA)等，其中VacA是一种重要的致病物质。1988年，Leunk首先发现Hp具有使真核细胞空泡变性的毒素，并命名为细胞空泡毒素(VacA)。1992年，Cover和Blaster提纯了该毒素。大多数学者认为VacA属于A-B型结构的细菌毒素，即37000Da片段是毒性亚单位，58000Da片段是结合亚单位。其致病机理尚未完全明了，多认为VacA可通过受体介导的内吞作用进入细胞内，引起内吞作用障碍，最终导致细胞内空泡样变性；同时能够在胞浆膜上形成通道与增强极化上皮单层细胞的渗透性，导致细胞死亡。流行资料表明虽然50%-60%人群感染Hp,但临床上仅有15%的感染者出现症状。Hp的其他毒力因子几乎存在所有的菌株，因此不能解释Hp感染后的不同临床表现。而编码VacA的基因存在所有菌株中，但只有50%-60%菌株表达，感染者是否出现临床症状与感染菌株的毒力有关。因此诊断VacA产毒株感染在临床上具有重要意义，针对VacA的防治措施也具有重要价值。编码vacA基因的DNA大约3.8kb。Atherton等发现Hp的vacA基因内存在三种不同的信号区序列(sla,slb，s2)和两种不同的中间区序列(ml，m2)，据此可将Hp分为不同的vacA基因亚型。vacA基因型有很强的地区差异性，研究表明我国基因型大多为slm2型。纪徐准等对五株有代表性的中国Hp菌株进行vacA基因测序，然后用比较基因序列差异距离的方法分析，发现四株中国m2型vacA基因彼此相似，其基因差异距离明显不同于同型西方菌株。编码毒性亚单位及输出段的基因在中国菌株间彼此相似，而与西方菌株相比则形成独立的一组。由于vacA基因呈多态性，导致表达蛋白结构的差异。因此针对中国株的vacA基因产物用于诊断和防治更适合国内临床。现有技术已成功地表达了VacA重组蛋白，并鉴定其具有良好的抗原性与免疫原性，由于制备方法的烦琐及各种影响因素的存在，目前尚未制备出重组VacA单克隆抗体。
发明内容本发明的目的是(1):提供一种能持续稳定分泌幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体的杂交瘤细胞系ZYA2、ZYB5、ZYC8、ZYD4及一种利用该杂交瘤细胞用同系小鼠体内诱生法获得的抗幽门螺杆菌重组VacA蛋白的单克隆抗体(针对中国株的重组VacA单克隆抗体)。(2)、提供该单克隆抗体在制备诊断VacA阳性株感染的ELISA试剂盒中的应用以及幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体在制备相应疫苗和治疗VacA阳性株感染的试剂中的应用。采用的具体技术方案如下-一种能持续稳定分泌幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体的杂交瘤细胞系ZYA2、ZYB5、ZYC8、ZYD4，它们由以下步骤制得采用基因工程诱导表达获取的幽门螺杆菌VacA重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的脾细胞、活性大于95%的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，克隆筛选能持续稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述免疫小鼠脾细胞与活性大于95%的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞按10:1比例进行细胞融合，细胞融合时所用促进剂PEG的分子量是4000，浓度是50%，细胞融合后置于96孔板中培养。在其制备步骤中于杂交瘤细胞融合后7-10天开始检测培养上清中的抗体。所述的杂交瘤细胞用同系小鼠腹腔接种体内诱生法获得抗幽门螺杆菌重组VacA蛋白的单克隆抗体。其中腹腔接种杂交瘤细胞的剂量1X107毫升，体积是0.5毫升。整个制备工艺流程如附图1所示VacA重组蛋白的制备通过BLAST对纪徐准测序的五株有代表性的中国Hp菌株毒性亚单位进行同源性比较，得到一个高度同源的基因片段为目的基因。以Hp(AF050320)标准株的vacA基因序列为依据设计引物，以临床菌株基因组为模板，经PCR扩增，从vacA基因中扩增出毒性片段V，克隆至原核表达载体PQE-30中，转化表达菌DH5ci大量诱导表达。重组质粒PQE-30-V的序列分析表明，所得序列完整，与文献中国菌株相比有高度的同源性。重组质粒转化表达菌DH5a大量诱导表达后，用N;T-NTA树脂提纯表达蛋白，SDS-PAGE分析可见单一条带，图象软件分析表明纯度可达93%以上。Westernblot鉴定NC膜显色后在相对分子量27000处出现相应的条带，大小与预期的一致，表明重组蛋白具有良好的抗原性；Bradford法测定重组蛋白含量为0.8mg/ml;用HelicoBlot试剂盒检测重组蛋白的兔抗血清与免疫前正常血清鉴定，可见重组蛋白的兔抗血清VacA抗体呈阳性，而对照为阴性，表明重组蛋白具有良好的免疫原性。此重组质粒PQE-30-V保存于本实验室。本发明采用杂交瘤技术制备抗幽门螺杆菌重组细胞空泡毒素VacA毒性片段的单克隆抗体，取得了成功，在制备过程中应用到以下关键技术A.免疫BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合比例本发明选用免疫BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合比例为10:1。B.融合促进剂的选择本发明选用分子量为4000，浓度为50%的PEG作为融合促进剂。原理细胞融合是实验的中心环节。融合时选用PEG作为融合促进剂，PEG分子量1000—6000均可用，最好用4000。PEG的典型浓度范围为30%一50%,低于30%融合率低，高于50%时有毒性。PEG的分子量为4000时，以30%，40%,50%三种浓度作比较，结果表明50%的融合率相对较高而毒性相对不大，可作为细胞融合的适宜浓度。当PEG的浓度增加到50%时，PEG可能与邻近膜的水分相结合，使细胞之间只有几个埃的空间水分被代替，由此降低细胞表面的极性，导致脂双层不稳定，引起细胞膜的融合。同时，为保证融合的成功，骨髓瘤细胞的活性也相当重要，只有活性大于95%时，才能保证融合的成功。本发明所用的PEG分子量为4000，浓度为50%，获得良好融合效果。值得注意的是在操作过程中，动作要轻柔，注意防止污染。加不完全培养液时，应尽量慢，避免液体加入过多、过快，导致细胞涨破死亡，因为在离心和高浓度的PEG的作用下，由于脱水而皱縮的细胞会因为加入不完全培养液而很快的膨胀，使细胞处于一种不稳定的状态中。当加入液体太快、太多，细胞可能涨破。因而，当处于高渗下的细胞在缓慢滴加不完全培养液过程中逐步与外环境相平衡时，处于不稳定状态下的细胞膜就很容易融合在一起。C、融合细胞培养板的选择本发明最好选用96孔板培养融合细胞。原理细胞融合后可置于24孔板和96孔板中培养，最好选用96孔板培养，其优点如下1)细胞克隆生长更分散，一旦形成克隆多已初步克隆化，很有可能在原代生长中就可得到单个杂交细胞的克隆，从而增加了建株的机会。2)可减少在同一孔中不同杂交瘤细胞的竞争性生长，从而避免非分泌性杂交瘤细胞的过度生长而压抑或掩盖有分泌单抗能力的杂交瘤细胞。3)96孔板的孔容量只有24孔板容量的1/5，所以对单个杂交瘤细胞克隆分泌的抗体可起一定的浓縮作用，从而相应提高了筛选抗体的灵敏度。另外融合后的细胞于96孔板分布的密度也不宜过高(5X106cell/ml)以有利于后期的抗体筛选和亚克隆。本试验中于96孔板中每孔加50ul，每只小鼠滴加2块96孔板。D、取杂交细胞培养上清检测抗体的时间本发明采用杂交瘤细胞融合后7-10天开始检测培养上清的抗体。原理由于经ELISA检测为阳性的孔中的杂交瘤集落可能不是来自于单个细胞，可能混有不分泌抗体的克隆，且不分泌抗体的克隆具有代谢优势，它比分泌抗体的克隆生长更快，所以要及早进行抗体检测和克隆化培养，一旦检测出阳性孔后，愈早克隆化愈好，以避免分泌抗体的克隆被不产生抗体的杂交细胞过度生长所淹没。E.制备VacA单克隆抗体时，小鼠腹腔接种杂交瘤细胞的数量和浓度本发明在用小鼠腹腔接种制备单克隆抗体时，接种的杂交瘤细胞总量为lX107ml，体积为O.5ml。原理如下腹腔接种以大量制备单克隆抗体时，腹水瘤的形成和单抗的产量受到许多因素的影响，包括液体石蜡预注射的剂量、从液体石蜡引发到腹腔接种之间的时间间隔、腹腔接种的杂交瘤细胞数量和浓度、杂交瘤细胞本身的生长情况及小鼠的品系、性别和年龄等因素。其中，接种的杂交瘤细胞数量和浓度为重要因素。由于接种体积一般均为0.5-lml，因而接种浓度随接种细胞总数而变化。本发明在制备腹水时，采用的杂交瘤细胞总量为lX107ml，体积为0.5ml，全部形成腹水，且产量较高。本发明对杂交瘤细胞株及单克隆抗体进行了各种指标的鉴定，结果如下1.杂交瘤细胞染色体检查取杂交细胞株染色后进行染色体计数，经统计学处理，结果杂交瘤细胞染色体数为90士4条，SP2/0骨髓瘤细胞为64士3条，小鼠脾细胞为40条；可见骨髓瘤细胞的标志性染色体(中部及亚中部着丝点)以及小鼠脾细胞的端着丝点染色体。表明该细胞系确为小鼠B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞。2.杂交瘤细胞分泌单抗能力的鉴定ELISA检测细胞株经小鼠腹水产生的单抗的效价为1:1.28X104，表明该细胞株具有分泌高滴度抗体的能力。3.杂交瘤细胞株稳定性鉴定经方阵滴定确定VacA最适包板浓度为0.3ug/0.lml，以这个浓度的rVacA包板，可以保证间接ELISA对抗体的准确检测。共检测223孔，待测孔OD值/阴性孔OD值》2.1共有68孔，与肉眼所见相同，镜下见相应孔中有克隆的杂交瘤细胞生长；再经过两次克隆后，待测孔OD值/阴性孔0D值》2.l仅有25孔，分别为四株杂交瘤细胞来源，再次进行单克隆后，所有克隆孔ELISA检测均为阳性，说明杂交瘤细胞具有较好的稳定性。杂交瘤细胞株在体外连续传30代、反复6次液氮冻存复苏和液氮冻存1.5个月后复苏，分别以间接ELISA法测定，其分泌的单抗效价不变，腹水效价为l:1.28X104，表明杂交瘤细胞株稳定性好。4.制备的单抗的免疫球蛋白类别、亚类及轻链型别的鉴定是确认McAb的关键性指标，对McAb的纯化和应用具有重要的指导意义。本发明实验动物免疫共四次，免疫时间相对较长，采用杂交瘤细胞培养上清为样品，而避免使用含单克隆抗体的腹水，因为在腹水中还含有小鼠自身的各类Ig，会影响鉴定结果。用HyCultbiotechnology公司的抗体亚型检测试剂盒进行鉴定结果ZYA2为IgG2b类；ZYB5为IgM类；ZYC8和ZYD4为IgGl类。轻链均为K型。5.单抗的抗原结合特异性的鉴定免疫印迹分析在硝酸纤维素膜上，只在VacA抗原泳道区域出现一条明显的特异性条带(27KDa)，而在对照因素孔(即HpaA抗原泳道)无特异条带出现，表明该单克隆抗体能与VacA抗原发生特异性结合。重组VacA单克隆抗体的应用本发明用所制备的单克隆抗体，采用间接ELISA法，建立了检测胃粘膜标本上HpVacA抗原的试验方法，以诊断HpVacA产毒株感染，此试验方法可用于生产商品化的试剂盒。用建立的间接ELISA法对50份临床胃黏膜随机标本进行HpVacA抗原检测，其中以快速尿素酶试验(快速Hp检测试纸购自珠海克隆科技有限公司提供)，直接涂片镜检确定为Hp阳性的30份，阴性20份。同时与HelicoBlot试剂盒免疫印迹分析(惠州市爱立科生物有限工程公司产品，按说明书操作)比较。结果(见表l)完全一致。其中Hp阳性标本中，VacA的阳性率与文献报道的也相符，表明所建立的检测HpVacA抗原的间接ELISA法可进一步制备商品化试剂盒。表150份胃黏膜标本HpVacA抗原检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>利用本发明提供的单克隆抗体可制备诊断VacA阳性株感染的ELISA试剂盒，也可制备相应的疫苗和治疗VacA阳性株感染的试剂。本发明的有益效果是重组HpVacA单克隆抗体及制备方法国内外未见报道，该方法可用于大量制备VacA的单克隆抗体，制备的VacA单克隆抗体可用于生产诊断VacA产毒株感染的ELISA试剂盒，也可作为被动免疫制剂用于治疗VacA产毒株感染，在科研上还可用于免疫组织化学，以研究VacA的致病机制，具有巨大的商业价值。附图1制备重组VacA单克隆抗体的工艺流程图具体实施例(共ll例)实施例1动物免疫及血清抗体效价的检测(1)动物免疫取大约68周龄雌性SPF级BALB/c小鼠2只，将VacA重组蛋白用生理盐水配成20(ntg/ml的蛋白溶液，与福氏完全佐剂(购自北京鼎国)等比例充分乳化混匀后，取lml(蛋白含量为lOOPg/ml)混悬液分别于腹部、肘窝、腹股沟、颌下及颈部等皮下多点注射免疫，每只小鼠lml/次；间隔两周后，以同样剂量的VacA重组蛋白加福氏不完全佐剂的混悬液进行颈背部皮下多点注射，再次免疫；在细胞融合前三天，用VacA重组蛋白以100l^g/只腹腔注射进行加强免疫。共免疫3次。另取一只正常BALB/c小鼠作对照。(2)血清抗体效价的检测(间接ELISA法)方阵滴定法确定抗原和酶标抗体的最佳工作浓度分别以IO、6、3、1.5、lPg/mlVacA重组蛋白为抗原包被聚乙烯微孔板，100ul/L4。C湿盒中过夜后，分别加入免疫鼠血清和用样品稀释液倍半稀释(1:10、1:20、1:40、1:80、1:160……)的免疫鼠血清作方阵滴定，以同系未免疫小鼠血清为阴性对照，间接ELISA检测血清VacA重组蛋白的抗体，以最高稀释度的免疫血清达到阳性，且阴性对照OD值较低的抗原浓度，作为最适抗原包被浓度，再测定HRP标记羊抗小鼠IgG抗体的最佳工作浓度。确定的最佳工作浓度为VacA重组蛋白每孔100W(0.3ug)，HRP标记羊抗小鼠IgG抗体1:5000。血清抗体效价检测抗原包被取纯化的VacA抗原每孔(0.3ug)包被聚苯乙烯反应板，放湿盒中4。C过夜。弃包被液，以洗涤液洗涤3次并扣干，力B200W封闭液后置湿盒中4'C封闭2h，然后洗涤3次并扣干。检测抗体加入待检细胞培养上清，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。阴性对照加入相应的细胞培养液，每孔IOOW;阳性对照加入免疫鼠血清(1:1000稀释)，100W/孔;空白对照孔加入PBS，对照孔均设复孔。置湿盒中37t:温育1小时。加二抗每孔加100141:5000的HRP标记羊抗小鼠IgG抗体，置湿盒中37°C30min，洗涤3次并拍干。显色每孔加100W底物溶液，湿盒中37t:避光显色15-20min后，测定450nm处0D值即可判定结果。结果判定以空白对照孔调零，如待测孔OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍，即判定为阳性；如待测孔0D值小于阴性对照孔的1.5倍，即判定为阴性；如介于1.5和2.1之间，则为可疑阳性。(3)结果于加强免疫后的4天，测定小鼠血清抗体产生情况，2只小鼠血清抗体效价分别为1:320和1:640，选择效价为1:640的小鼠用于单克隆抗体的制备。实施例2骨髓瘤细胞悬液的制备融合前两周复苏骨髓瘤细胞(SP2/0)，待细胞生长稳定后，以终浓度为2(^g/ml8-氮杂鸟嘌呤完全培养液培养两周，筛选次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型细胞。于融合前48小时将SP2/0细胞进行传代培养，选取生长旺盛、形态良好、处于对数生长期的细胞。在融合前换新鲜培养液一次，用吸管轻轻吹下，收集于20ml离心管中；1000rpm，5-8分钟，将细胞重悬于50ml无血清培养液中，并调整细胞数为卜5X10Vml备用。满足细胞活性在95%以上。实施例3制备饲养细胞悬液取未免疫的小鼠，拨除眼球放血，分离血清作阴性对照。处死后，取5ml无血清培养液注入腹腔，无菌吸取腹腔巨噬细胞悬液，以无血清培养液离心洗涤一次(1000rpm，5分钟)；重悬浮于含次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶核苷(T)、氨基碟呤(A)的HAT培养液(调整细胞浓度2X10Vml，接种于96孔培养板，每孔O.lml含2Xl(f个细胞，于37'C、5%C02及饱和湿度条件下培养。实施例4制备脾细胞悬液在小鼠加强免疫后的第四天，将免疫小鼠摘除眼球放血，分离血清用于阳性对照；处死小鼠，消毒后无菌暴露腹腔，摘取脾脏，去除脂肪和结缔组织，用无血清培养液冲洗三次。将脾脏移入盛有5ml无血清培养液的培养皿中，置于200目不锈钢筛网上，用注射器针芯轻轻研磨脾脏，并用无血清培养液冲洗，收集脾细胞悬液，以1000rpm，5分钟，弃去上清液，重悬浮于无血清1640培养液中，离心洗涤一次，悬浮于不完全培养液中。每只小鼠约获得2.0X108个脾细胞，P/。台酚蓝染色后不着色细胞约占97%，调整细胞数为1.0X107ml。实施例5PEG融合细胞将制备的脾细胞和骨髓瘤细胞按1:6比例混合，在尖底塑料离心管中混匀成糊状，以1000rpm，5分钟，弃上清，用食指轻弹离心管底部，使细胞沉淀团块稍松散。将离心管置于37'C预温的盛水烧杯中，缓缓注入lml50%PEG溶液，静置90秒钟，立即加入37i:预温的30ml无血清培养液，使PEG稀释而终止细胞融合。以800rpm，8分钟，弃上清，重悬浮于40mlHAT培养液中。实施例6间接ELISA法筛选阳性克隆方法同实施例1(2)实施例7抗体阳性细胞的克隆化筛选用弯吸管吹打抗体阳性细胞培养板孔内的细胞，悬浮于完全培养液中。用血球计数板计数，用含20°/。胎牛血清的1640培养液调整细胞浓度至100、50、10个/ml。将杂交瘤细胞悬液接种于含有2X104词养细胞的培养板中，每孔加100W，使每孔分别含IO、5、l个细胞。在37'C、596C02及饱和湿度条件下静置培养，于显微镜下观察克隆形成情况并记录。1周后半量换液，以后每2-3天换液一次。克隆化培养后第14天，细胞集落长至l/4孔大，用ELISA法检测有无VacA抗体分泌。第16天再重复检测一次。第20天，取两次ELISA检测均为阳性且显微镜下观察为单克隆的孔进行第二次克隆化培养，方法均同于第一克隆化培养。第二次克隆化培养后5-7天再选择抗体分泌阳性且显微镜下观察是单克隆的孔进行第三次克隆化培养，及3次亚克隆，直至100%的克隆分泌特异性抗体为止。实施例8扩大培养将100%克隆分泌特异性抗体的阳性孔，在显微镜下观察培养至细胞集落约2/3孔大，转移细胞至24孔培养板，待其长至2/3孔大时，转移至96孔培养板，待细胞生长良好，并长至3/4孔大时，转移细胞至5ml培养瓶，当细胞长满瓶底3/4时，再传代培养。取阳性克隆孔细胞株采用有限稀释法进行4次克隆化，其中有四株细胞随着克隆次数增多，抗体阳性细胞生长孔从60%增至100%，其分泌的单抗可与重组蛋白VacA特异结合，表明得到了可分泌抗HpVacA单克隆抗体的杂交瘤细胞株。选取细胞形态较好的细胞生长孔进行扩大培养与冻存，并命名为ZYA、ZYB、ZYC和ZYD(ZY代表操作者和项目负责人姓氏"张、杨"拼音的第一字母)。实施例9VacA单克隆抗体的大量制备(1)腹水制备扩大培养阳性杂交瘤细胞按105个细胞/ml从96孔培养板、24孔培养板、6孔培养板、10ml培养瓶，逐步扩大培养。收集杂交瘤细胞1000rpm离心10分钟，收集杂交瘤细胞，并用无血清培养液洗涤1-2次，尽量洗去杂蛋白，计数然后配成浓度为107ml的细胞悬液。用106个细胞/只小鼠，无菌条件下腹腔注射一周前已腹腔接种无菌医用液体石蜡0.5ml/只的BALB/C小鼠(尤其经产母鼠较好)。杂交瘤细胞以腹水瘤形式在小鼠腹腔内大量繁殖。10-15天后小鼠腹部胀大，腹腔内出现腹水，此时即可收集腹水，3000rpm离心10分钟，取上清。(2)饱和硫酸铵盐析法初步纯化抗体用50%饱和硫酸铵将收集好的腹水用0.02mol/L、PH7.2的PBS4倍稀释。边摇边逐滴缓慢加入硫酸铵，使其浓度达到50%饱和度，然后静置2h以上，使其形成沉淀物。以12000rpm，15min，弃上清，将沉淀溶于原腹水体积2倍的PBS中。用50%饱和硫酸铵和33%饱和硫酸铵分级提取抗体(方法同上)交替进行2-3次，最后将沉淀溶于小体积的0.OIMPH7.2的PBS(磷酸盐缓冲液)。溶解物置于经处理后的透析袋中，以0.01MPBS于4r透析过夜即可得纯化的单克隆抗体。实施例10特性鉴定单克隆抗体的免疫球蛋白类别、亚类及轻链型别的鉴定是确认McAb的关键性指标，对McAb的纯化和应用具有重要的指导意义。抗体因分子量大小、带电量、溶解度及与抗原作用的不同分为不同的类型和亚类。本次实验动物免疫共四次，免疫时间相对较长，其中三株产生的抗体为IgG，另一株分别是IgM。不同抗体类型和亚类具有不同的效应功能，就鼠IgG而言，IgG2a、IgG2b、IgG3均能激活补体，IgGl反之。在增强吞噬细胞吞噬功能方面，IgGl最强，其次是IgG3、IgG2a，IgG2b。在本发明中，我们采用杂交瘤细胞培养上清为样品，而避免使用含单克隆抗体的腹水，因为在腹水中还含有小鼠自身的各类Ig，会影响鉴定结果。实施例11ELISA法检测胃粘膜标本HpVacA抗原1.技术流程经处理的胃粘膜一作为抗原包被酶标板(18小时，4°C)—洗板(3次)+封闭液(4小时，4°C)—洗板(3次)+制备的单克隆抗体一孵育(40分钟，37°C)—洗板(3次)+酶标抗体(辣根过氧化物酶标记)一孵育(30分钟，37°C)洗板(3次)+底物液一孵育(20分钟，37°C)+终止液(10分钟，避光)一显色2.关键技术(1)胃粘膜标本的处理将胃粘膜标本液氮研磨、破碎组织、低温离心取上清液。(2)最佳工作浓度利用方阵滴定法确定最佳工作浓度为胃黏膜标本包被浓度l:2，单抗稀释倍数为l:10，酶标二抗的稀释度为l:2500。(3)界值50份无Hp感染者胃黏膜检测结果OD，^平均值为0.25，标准方差是0.072，故阴阳性临界值为0.466，为了应用方便将临界值定为0.5。权利要求1、一种能持续稳定分泌幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体的杂交瘤细胞系ZYA2、ZYB5、ZYC8、ZYD4，它们由以下步骤制得采用基因工程诱导表达获取的幽门螺杆菌VacA重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的脾细胞、活性大于95％的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，克隆筛选能持续稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2、如权利要求1所述的能持续稳定分泌幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体的杂交瘤细胞系ZYA2、ZYB5、ZYC8、ZYD4，其中所述免疫小鼠脾细胞与活性大于95X的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞按10:l比例进行细胞融合，细胞融合时所用促进剂PEG的分子量是4000，浓度是50%，细胞融合后置于96孔板中培养。3、如权利要求1所述的能持续稳定分泌幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体的杂交瘤细胞系ZYA2、ZYB5、ZYC8、ZYD4，在其制备步骤中于杂交瘤细胞融合后7-10天开始检测培养上清中的抗体。4、一种幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体，其特征在于对权利要求1所述的杂交瘤细胞用同系小鼠腹腔接种体内诱生法获得抗幽门螺杆菌重组VacA蛋白的单克隆抗体。5、如权利要求4所述的幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体，其中腹腔接种杂交瘤细胞的剂量1X107毫升，体积是0.5毫升。6、一种幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体在制备诊断VacA阳性株感染的ELISA试剂盒中的应用。7、一种幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体在制备治疗VacA阳性株感染的试剂中的应用。全文摘要本发明涉及能持续稳定分泌幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体的杂交瘤细胞系，特别涉及对该杂交瘤细胞用同系小鼠体内诱生法获得抗幽门螺杆菌重组VacA蛋白的单克隆抗体。可与幽门螺杆菌重组VacA蛋白特异性结合，制备的VacA单克隆抗体作为包被抗体可用于生产诊断VacA产毒株感染的ELISA试剂盒，也可作为被动免疫制剂用于治疗VacA产毒株感染，在科研上还可用免疫组织化学的方法，研究VacA的致病机制，具有巨大的商业价值。文档编号C07K16/18GK101096656SQ200710078498公开日2008年1月2日申请日期2007年5月24日优先权日2007年5月24日发明者张绍兰,杨致邦申请人:重庆医科大学