Betv1特异性抗体及其在预防和治疗Betv1诱导的疾病中的用途的制作方法

专利名称：：Betv1特异性抗体及其在预防和治疗Betv1诱导的疾病中的用途的制作方法Betv1特异性抗体及其在预防和治疗Betv1诱导的疾病中的用途本发明涉及用于治疗和预防过敏原引起的疾病的抗体和药物组合物。几乎100,000，000个过敏病人被主要桦树(白桦，Betulaverrucosa)花粉过敏原Betv1致敏，其为17kDa的蛋白，存在于属于壳斗目(Fagales)的树的花粉中并广泛分布于欧洲、北美洲、俄罗斯和澳大利亚(Breiteneder等人，1989)。编码Betv1的cDNA已被分离(Breiteneder等人，1989)。相当于天然Betv1野生型的重组Betv1在大肠杆菌(Escherichiacoli)中被表达(Valenta等人，1991;Ferreim等人，1993)。对树花粉和食物过敏的病人的IgE抗体对Betvl的识别平均为大约95%，他们中的几乎60%专门被Betv1致敏(Jarolim等人，1989)，而过敏原的识别依赖于构象的表位，因此需要折叠的分子。由于以前的体外和体内的广泛描述，重组Betv1分子经常被用于诊断和治疗目的(Valenta等人，1995，1996)。近来，生产出了主要桦树花粉过敏原的非致敏的表面暴露的肽，被鉴定为大小(25-32个氨基酸)足以诱导体内抗体反应(活性免疫)的肽。这些肽缺少折叠和过敏原性活性。但是，肽疫苗诱导了多克隆Betvl特异性IgG的产生(Focke等人，2004)。WO94/10194涉及源自壳斗目的树的肽。在EP1219300中描述了过敏原衍生物在生产用于治疗过敏症的药物中的用途。本发明的目标是提供治疗和预防桦树花粉过敏原Betv1或其片段引起的过敏性反应的方式和方法。因此，本发明涉及一种抗体或其衍生物在生产一种用于个体的被动免疫的药物中的用途，该被动免疫用于治疗和/或预防所述个体中因暴露于桦树花粉过敏原而引起的过敏性反应，其中该抗体结合至Betv1片段，其包含30-59个氨基酸(SEQIDNo.l)或75-104个氨基酸(SEQIDNo.2)。令人惊奇的是，结合至BetV1片段的抗体或其衍生物能够特异性地结合至桦树花粉过敏原Betv1，并且这种分子可用于抑制Betv1特异性IgE与所述桦树花粉过敏原的结合。根据本发明，抗体与表位的结合在Betv1的主要IgE结合位点和/或过敏原构象修饰的内部或与其紧密相关，以致IgE表位或仅其一部分对IgE来说不再是可接近的，导致IgE与所述过敏原的结合降低或甚至完全降低。实验数据表明带有不同的表位特异性的两个肽-特异性抗体的混合物不会产生较强的对IgE结合的抑制，这表明-一个抗体改变过敏原的构象可抑制第二个抗体(也是IgE)与所述过敏原的结合。为了生产抗体，各种宿主动物可通过注射Betv1抗原或其片段来免疫，特别是Betvl片段，其由氨基酸30-59(SEQIDNo.l)或氨基酸75-104(SEQIDNo.2)所组成。这些宿主动物可能包括例如猪、兔、小鼠、山羊和大鼠。最优选的多克隆抗体分离自人类个体。这种抗体的使用减少了免疫系统对来自抗原的"外源"抗体反应的风险。抗体可分离自这些动物的血清。根据本发明所述的抗体可制成静脉内、肌肉内、表皮下和局部使用。获得这些制剂的程序对技术人员来说是己知的。当然根据本发明也可以直接从暴露于Betv1过敏原的人类个体分离针对Betv1片段的抗体。从人类个体分离Betv1特异性抗体可由本领域已知的方法获得。这里所用的"抗体"是指完整的免疫球蛋白或通过例如各种肽酶消化或者重组而由其产生的片段。当然，根据本发明，一个分子，其包含与融合至其它蛋白或其片段的免疫球蛋白结合的抗原，也是本发明所指的抗体。"抗原结合区域"是指免疫球蛋白分子参与抗原结合的部分。抗原结合区域由重链和轻链可变区的N末端氨基酸残基形成。因此术语"抗体"是指，但不限于Fab，(例如通过胃蛋白酶在铰链区二硫键下消化一个抗体而产生的或通过重组方法产生的)，单链抗体(作为单多肽链存在的抗体)，更优选的单链Fv抗体(scFV)，其中一条可变重链和一条可变轻链被连起来(直接地或通过肽连接子)以形成连续肽、嵌合分子、人源化分子等等。本发明的抗体也包括通过化学、重组DNA技术、酶法修饰的衍生物，导致例如"技术修饰的抗体"例如合成抗体、嵌合或人源抗体，或其混合物，或抗体片段，其缺少部分或完全缺少恒定区，例如Fv、Fab、Fab，或F(ab)'2等。在这些技术修饰的抗体中，例如例如，轻链和/或重链的一部分或几部分可被取代。这些分子可能包括例如由一条人源化重链和一条未修饰轻链(或嵌合轻链)组成的抗体、或反之亦然。术语Fv、Fc、Fd、Fab、Fab，或F(ab)2在现有文献中有描述(HarlowE.禾口LaneD.,在"Antibodies,AlaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratory,1988)。本文中的抗体的"衍生物"是指蛋白质分子，其包括与本发明所述的全长抗体相关的一个或多个功能性活性。因此，根据本法明的衍生物也能够结合至Betv1片段，其包含氨基酸30-59(SEQIDNo.l)或氨基酸75-104(SEQIDNo.2)。本发明的抗体也包括经修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与抗体的共价连接。例如，但不限于，抗体衍生物包括经过以下修饰的抗体，例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/封闭基团衍生、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白相连等。任何的各种化学修饰可通过已知技术来实现，包括但不限于特定化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可能含有一个或多个非经典氨基酸。根据本发明所述的衍生物可能也包含片段，其仍能够结合Betvl片段，其包含氨基酸30-59(SEQIDNo.l)或氨基酸75-104(SEQIDNo.2)。(例如本发明所述的抗体的CDR区域)。根据本发明所述的抗体优选为单克隆抗体。这些抗体，其为针对特定抗原的抗体的均一群体，可通过任意技术获得，其可通过培养的持续细胞系生产蛋白。这些包括，例如，K5hler和Milstein的杂交瘤技术(1975，Nature256:495-497和美国专利号4,376,110)，人类B细胞杂交瘤技术(Kosbor等人，1983，ImmunologyToday4:72;Cole等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:2026-2030)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，1985，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,Inc.，77-96页)。这些抗体可以是任何免疫球蛋白类别包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和任何其亚类。产生本发明的mAb的杂交瘤可在体外或体内培养。体内生产高效价的mAb使其称为目前优选的生产方法。当然，也可以在真核、酵母、昆虫和植物细胞以及在植物中通过重组技术生产单克隆抗体。这些表达系统和从所述细胞中分离所述抗体的方法在本领域是已知的。令人非常惊奇的是，本发明所述的针对Betv1片段的抗体表现出与通过表达针对整个Betv1过敏原的哺乳动物(参见例如Focke等人2004)。特别考虑到多克隆抗体通常为针对多于一个表位。生产单克隆抗体导致比由抗血清获得的多克隆抗体更均一和纯的因此可再生的产物。为生产单克隆抗体而选择合适的肽，其可用于治疗和/或预防由于暴露于Betv1而引起的过敏性疾病，这不是微不足道的。例如，Lebeque等人(1997)研究了针对Betvl而制成的各种单克隆个体在与来自对所述过敏原过敏的病人的IgE的Betv1结合上的功效。这些研究在没有披露针对Betv1过敏原的区域生产的抗体的特异性的情况下，揭示出这些单克隆抗体增强了IgE与Betv1的结合，而不是减少了所述结合。因此令人惊奇的是，本发明所述的抗体强烈地抑制IgE与野生型Betv1的结合。根据本发明所说的抗体和包含所述抗体的疫苗制剂不仅可被用于治疗桦树花粉过敏原Betv1引起的过敏反应，也可预防这些反应，或将一个个体对于Betv1过敏原致敏。也可能用木发明所述的抗体或疫苗制剂在儿童或新生儿与桦树花粉接触前免疫儿童或新生儿。这种方法可防止Bevv1特异性IgE抗体的形成，因此防止在所述儿童或新生儿中对Betv1的敏感。特别有利的是向1至3岁内的儿童使用本发明所述的抗体，因为在这个年龄儿童对桦树花粉过敏原过敏。根据本发明的优选的实施方式，抗体为IgG抗体，特别是IgGl或IgG4同位型的.IgG抗体。Sellge等人(Clin.Exp.Allergy(2005)35:774-781)表明针对Betv1的IgG抗体通过形成较大的过敏原集合激活大多数细胞或嗜碱细胞而增强过敏性反应(JImmunol(1996)157:4953-4962)禾BDenepoux等人(FEBSletters(2000)465:39-46)。但是，使用本发明所述的针对Betv1片段的IgG抗体未表现出这些效果。因此可根据本发明使用IgG抗体。根据本发明更优选的抗体为非补体激活抗体，像人IgG4或鼠IgGl。根据本发明所述的抗体优选为鼠或人抗体。根据本发明的另外一个优选实施方式，该抗体为嵌合抗体。可以使用为生产"嵌合抗体"(Morrison等人，1984,Proc.Natl.Acad,Sci.,81:6851-6855;Neuberger等人，1984,Nature,312:604-608;Takeda等人，1985,Nature,314:452-454)而发展的技术，即通过将来自具有合适的抗原特异性的鼠抗体分子的基因和来自具有合适的生物活性的人抗体分子的基因接合。嵌合抗体为一个分子，其中不同的部分来自不同的生物种，免疫类别，亚类(同位型)，型和亚型，例如，那些具有来自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的。而且，本发明所述的嵌合蛋白可能包含大于一种特异性(二聚体(diabody)或四聚体(tetrabody))。根据本发明所述的抗体优选为人源化抗体。人源化抗体的方法或生产较低免疫性的非人类抗体的方法是熟知的。人源化的抗体为其中只有抗原识别位点或高变互补决定区(CDR)是非人源的，而所有的可变域的框架区域(FR)均为人类基因产物。非人类抗体可通过本领域巳知的任何方法人源化。在一个方法中，非人类的CDR被插入一个人类抗体或共有抗体框架序列。进一步的变化可被引入抗体框架以改变亲和性或免疫原性。接下来是为改善针对桦树花粉过敏原Betvl的片段的抗体，作为人类中的治疗，通过"人源化"单克隆抗体以改善其血清半衰期并使其在人类宿主中有较低的免疫原性(即防止人类抗体对非人类抗体反应)。人源化的原理在文献中己有描述，并为抗体蛋白的模的排列所促进。为了最小化结合补体的可能性，IgGl同位型的人源化抗体为优选。例如，一个人源化水平可通过产生嵌合蛋白实现，其包含感兴趣的非人抗体的可变区和人的抗体分子的恒定区(例如，Morrison等人，Adv.Immunol"1989,44，65-92)。Betv1特异性抗体的可变区可克隆自cDNA，其产生自由感兴趣的杂交瘤分离的mRNA。可变区基因片段被联接至编码人类抗体恒定区的外显子，并在合适的哺乳宿主细胞(例如骨髓瘤或CHO细胞)中表达结果产物。为达到更高水平的人源化，只有编码非人单克隆抗体基因的抗原结合互补决定区(CDR)可变区基因片段部分被克隆至人类蛋白序列(例如，Jones等人，Nature,1986,321,522-525，Riech-mann等人，Nature,1988,332,323-327，Verhoeyen等人，Science,1988,，Bio/Technology,1991,9,266-71)。围绕CDR3区域的人类抗体的(3叠片框架也可被修改以更接近地反映最初单克隆抗体的抗原结合域的三维结构(参见Kettle-borough等人,ProteinEngin.,1991,4,773-783,和Foote等人，J.Mol.Biol.，1992，224,487-499)。在可选的方法中，感兴趣的非人单克隆抗体的表面通过改变所选非人抗体的表面残基而被人源化，例如，通过定点突变，而保持所有的非人抗体的内部的和接触残基(Padlan,MolecularImmunol,1991,28,489-98)。本发明的另一个方面涉及与Betv1的片段结合的抗体或其片段，其特征为所述Betvl的片段由氨基酸30-59(SEQIDNo.l)或氨基酸75-104(SEQIDNo.2)组成。根据本发明所述的抗体优选为由杂交瘤分泌的单克隆抗体，其根据布达佩斯条约于2006年5月9日保藏于DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen,Braunschweig,Germany),其保藏号为DSMACC2782,DSMACC2783，DSMACC2785,DSMACC2784和DSMACC2786。本发明的另一个方面涉及疫苗制剂，其包含本发明所述的抗体。本发明的抗体可通过众多方式制成向哺乳动物特别是人使用。在一些实施方式中，抗体处于消毒的水溶液或在生物体液例如血清中。水溶液可为缓冲的或未缓冲的并且具有另外的活性或非活性成分。另外的成分包括用于调节离子强度的盐，防腐剂，包括但不限于抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂试剂和类似的，营养包括葡萄糖(glucose),葡萄糖(dextrose),维他命和矿物质。或者，抗体可制成以固体形式使用。抗体可与一些惰性载体或赋形剂结合，包括但不限于；结合剂例如微晶纤维素，黄蓍胶或凝胶；赋形剂例如淀粉或乳糖；分散剂例如褐藻酸，Primogel，或玉米淀粉；滑润剂例如硬脂酸镁；助流剂例如胶体二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或香味剂例如薄荷油或甲基水杨酸盐。抗体或其制剂可通过任何有效输送抗体到靶位的方法向哺乳动物使用。这些方法包括静脉内、肌肉内、皮下、口、鼻内、粘膜或皮肤剂型。根据本发明局部使用抗体或疫苗制剂为优选。磷酸缓冲液(PBS)为用于注射制剂和鼻内使用的优选载体。得到药学上有效量的治疗试10剂的抗体的剂量取决于众多因素。例如，年龄、敏感性、耐受性和病人的其它特质将影响剂量。而且，所用抗体的血浆水平和半衰期以及其对识别位点的亲和性，和其它类似因素在有效开药时需要被考虑。对于全身使用本发明所述的抗体，可使用介于大约1mg/kg-病人/天至大约500mg/kg-病人/天，优选为从大约5mg/kg-病人/天至大约250mg/kg-病人/天，更优选为从大约10mg/kg-病人/天至大约100mg/kg-病人/天的剂量，虽然由于其易于使用和成本合算，处于该范围低端的剂量为优选。剂量可被调整，例如，为了提供抗体的特定的血浆水平，例如在大约0.05至200吗/ml，更优选为大约0.1至100吗/ml的范围，并且为了保持该水平，例如持续一段时间或直至达到临床效果。嵌合的和人源化的抗体，其预想为被更缓慢的清除，需要较低的剂量以保持有效的血浆水平。同样，具有Betvl高亲和性的抗体优选为以相对于低亲和性抗体较低频率和较低剂量使用。抗体的药学上有效量可通过在治疗过程中表现出过敏反应较少来确定。优选地，本发明所述的疫苗制剂和药物在花粉季之前一或二周向个体使用。疫苗制剂优选为适合于肌肉内、皮下、静脉内或粘膜使用。根据本发明所述的制剂可以各种方式使用，其中肌肉内、皮下、静脉内或粘膜使用为优选。特异性与由氨基酸30-59(SEQIDNo.l)或氨基酸75-104(SEQIDNo.2)组成的Betv1结合的抗体可向个体使用以治疗或预防有Betvl引起的过敏性反应。特别地，粘膜使用本发明所述的抗体具有相对于传统免疫状况的一些优势。其中极为重要的是对呼吸道的局部粘膜免疫系统有效的刺激，以及疫苗摄取速率将被增高的可能性，因为与注射相关的恐惧和不安将被避免。使用本发明所述的结合至过敏原的抗体可通过抑制IgE与过敏原的结合而对抗过敏性反应。作为这个抑制的结果，通常一经与过敏原接触即增高的IgE的产生被减少。本发明的另一个方面涉及核酸分子，包括选自SEQIDNo.3至298的核苷酸序列。核苷酸序列SEQIDNo.3至298来自编码IgE分子可变区的mRNA，所述IgE分子可单独结合至Betv1，因此编码结合至所述过敏原的多肽。本发明的另一个方面涉及核酸分子编码的多肽，所述核酸分子包含选自SEQIDNo.3至298的核苷酸序列。本发明的另外一个方面涉及抗体或其片段，包含核酸分子编码的多肽，所述核酸分子包含选自SEQIDNo.3至298的核苷酸序列。本发明的多肽和核酸分子可被引入(例如通过分子生物学方法)抗体或其片段，以使所述抗体或其片段也可以单独结合至Betv1。这些抗体或片段可用于例如针对Betv1的被动免疫。根据本发明的优选实施方式，该抗体是选自IgGl、IgG2、IgG3禾nIgG4的免疫球蛋白。根据本发明的另一个优选的实施方式，该片段是免疫球蛋白的恒定区，免疫球蛋白的可变区，单链Fv(scFv)，二聚体(dsFv)，Fab或其组合。木发明由以下实施例和附图进一步说明，但不被限制于此。图1显示了实验设计。在第1、14和28天，两组Balb/c小鼠(n=4/组)经腹腔注射rBetv1/Al(OH)3。在第36天收集血液(前血清ante-serum)。在同一天第一组以腹腔注射rBetv1特异性IgG而第二组为不相关过敏原(Phlp5)。24小时后(第37天)收集血液(后血清post-serum)。图2显示了rPhlp5特异性IgG抗体对P-己糖胺酶的释放的抑制。浓度增加的rPhlp5(0.02pg/ml-0.5|ig/ml)以鼠前血清和后血清分别预温育，暴露于RBL细胞，测定卩-己糖胺酶的释放。P-己糖胺酶的释放以总(3-己糖胺酶的释放的百分率表示。图3显示了rBetv1特异性IgG抗体对P-己糖胺酶的释放的抑制。浓度增加的rBetvl(0.02pg/ml-0.5|ig/ml)以鼠前血清和后血清分别预温育，暴露于RBL细胞，测定(3-己糖胺酶的释放。P-己糖胺酶的释放以总P-己糖胺酶的释放的百分率表示。图4显示了编码能够结合至Betv1的IgE可变区的DNA序列。实施例实施例1:杂交瘤分泌的过敏原特异性的IgGl封闭抗体的产生和鉴定^^惑,/U:杂交瘤分泌的过敏原特异性的IgGl封闭抗体的产生重组桦树花粉过敏原BetV1在人肠杆菌中表达并通过以前所描述的方法(Hoffmann-Sommergmber等人，1997)来纯化。在AppliedBiosystemspeptidesynthesizerModel433A(FosterCity,CA,USA)上合成肽，在原始序列之外向每个合成的肽附着一个半胱氨酸，以促进与载体的结合(Focke等人，2004)。表1总结了源自非过敏性Betv1的合成肽的特征。表l.源自非过敏性Betvl的合成肽的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>在最后一次免疫3大后收取脾细胞，通过稍作修改的常规杂交瘤技术(K5hler和Milstein，1975)，使用HAT-敏感的，非分泌骨髓瘤细胞系X63Ag8.653(Keamey等人，1979)作为融合伴侣(ftisionpartner)来引起杂交瘤。骨髓瘤生长于杂交瘤生长培养基，其由补充了L谷氨酸(200mM)的RPMI1640，10%胎牛血清，二性霉素B(200U/ml)和青霉素/链霉素(10000U/ml)组成。小鼠的脾脏按照所述的方法除去，将细胞悬于无血清的杂交瘤生长培养基。在1750rpm(5分钟，4。C)离心后以细胞裂解缓冲液(8.3g/1氯化铵，1.0g/1重碳酸钾，0.037g/lEDTA四钠，pH7.4;在室温持续两分钟)裂解红血细胞，通过1750rpm(5分钟，4°C)离心洗涤细胞3此，每次将细胞沉淀轻轻地重悬于无血清的杂交瘤生长培养基。然后活的脾细胞和骨髓瘤细胞(在对数生长期)以2:l的比例(脾骨髓瘤)混合在一起，离心后，在l分钟内将1.5ml预热的(37°C)41.3。/。w/v聚乙二醇(PEG)4000加入到缓慢搅动起的细胞沉淀。然后在800rpm(5分钟，4°C)离心细胞，悬于补充了饲养细胞的HAT培养基，分散于96孔板，在37'CC02温育箱(5%)里温育。让细胞生长2周，然后在酶免疫检测中筛选上清的抗体产生。以在PBS中稀释的rBetv1(10昭/ml)在4。C过夜温来包被ELISA板。以PBS-T(PBS+0.05%Tween20)中的0.5°/。w/v牛血清蛋白(BSA)在37。C封闭1个小时，以未稀释的杂交瘤上清温育板，在37。C反应2小时。对于检测，以l:1000稀释的检测一抗(纯化的兔子抗-鼠IgGl)在37'C温育2小时，然后以l:2000稀释的酶联二抗(抗-兔子IgG，辣根过氧物酶偶联的物种特异性全抗体)，各在37。C和4。C温育30分钟。在温育歩骤之间，以PBS-T反复洗涤板。最后，以ABTS(2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(Sigma-Aldrich)在室温下温育并在405nm测定吸光度。以限制稀释方法来克隆分泌Betv1特异性IgGl抗体的杂种细胞，即阳性杂交瘤被扩展、亚克隆以保证单克隆性并冷冻保藏。杂交瘤分泌的过敏原特异性的IgGl封闭抗体的鉴定为了通过ELISA鉴定所获得的单克隆IgGl抗体的具体的结合特异性，以在PBS中稀释的浓度为5吗/ml的rBetv1、月太2(aa30-59)、肽6(aa75-104)、Betvl-三体、Betvl-片段l(aa1-74)、Betvl-片段2(aa75-160)、KLH和rPhlp1包被微量滴定板。通过加入PBS-T(PBS+0.05%Tween20)中的0.5%w/v牛血清蛋白(BSA)在37。C封闭1.5个小时，然后未稀释的杂交瘤上清在37。C温育2小时。如上所述，以检测一抗然后以酶联二抗来检测mAb的特异性结合。根据个案史，总共选择了44个来自桦树花粉过敏性病人(总IgE水平24.1-〉5000kUA/L;桦树花粉特异性IgE:10.7->100kUA/L)的血清，包括了来自一个非过敏性病人员的血清作为对照目的。桦树花粉过敏性病人由19个女性和25个男性组成，平均年龄为37(介于21-70岁)。表3总结了来自所选的桦树花粉过敏性病人的血清特征。表3.来自桦树花粉过敏性病人的血清特征<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>个体如表6-9中编号。人口统计数据显示了用于抑制实验的桦树花粉过敏性病人的性别和年龄。血清学鉴定显示了总IgE、桦树花粉特异性IgE和RAST类。NS，未明。以rBetv1(1(ig/ml)在4""C包被ELISA板过夜。以PBS-T(PBS+0.05°/。Tween20)中的0.5%w/v牛血清蛋白(BSA)在37。C封闭1个小时，板以未稀释的单独的(克隆2(DSMACC2782)、4(DSMACC2783)、10(DSMACC2785)、12(DSMACC2784)、13(DSMAC-C2786))和混合的(克隆2和克隆13)产生IgGl抗体的杂交瘤培养物上清在4。C预温育过夜。最后，板以来自44个桦树花粉过敏性病人的1:5稀释的血清温育(4。C过夜)，以l:IOOO稀释的碱性磷酸酶偶联的鼠单克隆抗-人IgE抗体检测所结合的IgE抗体。在温育步骤之间，以PBS-T反复洗涤板。在以IgGl单克隆抗体预温育之后的IgE与rBetv1结合的抑制百分率通过如下计算％抑制=100-(ODpx100/OD叩)。ODp和ODnp分别代表以杂交瘤培养物上清预温育(ODp)和不以杂交瘤培养物上清预温育(ODnp)后的消失。^"》f,/7.3:结果如上所述，在植板和温育融合的脾细胞后，每个微量孔的上清均以ELISA分析，以分离免疫活性的杂交瘤。阳性杂交瘤的进一步增殖导致14个稳定的、单克隆的、肽特异性抗体的选择。每一个属TlgGl同位型并表达K轻链。表4列出了所获得的克隆。克隆2、4、10、12和13根据布达佩斯条约于2006年5月9日保藏于DeutscheSammlungfUrMikroorganismenundZellkulturen(DSM,DSMZ),Braunschweig,德国，保藏兮为DSMACC2782(克隆2)、DSMACC2783(克隆4)、DSMACC2785(克隆10)、DSMACC2784(克隆12)、DSMACC2786(克隆13)。表4.克隆的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>进一歩测试14个产生肽特异性抗体的克隆与rBetv1、Betv1肽和Betv1衍生物，像由共价连接的三个拷贝的rBetv1组成的Betv1-三体(Vrtala等人2001)以及两个rBetv1片段，其包含Betv1的aa1-74(1)和aa75-160(2)(Vrtala等人2000)相结合的特性。而且，确定了单克隆抗体与阴性对照例如KLII和rPhlp1的结合。表5总结了14个单克隆抗体的结合特性。14个肽特异性抗体没有一个表现出对于KLH或rPhlp1的反应活性，但是，所有的都表现出对于rBetv1和Betvl,三体的强烈的反应活性。根据免疫原，克隆编号l-ll，其产生肽2-特异性(aa30-59)抗体，表现出对于此肽(肽2)的抗体反应活性，不与肽6(aa72-104)反应。由克隆编号12-13所产生的肽6-特异性(aa72-104)抗体，证明与免疫原的结合，缺少与肽2(aa30-59)的结合。使用Betvl片段l(aal-74)和片段2(aa75-106)进行的进一歩检测确定肽2-特异性抗体(克隆l-]l)对于片段1(aal-74)表现出反应活性而肽6-特异性抗体(克隆12-13)对于片段2(aa75-106)显示出反应活性。表5.IgGl单克隆抗体的结合特性rBetv1片段l片段2肽2~~肽6克隆rBetvl三体aaaaaaaarPhplKLH1-7475-16030-5975-1041+++-+-2+++-+-3+++-+-4+++-+-5+++-+-6+++-+-7+++-+-8+++-+-9+++-+-10+++-+-11+++-+-12++一+-+13++—+-+14++—+■+表6表明单克隆抗体也抑制过敏性病人的IgE结合至Betv1交叉反应过敏原例如来自桤木花粉Alng1的主要过敏原或来自苹果Mald1主要过敏原。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>显示了以IgGlmAb(克隆2、4、10)所获得的来自10个桦树花粉过敏性病人血清的IgE与完全rBetv1结合的抑制百分率。平均抑制百分率显示于图表下端。肽-特异性抗体抑制过敏性病人的IgE与完全rBetv1结合的能力通过ELISA竞争实验，使用来自44个桦树花粉过敏性病人的血清来确定(表7-9)。在病人IgE暴露之前，选取总共14个克隆中的5个以rBetvl预温育。以肽6-特异性(aa75-104)抗体预温育后观察到最强的对IgE结合的抑制(克隆12:平均抑制60.4%-74.8%;克隆13:平均抑制58.5%-72.6%)，而肽2-特异性(aa30-59)抗体(克隆2:平均抑制46.2%-62.7%;克隆4:平均抑制44.3%和58.7%，克隆10:平均抑制41.0%和52.4%)也抑制了病人IgE与rBetvl的结合，虽然程度较低。有趣的是，肽2-特异性单克隆抗体(克隆2)和肽6特异性单克隆抗体的混合物相对于单独的单克隆抗体没有表现出更强的对IgE结合的抑制(表7-9)。表7.IgGl单克隆抗体抑制桦树花粉过敏性病人的血清IgE与rBctvl的结合无mAb有mAb的OD值抑制％的OD病人克隆2克降4克隆10克降12克隆13克降2克隆4克降10克降12克隆13al0.450.340.340.370.360.362325172019a20.740.340.360.400.210.2054514672730.930.490.520.580.610.664745383429a40.610.230.230.260.150.136262577678a51.190.810.870.860.430.583227286452a60.410.200.220.240.120.135147427169a70.620.330.350.380.190.2248443870650.630.310.320.330.170.205049477369a90.420.190.190.190.100.095554547678a100.380.230.230.220.190.184039434954对昭■>、、、0.060.090.090.090.140.1500000平均46.2344.2540.9760.4258.53显示了以IgGlmAb(克隆2、4、10、12、13)所获得的来自10个桦树花粉过敏性病人(al-alO)血清的IgE与完全rBetv1结合的抑制百分率。来自一个非过敏性人员的血清作为对照。平均抑制百分率显示于表的下端。表8.IgGl单克隆抗体抑制桦树花粉过敏性病人的血清IgE与rBetvl的结合,t有mAb的OD值抑制％的D病人克隆2克隆4克隆10克隆12克隆13克隆2克隆4克隆10克隆12克隆13bl0.350.090.100.130.060.067572638484b20.290.090.110.130.070.077064567775b30.520.130.180.230.080.127466558577b41.050.250.240.360.100.127677669089b50.700.260.310.370.090.126255468782b60.120.040.060.060.040.047051457067b70.730.290.290.380.130.186160478275b80.130.060.060.070.050.055756496365b90.330.090.100.130.060.067371618382blO0.110.060.070.070,060.064739374747Ml1.240.280.300.400.080.127876689491bl20.170.040.060.060.030.047566637978bl30.880.160.160.220.080.088281759190b141.610.760.770.950.290.465352418272bl50.300.150.160.180.120.125148406160bl61.520.800.850.890.350.564844427763bl70.250.080.090.110.040.066763568275M80.160.090.090.110.070.084543345954bl90.510.130.140.170.060.067572668988b200.110.070.080.080.060.063330294242b210.540.170.210.240.060.096862548983b220.210.120.120.120.090.094244405657b230.520.130.140.170.060.067573678989b240.300.080.090.100.040.047370658686b250.400.150.150.180.100.116361557473b260.160.090.090.090.080.074644425055b270.420.140.150.170.070.076865598484b280.160.060.070.080.050.056157537071b290.310.130.140.170.070.095955477671b300.120.050.070.070.050.065338375552b310.350.150.160.180.110.125553496866b320.250.070.080.090.060.057370657579b330.110.050.050.060.040.045552486565b340.390.120.130.160.060.066967608485对照0.030.030.040.030.040.0840000甲.均62.6958.6852.3774.8472.64显示了以IgGlmAb(克隆2、4、10、12、13)所获得的来自34个桦树花粉过敏性病人(bl-b34)血清的IgE与完全rBetv1结合的抑制百分率。来自一个非过敏性人员的血清作为对照。平均抑制百分率显示于表的下端o表9.桦树花粉过敏性病人的血清IgE与rBetv1的结合的抑制两个单独单克隆抗体和其混合物的抑制能力的比较无mAb有mAb的OD值抑制％的OD病人克隆2克隆13克隆2/13混合克隆2克隆13克隆2/13混合0.300.130.070.07567575a20.290.110.070.076176740.190.070.050.04637678a40.170.080.050.055672700.030.030.030.0515600.140.090.070.093648370.250.090.060.06647575a90.240.180.300.100.060.160.080.040.110.070.040.09606547687664727770平52.3663.5662.88抑制百分率与以IgGlmAb的混合物(克隆2/13混合)的抑制的比较。显示了来自IO个桦树花粉过敏性病人(al-a10)血清的抑制。平均抑制百分率显示于表的下端。过敏性反应的关键事件是结合至效应细胞的IgE抗体与多价过敏原的交联。这导致颗粒胞外分泌和生物调节子的释放(即，组胺，白细胞三烯)，然后这又引起急性过敏反应和过敏性鼻炎、结膜炎和哮喘。在这个方面，过敏原-IgE抗体的相互作用是可能的过敏原特异性被动免疫治疗的靶点，治疗的目标为抑制过敏原和IgE抗体之间的相互作用(Valenta等人，1998)。由于这个原因，IgE表位的定义是治疗的特定形式的发展的重要先决条件。如果是带有连续IgE表位的主要过敏原，例如Phlpl，则可能将过敏原切开为结合IgE的半抗原，所述半抗原在暴露于过敏原之前将结合至效应细胞的IgE饱禾U，因此防止了交联和效应细胞的激活(Bali等人1994)(同时参见第一章半抗原的原理)。相反，主要桦树花粉Betv-1的IgE表位主要属于构象(非连续)型。在这种情况下，过敏原-IgE抗体的相互作用口J被治疗性过敏原特异性抗体所抑制，所述治疗性过敏原特异性抗体与病人IgE竞争过敏原上的结合位点，从而防止了效应细胞的激活。这种治疗方法是合理的，特别是当病人仅仅致敏于几个主要过敏原。在本实施例中，14个单克隆Betv1肽-特异性抗体，其均属于IgGl亚类，他们的表位特异性结合特性和干扰过敏性病人的IgE与Betv1过敏原结合的能力被鉴定。根据他们的结合特异性，单克隆抗体可被分成两组第I组(克隆1-11)单克隆抗体强烈识别肽2(aa30-59)而第二组(克隆12-13)单克隆抗体强烈结合肽6(aa75-104)。所有的单克隆抗体强烈结合rBetv1和rBetvl三体并表现出特异性，因为他们未能识别不相关对照蛋白，例如KLH禾HrPh1p1。当测试对病人IgE与Betv1结合的干扰时，每个单克隆抗体均在相当大的程度上抑制IgE的结合，在一些病人中有些达到了94%。有趣的是，这些结果表明单独的单克隆抗体足以与病人多克隆IgE结合竞争。肽6-特异性单克隆抗体相对于肽2-特异性单克隆抗体表现出更强的抑制能力。将具有不同表位特异性的个别单克隆抗体(克隆2:肽2-特异性；克隆13:肽6-特异性)与具有不同特异性的两个抗体的混合物相比较，没有发现抗体混合物具有更强的对病人IgE结合的抑制。基本上，可以考虑肽-特异性IgGl抗体的封闭活性的两种解释。第一，抑制可通过一个事实解释所获得的单克隆抗体在Betv1的主要IgE结合位点内或紧邻Betv1的主要IgE结合位点来识别表位。第二，封闭活性可由过敏原构象的修饰引起，从而IgE表位或仅其一部分对于IgE来说不再是可接近的。较好的解释将符合抑制实验结果，所述实验结果表明具有不同的表位特异性的两个肽-特异性单克隆抗体的混合物相对于个别的单克隆抗体没有产生更强的抑制。这个理论可通过过敏原-抗体复合物的结果分析来确定。使用来自过敏性病人或免疫的老鼠为来源，通过经典组织培养和组合克隆技术，己经分离了几个具有治疗潜力的人和鼠单克隆抗体(Sim等人，1995;Visco等人，1996;Lebeque等人，1997;Flicker等人，2002)。这些抗体能够抑制过敏原-IgE的相互作用并防止过敏原诱导的嗜碱粒细胞脱粒。Betv1特异性人类封闭抗体也已经通过产生的杂交瘤细胞系而生产，所述细胞系来自经免疫治疗的病人(Visco等人1996)。Betvl特异性鼠单克隆抗体已经由经典杂交瘤技术分离(Lebeque等人1997)。与较早前获得的Betv1特异性单克隆抗体相比，本实施例中描述的抗体已经被分离自鼠，以具有一定氨基酸序列的源自Betv1的肽免疫，因此在程序开始确定了特定表位。如上所述的封闭抗体也可以被人源化或以重组抗体片段来生产以减少其免疫原性。治疗性过敏原特异性抗体可经局部使用至过敏症的靶器官(例如，鼻或支气管粘膜，结膜)以建立稳定的对抗入侵的过敏原的防线，或全身使用，例如被动接种(Valenta等人1997)。总之，本发明所述的单克隆抗体也可通过局部治疗或被动接种用于防止过敏原诱导的在过敏症靶器官中的调节子的释放。实施例2:建立了一个小鼠模型来研究在体内以过敏原特异性IgG抗体进行的被动接种的效应(图1)。在第1、14和28天，小鼠(CharlesRiver，Germany)用吸附到Al(OH)3(Alu-Gel-S;Serva,Germany)的5吗的主要桦树花粉过敏原rBetv1(Biomay，Austria)以腹腔内(i.p.)致敏。在第36天从致敏的小鼠的尾静脉取血液样品(前血清)。对Betvl的过敏性致敏通过测定这些血清中的Betvl特异性抗体来确定(Vrtala等人，1998)。所有的八个血清中的Betvl特异性抗体的水平是相当的(表IO，前血清)。然后将小鼠分成两个组第一组用0.5ml的Betv1特异性抗体以腹腔内处理。第二组(对照组)以0.5ml的直接针对不相关过敏原Phip5的IgG注射。在第37天从两个组的小鼠的尾静脉取血(后血清)，并比较相对于前血清IgE对rBetv1的反应活性。为了这个目的，将5吗/ml的rBetvl过夜包被至ELISA板，板以3%的BSA/TBST(50mMTris，150m國aCl，0.5%w/v的BSA，0.05%v/vTween)。在TBST中以1:10稀释小鼠血清，过夜温育，分别以单克隆的兔抗小鼠IgE抗体(BDPharmingen;USA)禾口HRP标记的羊抗大鼠抗血清(Amersham，U.K.)来检测所结合的IgE。表9显示了结果，其代表二次重复测定的平均值，差异小于10%。第一栏和第二栏表明了在IgG处理前(前血清)和处理后(后血清)，小鼠的IgE与rBetvl的结合。在后血清(第三栏)IgE与rBetv1结合的抑制百分率按如下计算百分率抑制％二100-OD后血洁x100/OD阮血ffl:。抑制率介于23.4-54.6%(表10)。表10显示了rBetv1特异性IgG抗体对小鼠IgE与rBetv1结合的抑制。显示了以rBetv1特异性IgG抗体或Phip5特异性IgG处理前(前血清；第一栏)和处理后(后血清；第二栏)IgE与rBetvl的结合。在第三栏显示了后血清IgE结合的抑制百分率。表10小鼠的IgE与rBetv1结合的抑制个体OD4。5nmIgE与rBetv1的结合IgE与rBetv1前血清后血清结合的抑制％第一组11.1100.85023.420.7380.33554.630.4170.22047.240.3620.19745.6第二组51.8841.7845.360.5080.5031.070.2000.17512.580.4680.497+6.2第二组中的小鼠中几乎没有观察到IgE与rBetvl的结合，所述小鼠获得了具有针对Phip5的特异性的IgG。在一个相似的针对Phip5过敏性小鼠进行的实验中，通过Phip5特异性IgG处理达到的IgE结合的抑制百分率介于7.7-58%(表ll)。表11显示了rPhlp5特异性IgG抗体对小鼠IgE与rPhlp5结合的抑制。显示了以rPhlp5特异性IgG或rBetv1特异性IgG处理前(前血清；第一栏)和处理后(后血清；第二栏)IgE与rPhlp5的结合(OD值)。在第三栏显示了后血清IgE结合的抑制百分率。表11小鼠的IgE与rPhlp5结合的抑制个体OD4Q5nmIgE与rPhlp5的结合IgE与rPhlp5前血清后血清结合的抑制％~~第一组10.7010.6477.72O扁0.38743.130.8020.41648.140.6690.28158.0;二组50.6870.711+3.5^0.8280.7736.770.9440.80914.480.8280.7568.7通过大鼠嗜碱白血病细胞(RBL)中(3-己糖胺酶的释放分析了过敏原特异性IgG抗体是否能抑制过敏原诱导的剂型过敏反应。将RBL-2H3细胞(Eccleston等人，1973)植板于96孔组织培养板(4x104/孔)并在37"C下5%C02中培养24小时。以Tyrode缓冲液(Sigma-Aldrich,Austria)(137mMNaCl,2.7mMKC1,0.5mMMgCl2,1.8mMCaCl2,0.4mMNaH2P04,5.6mMD-葡萄丰唐，12mMNaHC03,10mMN-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)和0.1。/。w/v牛血清蛋白，pH7.2)洗涤细胞两次。以不同浓度(0.5吗/ml;0.1吗/ml;0.02(ig/ml)的过敏原分别温育前血清和后血清(以Tyrode缓冲液1:IO稀释)。将过敏原/IgE和过敏原Ig/G复合物暴露于RBL细胞并在37。C下加湿的空气中温育2小时。以荧光光谱(CYTOFLUOR2350，Millipore,USA)测定P-己糖胺酶的释放水平。结果以通过加入1%v/vTritonX-100所达到的总(3-己糖胺酶释放的百分率来表示。图2和3显示，当细胞以过敏原加后血清温育时，相对于以过敏原加前血清，RBL细胞中P-己糖胺酶的释放较低。在进一步的实验中，封闭抗体的概念被延伸至另一个季节性的重要的过敏原，主要草花粉过敏原Phlpl，和终年的过敏原例如Derp2，一个来自屋尘螨的主要过敏原和主要鱼过敏原Cypcl。而且，研究了单一的IgG抗体注射对小鼠的过敏原特异性IgE结合的效应。表12显示了rPhlp1特异性IgG抗体对小鼠IgE与rPhlp1结合的抑制百分率。后血清的抑制率介于63.3%-39.5%。在一个相似的针对Derp2致敏的小鼠进行的实验中，通过rDerp2特异性IgG处理达到的抑制百分率介于63.5-27.5%(表13)。对于rCypc1致敏的小鼠，特异性IgE结合的抑制率达到59.8-36%(表14)。表12rPhlp1特异性IgG抗体对小鼠的IgE与rPhlp1结合的抑制在rPhlp1特异性IgG(第一组)或Betv1特异性IgG(第二组)处理后的不同的时间点，显示了后血清的IgE与Phip1的结合的百分率。前血清的IgE结合计算为达到100%反应。小鼠IgE与rPhlp1结合的抑制％24小时后72小时后1周后2周后3周后163.344.529.839.139.5248.346.245.6nd54.7表13rDerp2特异性IgG抗体对小鼠的IgE与rDerp2结合的抑制在rDerp2特异性IgG(第一组)或Betvl特异性IgG(第二组)处理后的不同的时间点，显示了后血清的IgE与Derp2的结合的百分率。前血清的IgE结合计算为达到100%反应。小鼠IgE与rDerp2结合的抑制％24小时后72小时后1周后2周后3周后150.952.275.743.327.5263.550,836.634.348.3表14rCypc1特异性IgG抗体对小鼠的IgE与rCypc1结合的抑制在rCypc1特异性IgG(第一组)或Betv1特异性IgG(第二组)处理后的不同的时间点，显示了后血清的IgE与Cypc1的结合的百分率。前血清的IgE结合计算为达到100%反应。小鼠IgE与rCypc1结合的抑制24小时后72小时后1周后2周后3周后I^^^^836.0实施例3:为了获得其它Betvl特异性抗体，IgE反应专有地针对主要桦树花粉过敏原Betv1的病人被鉴定。通过逆转录和使用家族特异性性引物(VH1,VH6)和位于第一恒定s区的引物的PCR从这些病人中获取了IgE可变区的DNA序列。总共鉴定了336个这些过敏性病人的Betv1特异性重链可变序列(图4)，所述序列识别Betvl的IgE表位，因此作为封闭抗体起反应。微微纖丝个沐游微使用多过敏原检测系统(MASTCLAallergen-specificIgEassay,HitachiChemicalDiagnostics),所述系统含有46中过敏原源(桤木花粉、杏树、交链包属、苹果、曲霉菌、桦树花粉、胡萝卜、酪蛋白、猫皮屑、芹菜、分子孢子菌属、蟑螂、鳕、粉尘螨(Dwmatop/7"go/^s/an'"ae)、屋尘螨(De^mato//2ago/^^ptera"j^/wM)、狗皮屑、草混合物、天竺鼠皮屑、仓鼠皮屑、榛树花粉、榛实、马皮屑、刺柏属、乳胶、牛奶蛋白、艾属植物、橄榄树、墙草属、桃树、花生、青霉菌、松树混合物、车前草、羽毛混合物、马铃薯、兔子、豚草属、黑麦、黑麦面粉、芝麻、小虾、大豆、番茄、胡桃、小麦面粉、整鸡蛋)从500个过敏性个体中鉴定了6个对桦树花粉具有专有性过敏性致敏的个体。在2002和2005年春季和夏季获取了来自这6个过敏性个体的血液样品。在每次约见，通过CAT-RAST测定(Phadia)对Betv1特异性IgE的水平进行定量，记录过敏性症状和抗过敏性药物治疗。所选个体没有一个接受任何种类的过敏原特异性免疫治疗。如DrachenbergKJ等人，Allergy56(2001):498-505所描述记录个体居住区的桦树花粉暴露情况。i^敎嚴淳^丝/^叛银游鉴定为了详细说明所选过敏性个体的过敏原图解，以重组Betv1进行了抑制实验。根据生产商指示，将从Biomay购买的重组Betv1以5mg蛋白/ml介质的浓度偶联至CNBr-激活的琼脂糖4B(GEHealthcareBio-SciencesAB)。在4。C以500jil的过敏原偶联的凝胶通过直立旋转(end-over-endrotation)的方式温育6个过敏性人员的1500[il的血浆。通过离心(4。C，5分钟，5000g)重新获得血清。在CAT-RAST测定(Phadia)损耗之前和之后，测定了针对食物过敏原混合物(蛋白、牛奶蛋白、鳕、小麦面粉、花生和大豆)和呼吸混合物(艾属植物、桦树花粉、墙草属、猫尾草和长叶车前草)的IgE水平，以及针对桦树花粉提取物和rBetv1的IgE水平(EibensteinerP等人，Immunology101(2000):112-9)。以三个对桦树花粉中的Betv1专有性反应的个体进行了进一步实验。尸層C游分辭〃妙斧录预灯-PC7iT潜在收集血清时，通过Ficoll浓度梯度离心分离外周单核细胞。使用胍异硫氰酸盐方法和CsCl梯度离心分离总细胞RNA。使用家族特异性性引物(VH1-VH6)和特异性针对IgE重链第一恒定区的引物以带有PlatinumTaq的SuperscriptOne-StepRT-PCR(Iiwitrogen)来产生IgE转录子(表15)。表15:名称特异性5'-3'序列Vifi人类VH1基因家族VH2人类VH2基因家族VH3人类VH3基因家族VH4人类VH4基因家族VH5人类VH5基因家族VH6人类VH6基因家族IgECl人类s-链第一恒定区PCR扩增程序由以下组成47。C下30分钟和94"C下5分钟的起始歩骤，然后94'C下20秒钟、59。C下30秒钟和72。C下1分钟的的40个循环，和72。C下5分钟的最后延伸。根据生产商的指示，使用WizardSVGd和PCRClean-UpSystem(Promega)将所有符合预期大小的PCR产物进行琼脂糖凝胶纯化。然后，将cDNA克隆至AccepTorTM载体(Novagen)并转录至大肠杆菌(」&c/2en'c/7/aco/Z)XLl-blue。使用WizardP/zSVMiniprepDNAPurificationSystem(Promega)，从3ml含有100(ag/ml氨比西林的过夜培养物中纯化质粒DNA并以限制性内切酶Kpnl和SacI(Roche)消化。带有正确大小的插入物的质粒以MicrosynthAG(Switzerland)测序。参考文献GGAATTCACTCCCAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGGGAATTCGTCTGTGCCGAGGTGCAGCTGCTCGAGCTCGGGGAATTCGTCCTGTCACAGGTACAGCTGCTCGAGTCAGGBallT,等人J.Biol.Chem.1994;269:28323-8.BreitenederH,等人EMBOJ.1989;8:1935-8.EccelstonE，等人NatNewBiol1973;244:73-76.FerreiraFD，等人J.Biol.Chem.1993;268:19574-80.Flickers,等人Eur.J.Immunol.2002;32:2156-62.FockeM,等人Clin.Exp.Allergy.2004;34:1525-33.Hoffmann-SommergmberK,等人Expr.Purif.1997;9:33-9.JarolimE,等人Allergy.1989;44:385-95.KearneyJF,等人J.Immunol.1979;123:1548-50.K5hlerG,MilsteinC.Nature1975;256:495.LebecqueS,等人J.AllergyClin.Immunol.1997;99:374-84.SunLK,等人Biotechnology.1995;13:779-86.ValentaR,等人J.Allergy.Clin.Immunol.1991;88:889-94.ValentaR,等人Curr.Opin.Immunol.1995;7:751-6.ValentaR,等人Immunol.Cell.Biol.1996;74:187-94.ValentaR,等人Biol,Chem.1997;378:745-9.ValentaR,等人Int.Arch.AllergyImmunol.1998;116:167-76.ViscoV，等人J.Immunol.1996;157:956-62.VrtalaS,等人J.Immunol.2000;165:6653-9.VrtalaS,等人FASEBJ.2001;15:2045-7.VrtalaS，等人JImmunol1998;60:6137-6144.权利要求1、一种抗体或其衍生物在制备用于个体的被动免疫的药物中的用途，以预防和/或治疗所述个体中由于暴露于桦树花粉过敏原而引起的过敏性反应，其特征为，该抗体与Betv1片段结合，所述Betv1片段包含氨基酸30至59(SEQIDNo.1)或氨基酸75至104(SEQIDNo.2)。2、根据权利要求1所述的用途，其特征为，该抗体是IgG抗体，特别是IgGl或IgG4同位型的IgG抗体。3、根据权利要求1或2所述的用途，其特征为，该抗体是鼠抗体。4、根据权利要求1或3所述的用途，其特征为，该抗体是嵌合抗体。5、根据权利要求1至4任一项所述的用途，其特征为，人源化该抗体。6、根据权利要求1至5任一项所述的用途，其特征为，该抗体是单克隆抗体。7、根据权利要求1至5任一项所述的用途，其特征为，该抗体是由杂交瘤分泌产生的单克隆抗体，所述杂交瘤于2006年5月9日保藏于布达佩斯条约下的DSMZ，其保藏号为DSMACC2782，DSMACC2783,DSMACC2785,DSMACC2784禾BDSMACC2786。8、结合至Betv1片段的抗体或其衍生物，其特征为所述Betv1片段由氨基酸30至59(SEQIDNo.l)或氨基酸75至104(SEQIDNo.2)组成。9、根据权利要求8所述的抗体或其衍生物，其特征为该抗体是IgG抗体，特别是IgGl或IgG4同位型的IgG抗体。10、根据权利要求8或9所述的抗体或其衍生物，其特征为，该抗体是鼠抗体。11、根据权利要求8或10所述的抗体或其衍生物，其特征为，该抗体是嵌合抗体。12、根据权利要求8或11任一项所述的用途，其特征为，人源化该抗体。13、根据权利要求8至12任一项所述的抗体或其衍生物，其特征为，该抗体是单克隆抗体。14、根据权利要求8至12任一项所述的抗体或其衍生物，其特征为，该抗体是由杂交瘤分泌产生的单克隆抗体，所述杂交瘤于2006年5月9日保藏于布达佩斯条约下的DSMZ，其保藏号为DSMACC2782,DSMACC2783,DSMACC2785,DSMACC2784禾卩DSMACC2786。15、包含权利要求8至14的任一项所述的抗体的疫苗制剂。16、根据权利要求15所述的疫苗制剂，其特征为该制剂适合于肌肉内、皮下、静脉或粘膜使用。17、包含选自SEQIDNo.3至298的核苷酸序列的核酸分子。18、由权利要求17所述的核酸分子编码的多肽。19、包含权利要求18所述的多肽的抗体或其片段。20、根据权利要求19所述的抗体或其片段，其特征为该抗体是选自IgGl、IgG2、IgG3或lgG4的免疫球蛋白。21、根据权利要求18或19所述的抗体或其片段，其特征为该片段是免疫球蛋白的恒定区、免疫球蛋白的可变区、单链Fv(scFv)、二聚体(diabody)、Fab或其组合。全文摘要本发明涉及Betv1特异性抗体或其片段，及其在预防和治疗过敏原诱导的疾病中的用途，其中该抗体阻断IgE与Betv1的结合。文档编号C07K16/16GK101448855SQ200780017364公开日2009年6月3日申请日期2007年5月18日优先权日2006年5月18日发明者A·吉拉斯,K·马特,O·毛伊迪克,P·科尔,R·瓦伦塔,S·弗利克申请人:碧欧美公司