衍生自重组酵母的具有止血活性的微泡及其用途的制作方法

专利名称：衍生自重组酵母的具有止血活性的微泡及其用途的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及用促凝剂治疗个体出血。更具体地，本发明涉及具有促凝活性的 携带组织因子的酵母来源的微泡，其包含酵母膜和组织因子蛋白或其片段，或者与另一肽 融合为融合蛋白的组织因子蛋白或其片段，以及涉及它作为促凝剂用于治疗个体出血以及 用于促进血管生成和细胞迁移的应用。本发明还涉及用于制备所述携带组织因子的酵母来 源的微泡的方法。
背景技术：
止血是生物体对出血作出应答的机制，其涉及在损伤后立即起作用且长时间保持 活性的两个过程的参与。第一个过程被称为原发性止血，其特征在于在血管损伤部位发生 血管收缩并形成血小板聚集。第二个过程称为继发性止血，在此阶段由于不同凝血级联 (coagulationcascade)蛋白水解酶的作用，形成纤维蛋白凝块。多种辅因子及蛋白水解酶参与凝血过程的第二阶段，它们皆称为凝血因子，且这 一阶段又由几个阶段组成，以由于凝血酶的作用由纤维蛋白原水解形成纤维蛋白作为结 束。凝血酶预先由脱辅基酶，凝血酶原进行蛋白水解形成。此蛋白水解作用是由与活化的 血小板的表面结合的活化的凝血因子X(FXa)完成的，且只有当其辅因子，活化的凝血因子 V(FVa)及钙离子存在时，此活化的凝血因子X(FXa)才能够水解凝血酶原。凝血因子X(FX) 能够由两种单独的途径活化，即内源途径及外源途径。内源途径包括一系列反应，其中各个酶原被水解，产生其活性蛋白酶形式。在各步 骤中，新形成的蛋白水解酶催化下一酶原的活化以相继产生活性形式。在血液凝固的外源途径中，在损伤部位的血管外膜细胞上暴露的组织因子(TF) 结合循环凝血因子VII/活化的凝血因子VII (FVII/FVIIa)，以形成TF FVIIa复合物，并且 当钙离子存在时以用作使FX活化的基质。外源途径目前被认为在血液凝固中是最相关的 途径，公认如果发生由血管损伤导致的出血，则由涉及TF与其配体FVII/FVIIa的相互作用 的外源途径活化启动凝血。TF由蛋白质组分(先前被称为组织因子脱辅基蛋白-III)和磷脂组成。TF特异 性地与FVII/FVIIa结合，并在血液凝固外源途径中起重要作用。TF的生理作用是公知的； 一方面它是FVIIa特异性的受体，一旦形成TF: FVIIa复合物，它便作为发生FX活化的基 质。事实上在血管损伤后，通常隐蔽在血管外围的外膜细胞表面上的TF与其配体，存在于 血液中的FVII接触并相互作用，形成TF: :FVII复合物。一旦形成该复合物，便发生FVII 自体活化，产生其活化形式FVIIa。糖基化作用是酶指导的位点特异性过程，通过所述过程将糖类附加于脂质和蛋白 质。该过程被认为涉及稳定性、折叠和转运；虽然没有描述糖基化作用对于TF的实际功能 的证据。已经广泛公认TF是负责快速启动凝血的主要成分。为了开始凝血，绝对需要活化 FX并引发凝血酶原水解。FXa的来源主要来自FVIIa与其受体TF的相互作用。已经报导了来自各种组织的TF的纯化，所述各种组织例如人脑、牛脑，人胎盘，绵羊脑以及肺。普遍公认虽然物种间TF蛋白的结构存在差别，但是如体外凝血测定所测量 的那样无功能性差别。普遍公认为了证实生物活性，TF在体外必须与磷脂结合。已经显示出例如通过使 用磷脂酶除去TF的磷脂组分导致其体外生物活性损失。再脂化作用能够恢复体外TF活性。虽然已经可以利用从各种组织获得的某些“纯化的” TF蛋白，但是，血液和组织中 的TF蛋白的低浓度以及纯化来自组织的该蛋白在经济和精力两方面的高成本使这成为稀 缺材料。因此，亟需寻找TF蛋白的替代来源，有利的是脂化的TF蛋白。已经使用克隆的人cDNA使TF蛋白在各种系统中表达。因此，已经报导了 TF蛋白 在大肠杆菌(E.coli)中的过量表达(Paborsky et al.，Biochemistry 28,8072(1989))。 此外，第6，261，803号美国专利公开了用于在原核宿主生物中制备功能性重组TF的方法。 在大肠杆菌中实现了完整的TF蛋白的高表达量。虽然蛋白质在大肠杆菌中的异源表达存在某些优势，但是由于细菌缺乏它们自己 的糖基化系统，真核蛋白在所述细菌中的表达伴随着许多问题，主要是当待表达的蛋白质 是糖基化的真核蛋白时。因此，替代策略在于表达缺失跨膜区的突变的TF蛋白。这种所谓的“可溶”TF(或 “截短” TF)在细菌细胞的细胞质中蓄积，并且能够较大量表达。然而，在该系统中，这样表 达的TF蛋白通常以所谓包含体的形式以准晶态存在于大肠杆菌中。当在这种情况下，必须 通过使用非常大量的促溶剂来溶解包含体，然后使已经以这种方式形成单体的蛋白质再一 次被折叠成有活性的复性构型，这需要付出大量努力而通常只有低产率。此外，原则上，可 溶性TF由于其缺乏与磷脂相互作用的结构域而不适合用于凝血酶原时间试剂。用于过量表达TF蛋白的另一方法在于使用大量已知并成功应用的表达系统，其 编码基因融合的产物(例如与半乳糖苷酶、MalE、谷胱甘肽转移酶、His-标签等融合)。 然而，这些系统不适合表达生物活性TF。虽然当使用所述系统时，能够检测表达产物并且还 能够增加表达水平，但是这样获得的表达产物有时伴随有功能完全丧失，这即使使用精细 的复性方法也不能恢复。能够通过将TF蛋白在真核系统中进行表达来避免TF蛋白在大肠杆菌中过量表达 的问题。因此，原则上在酵母细胞中，在使用杆状病毒作为载体的昆虫细胞培养物中，或者 在诸如仓鼠卵巢细胞的培养的哺乳动物细胞中，或者在人细胞系中的表达是合适的。然而， 这些系统具有紧要的缺点，其中当与重组大肠杆菌产物比较时重组蛋白产率低得多。酵母菌株结合上述不同宿主系统的优势。一方面它们比大肠杆菌更接近地模拟真 核蛋白的天然生理机能，且另一方面它们易于处理、易于培养，生长快得多并经济得多。然 而还是存在若干因素影响蛋白质在酵母中的表达。这些因素包括但不限于-基因调控序列的选择，所述基因调控序列例如启动子，其控制异源蛋白的表达; 用来控制异源表达的启动子序列通常应该是“强的”，即它们应该导致非常高的蛋白质表达 并且是适当可控的，由此所述表达可以首先被有效地抑制直到达到培养物的最佳生物量， 然后被迅速启动以实现蛋白质表达；以及_表达的异源蛋白的有效分泌；表达的蛋白质(胞外表达)的分泌通常优于胞内 表达，因为后者首先需要裂解细胞从而使整个细胞内容物流出，然后从细胞材料和碎片的 混合池(cesspool)中分离出所需蛋白质。而蛋白质的有效分泌也取决于若干因素，包括(i)信号序列-肽序列的选择，所述信号序列_肽序列通常为天然分泌的蛋白质的N-末端 区域，并指导蛋白质进入细胞分泌途径，以及(ii)分泌途径的特异性成分，其与信号序列 相互作用并影响所连接的蛋白质的分泌。Stone M. J.等人(Biochem. J. (1995) 310，605-614)描述了 TF (截短 TF)的表面结 构域在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达。为了进行TF纯化，将培养物加 载于与抗TF抗体偶联的免疫亲和柱上，并且将蛋白质洗脱并透析。该测定法允许使用毫克 量的截短TF。Brucato C. L.等人(Protein Expression and Purification(蛋白表达禾口纯 化)26 (2002)，386-393)描述了成熟的全长重组兔TF蛋白在毕赤酵母(Pichia pastoris) 中的表达。通过固定的金属离子亲和色谱来纯化TF蛋白。迄今为止，还没有以高产率从酵母制备大量生物活性的重组TF的已知方法。有利 的是，所述重组TF应该在高水平活性下获得，优选在适于治疗用途的活性水平下获得。因 此，本发明的目的在于使用重组技术产生有用的大量的脂化TF蛋白。有利的是，重组TF蛋 白应该用于治疗应用。发明_既述本发明第一方面涉及携带组织因子(TF)的酵母来源的微泡，其包含(i)酵母膜， 以及(ii)具有促凝活性的组织因子(TF)蛋白或其变异体，其中所述具有促凝活性的组织 因子(TF)蛋白或其片段的一部分被整合到所述膜中。另一方面，本发明涉及包含携带TF的酵母来源的微泡的组合物、涉及作为药物的 携带TF的酵母来源的微泡、涉及包含携带TF的酵母来源的微泡的药物组合物、涉及用于治 疗个体出血的携带TF的酵母来源的微泡以及涉及用于治疗需要促进个体细胞迁移和/或 血管生成的疾病的携带TF的酵母来源的微泡。另一方面，本发明涉及用于制备本发明的具有促凝活性的携带TF的酵母来源的 微泡的方法，其包括以下步骤a)将表达具有促凝活性的TF蛋白或其变异体的重组酵母细胞的培养物在允许所 述具有促凝活性的TF蛋白或其片段表达的条件下发酵；b)沉淀由步骤a)的发酵所得的产物，以提供发酵产物；c)将从步骤b)获得的所述发酵产物勻浆，以提供发酵勻浆液；d)将步骤C)获得的所述发酵勻浆液分离，以提供沉淀和包含所述具有促凝活性 的携带TF的酵母来源的微泡的澄清酵母提取物(CYE)；e)收集包含所述具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡的所述澄清酵母提取 物(CYE)；以及，任选地，f)如果需要，将具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡分离或纯化。另一方面，本发明涉及用于制备包含来自真核宿主细胞的感兴趣膜蛋白的微泡的 方法，其包括以下步骤a)使所述真核宿主细胞的培养物在允许所述感兴趣膜蛋白表达的条件下生长；b)将a)的培养物的细胞部分勻浆；c)将从步骤b)获得的勻浆液分离，以提供沉淀和包含所述含有目的膜蛋白的细 胞来源的微泡的澄清细胞提取物；以及
d)通过尺寸分配(size partitioning)纯化所述细胞来源的微泡。另一方面，本发明涉及修饰的组织因子(TF)脂化蛋白，其选自(i)具有促凝活性的截短组织因子(TF)，其缺失全部或部分负责与FVIIa结合的 结构域，(ii)具有促凝活性的TF蛋白突变体，其中负责与FVIIa结合的结构域不是功能性 的，以及(iii)具有促凝活性的TF蛋白突变体，其携带至少一个非功能性N-糖基化位点。另一方面，本发明涉及用作药物的本发明的修饰的TF脂化蛋白，涉及包含修饰的 TF脂化蛋白和药物可接受的介质的药物组合物，涉及用于治疗个体出血和用于治疗个体需 要促进细胞迁移和/或血管生成的疾病的修饰的TF脂化蛋白。另一方面，本发明涉及多核苷酸序列，其编码具有促凝活性的截短组织因子(TF)， 所述截短组织因子缺失全部或部分负责与FVIIa结合的结构域；编码具有促凝活性的TF蛋 白突变体，其中负责与FVIIa结合的结构域不是功能性的；以及编码携带至少一个非功能 性N-糖基化位点的具有促凝活性的TF蛋白突变体。本发明还涉及包含本发明的多核苷酸序列的载体，涉及包含本发明的多核苷酸或 本发明载体的宿主细胞，以及涉及与本发明的修饰的TF蛋白特异性结合的抗体。附图简述

图1显示用于产生PTT10301的克隆策略。图IA显示pTT10301质粒的图谱。将 包含GPD启动子(pGPD)、唯一 BamHl位点和PGK终止子(PGKt)的1，050bp DNA片段用 HindIII和XbaI DNA限制酶消化后从质粒pGl中切除。通过琼脂糖凝胶电泳分离出DNA片 段，并用DNA提取试剂盒(Qiagen)纯化并克隆至预先用HindIII和XbaI消化的Y印352质 粒中。使得到的质粒PTT10301质粒在大肠杆菌中生长，并用商购的DNA纯化JETstar试剂 盒(Genomed Gmbh)纯化。图IB显示所产生的pTT10301质粒的限制性内切核酸酶分析。图2显示人TF蛋白的亲水性图。该图显示了蛋白质的四个结构域(前导序列结 构域、胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域)。图3显示人TF蛋白的cDNA序列(基因库#BC011029)。加外框于可读框(ORF)以 及起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)。cDNA序列包含人TF蛋白(hTF)的四个结构域 (信号肽、胞外结构域、跨膜区和胞质尾区)。箭头显示引物A(SEQ ID NO :2)[上游引物，编 码缺失信号肽的成熟hTF的前四个氨基酸，并包含在具有TF ORF的框内的起始密码子ATG] 的退火位置和引物B(SEQ ID NO :2)[下游引物，粗体为终止密码子]的退火位置，两者均包 含限制性BamHI位点(下划线)。图4显示用于产生PTT10302质粒的克隆策略的图示(图4A)。将从PCR反应获 得的DNA片段用BamHI消化并克隆至预先用BamHI消化和去磷酸化的pTT10301质粒中。 使所得质粒(ΡΤΤ10302)在大肠杆菌中生长并用商购的DNA纯化JETstar试剂盒(Genomed Gmbh)纯化。图4B显示所产生的PTT10302质粒的限制酶切分析。图5显示rTF在不同重组酵母克隆中的表达。通过使用纯化的小鼠抗人⑶142单 克隆抗体(BID Biosciences Pharmingen)进行酵母提取物的Western印迹分析，所述酵母 用空质粒pTT10301(C_)和用包含重组成熟hTF蛋白的表达载体，pTT10302(泳道1_8)转 化。以kDa表示的分子量标记示于图的左侧。
图6显示在用内切糖基化酶(endoglycosylase)处理yTT10301提取物后的 Western印迹结果。因此，按照制造商的说明，在37°C下将来自表达rTF的酵母(yTT10301) 的提取物用500单位内切糖基化酶H (Endo H)(泳道2)或N-糖苷酶F (PNGase F)(泳道3) 处理1小时。使用抗人TF mAb通过Western印迹分析这些样品和未处理的提取物(泳道 1)。以kDa表示的分子量标记示于图的左侧。图7是显示rTF通过yTT10301重组酵母的表达的激光共聚焦显微镜照片。将来自 表达rTF的重组酵母的原生质球(Spheroplasts)用4%多聚甲醛固定，并用抗酵母ATPase mAb (图7A)或抗人mAb (图7B)孵育。在用与荧光素偶联(f luorescein-conjugated)的山 羊抗小鼠二抗孵育后，通过共聚焦显微镜(1、3、5和7)或通过相差显微镜(2、4、6和8)来 观察细胞。图像取自BIO-RAD Radiance 2000激光共聚焦显微镜。图8是显示rTF通过重组酵母的表达取决于pTT10302质粒存在的激光共聚焦显 微镜照片。将来自携带空表达质粒ΡΤΤ10301的重组酵母(yTT10300)的原生质球用4%多 聚甲醛固定，并用抗酵母ATPase的mAb (图8A)或用抗人TF mAb (图8B)孵育。在用荧光 素偶联的山羊抗小鼠二抗孵育后，通过共聚焦显微镜(1和3)或通过相差显微镜(2和4) 来观察细胞。图像取自BIO-RAD Radiance 2000共聚焦激光显微镜。图9显示rTF与酵母膜结合。将来自yTT10301的提取物用TritonXlH处理，并 且在离心后分离水相和去垢剂沉淀。再次用Triton X114(l%终浓度)处理水相，并且如 前所述分离两相。将第二去垢剂沉淀与第一去垢剂沉淀混合。用SDS-PAGE和考马斯蓝染 色(图9A)或通过与抗人TF的mAb反应的Western印迹(图9B)来分析完整提取物(泳 道1)、第一(泳道2)水相、第二(泳道3)水相和去垢剂相(泳道4)。图10是显示在整个发酵过程中主要参数演化的图。作为唯一不受控制的参数的 氧分压(PO2)的变化反映了细胞在该过程中需氧量的变化。当PO2达到稳定状态(18小时) 时停止发酵。图11是表示用于制备CYE-TF的发酵过程的总体方案的图。图12显示Western印迹分析结果以确定TF是否存在于由第一发酵试验获得的制 剂中。每一泳道对应于5μ 1通过图11中所述的操作获得的上清液(sn)或沉淀(PP)。使 用抗人TF的特异性mAb通过Western印迹来分析蛋白样品。阳性对照(rTF)是商购的在 大肠杆菌中产生的重组TF(IOng) (American Diagnostica，Inc.)。以kDa表示的分子量标 记示于图的左侧。图13显示CYE-TF样品的电子显微镜图像。CYE-TF产物被吸附至预先通过辉光 放电(glow discharge)处理的碳包被的铜网。在用抗hTF的特异性mAb或用无关抗体孵 育前，用包含3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS孵育该网1小时。用PBS彻底洗涤网，并用金 偶联的兔抗小鼠IgG 二抗孵育。洗涤网并通过用乙酸铀处理来负染样品。由JE0L1200 EXII电子显微镜获得图像。箭头表示胶态金颗粒的位置。图14显示通过切向流过滤(Tangential Flow Filration)的CYE-TF的澄清程序 图解。A)使 CYE-TF 在错流过滤系统(Sartorius sartofIowSlice 200 Benchtop)中进行 切向流过滤(TFF)。将CYE-TF通过0. 45 μ m、0. 2 μ m禾口 0· 1 μ m膜(Sartorius，聚砜)连续 过滤。预先用磷酸盐缓冲液(20mM磷酸钠，pH为7.4，500mM NaCl)平衡该膜。回收在通过 0. 2 μ m膜过滤后和在0. 10 μ m膜过滤前仍然保留的物质，并将其用作用于接下来的纯化步骤的起始物质。B)使用动态光散射(Dinamic lightscatering)来测定微泡的粒径分布。图15显示在S印hacryl S-500柱中进行的CYE-TF产物的尺寸排阻色谱图。于 4°C在lmL/min流速下用磷酸盐缓冲液进行洗脱并收集4mL组分。通过测量280nm处的光 密度来监测蛋白洗脱。图16显示Western印迹测定法以检测rTF。将15 μ L各组分在12. 5% -SDS-PAGE Tris-甘氨酸凝胶上进行电泳。电泳后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。然后将膜用抗TF商 购的小鼠单克隆抗体(AmericanDiagnostica)孵育1小时。然后将膜用兔抗小鼠IgG抗体 孵育，随后用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG抗体孵育。使用ECL高级Western印迹 试剂盒(GE Healthcare)通过化学发光法来检测免疫反应性蛋白。图17显示包含由尺寸排阻色谱法纯化的rTF的不同批次(lot)微泡的蛋白图谱 (protein profile)。Α)将来自包含rTF的四个不同批次的纯化微泡的蛋白(如图上方所 示)通过SDS-PAGE分级，并将凝胶用考马斯蓝染色。分子量标记示于图的左侧。B)在将染 色的凝胶扫描后，将各批次中的不同蛋白条带进行密度测定分析。图18显示薄层色谱法(TLC)分析。PA 磷脂酸(Sigma)，PS 磷脂酰丝氨酸 (Fluka)，PG 磷脂酰甘油(Sigma)，CAR 心磷脂(Sigma)，ERG 麦角固醇(Fluka)，PE 磷 脂酰乙醇胺(Sigma)，PI 磷脂酰肌醇(Sigma)，PC:磷脂酰胆碱(Sigma)，TAG 三酰甘油 (Sigma)ο图19显示人TF蛋白的cDNA序列(基因库#BC011029)。加外框于可读框(ORF) 以及起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)。cDNA序列包含人TF(hTF)蛋白的四个结构域 (信号肽、胞外结构域、跨膜区和胞质尾区)。箭头显示引物A(SEQ ID N0:1)[上游引物，编 码缺失信号肽的成熟hTF的前四个氨基酸，并包含带有TF ORF的框内的起始密码子ATG] 的退火位置和引物E(SEQ ID NO :3)[下游引物，粗体为编码组氨酸的核苷酸]的退火位置， 两者均包含限制性BamHI位点(下划线)。图20显示产生PTT10303的克隆策略。图20A显示将从PCR反应获得的DNA片 段用BamHI消化并克隆至预先用BamHI消化并去磷酸化的pTT10301质粒中。使所得质粒 ΡΤΤ10303在大肠杆菌中生长并用商购DNA纯化JETstar试剂盒(Genomed Gmbh)纯化。图 20Β显示所产生的ΡΤΤ10303的限制酶切分析。图21显示rTF-his-标签的表达的Western印迹分析结果。对来自重组酵母 yTT10302(泳道1_4，对应于克隆2至5)的培养物的提取物和在大肠杆菌(C+)中产生的 rTF进行Western印迹分析。将印迹与纯化的小鼠抗人⑶142单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)反应。以kDa表示的分子量标记示于图的左侧。图22也显示了 rTF-his-标签的表达的结果。图22A显示来自酵母yTT10300 (泳 道1)、表达rTF的yTT10301 (泳道2)或表达rTF-his-标签的yTT10302(克隆#5)(泳道
3)的SDS-PAGE和考马斯蓝染色。阳性对照对应于在大肠杆菌中产生的5ng的rTF(泳道
4)。图22B是使用纯化的小鼠抗人CD142单克隆抗体(BDBiosciences Pharmingen)对与 图17A所示样品相同的样品进行Western印迹分析。以kDa表示的分子量标记示于图的左 侧。图23示意性地显示6HT-TF的纯化过程。图24显示通过亲和色谱法纯化6HT-TF的结果。CYE_6HT_TF用作起始物质。通过切向过滤将提取物通过0. 2 μ m孔径过滤器过滤，并将其应用至5ml商购金属螯合亲和色谱 柱(HiTrap , PharmaciaBiotech)。将该柱分别用不含咪唑、含IOmM咪唑和含IOOmM咪 唑的起始缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，500mM NaCl, pH 7.4)连续洗涤三次。将6HT-TF用 含有IM咪唑的相同缓冲液洗脱。收集2.5ml洗脱组分(泳道4至7，分别对应于组分#1、 #2、#3和#4)，并对20mM磷酸盐缓冲液、50mM NaCl、pH 7. 4进行透析。通过SDS-PAGE和 Western印迹(图24A)或者银染法(图24B)分析起始过滤的酵母提取物(泳道1)、未结 合的物质(泳道2)、用含有IOOmM咪唑的起始缓冲液进行的末次洗涤液和前四个洗脱组分。 以kDa标记的分子量标记示于图的左侧。图25显示用内切糖基化酶处理后纯化的6HT-TF的Western印迹分析的结果。按 照制造商的说明书，将6HT-TF的纯化组分用500单位PNGase F(泳道2)或Endo H(泳道 3)处理。用抗人TF mAb通过Western印迹分析这些样品和未处理的洗脱液(泳道1)。以 kDa表示的分子量标记示于图的左侧。图26显示通过亲和色谱法纯化的6HT-TF的免疫电子显微镜检查的结果。将第一 洗脱组分吸附至胶体包被的铜网。该网用抗TF单克隆抗体处理用于免疫金标记。图27是本发明的携带TF的酵母来源的微泡的图示。图22A显示本发明的携 带TF的酵母来源的微泡的示意图，所述微泡包含酵母来源的膜(1)和整合到所述酵母 来源的膜(1)中的TF蛋白(2)(或其具有促凝活性的片段)。显示了内微泡空隙(3) (intra-microvesicle space)禾口夕卜微泡空隙(4) (extra—microvesicle space)。图 22B 禾口 22C显示本发明的携带TF的酵母来源的微泡的基本结构。酵母来源的膜脂双层的脂质是两 亲性的；它们具有指向外微泡空隙⑷的亲水极性头(5)和指向内微泡空隙(3)的两个疏 水烃尾。在图22B所示的实施方案中，具有促凝活性的TF蛋白(2)或其片段的N-末端结 构域朝向外微泡空隙(4)。在图22C所示的实施方案中，具有促凝活性的TF蛋白(2)或其 片段的N-末端结构域朝向内微泡空隙(3)。图28显示人TF蛋白的cDNA序列(基因库#BC011029)。加外框于可读框(ORF) 以及起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)。cDNA序列包含人TF(hTF)蛋白的四个结构域 (信号肽、胞外结构域、跨膜区和胞质尾区)。箭头显示引物F(SEQ ID NO :4)[上游引物，编 码缺失信号肽的成熟hTF的前四个氨基酸，并包含具有TF ORF的框内的始密码子ATG]的 退火位置和引物E(SEQ ID NO :3)[下游引物，粗体为编码组氨酸的核苷酸]的退火位置，两 者均包含限制性BamHI位点(下划线)。图29.产生PTT10304的克隆策略。A)将从PCR反应获得的DNA片段用BamHI消 化并克隆至预先用BamHI消化并去磷酸化的pTT10301质粒中。使所得质粒ρΤΤ10304在 大肠杆菌中生长并用商购DNA纯化JETstar试剂盒(Genomed Gmbh)纯化。B)所产生的 PTT10304载体的限制内切分析。图30显示人TF的糖基化位点中的点突变位置的图示。图31显示用抗TFl抗体探测的Western印迹。PMl是指在11位的Ala-Asn变化， PM2是指在124位的Ala-Asn变化，以及PM3是指在137位的Asn-Ala变化。PM1，2 ;1，3 ； 以及1，2，3是指它们的组合。TT103MH是野生型TF。图32. TT-103和再脂化的rTF的促凝活性的剂量-反应曲线。使用混合的正常人 血浆和不同浓度来自不同集合(pool)的TT-103或再脂化的rTF在血凝仪中测量促凝活性。图33显示未处理的TT-103 (1)、经过曲拉通X-100 (Triton X-100)处理的 TT-103(2)、在透析后经过曲拉通X-100处理的并使rTF再脂化的TT_103(3)、空脂质体(4) 和来自非表达rTF重组酵母的微泡(5)的体外促凝活性。在样品1、2和3中由ELISA测定 的rTF的量相同(120ng/mL)。图34显示与再脂化的rTF、凝血酶和凝血活酶含钙试剂(Thromborel S)相比， TT-103在肝素化血浆(TT-103)中的促凝活性。发明详述本发明的携带TF的酵母来源的微泡一方面本发明涉及携带组织因子的酵母来源的微泡，下文称为“本发明的携带TF 的酵母来源的微泡”，其包含(i)酵母膜，以及(ii)具有促凝活性的组织因子(TF)蛋白或 其变异体，其中所述具有促凝活性的组织因子(TF)蛋白或其片段被整合到所述脂双层中。 本发明的携带TF的酵母来源的微泡具有促凝活性，并且它能够用作治疗个体出血的药物。如本文所使用的，术语“酵母来源的微泡”是指基本上由来自酵母细胞的膜或其片 段组成的封闭小区室。一般来说，膜是指形成细胞边界(即细胞膜或质膜)或胞内细胞器 边界的几个分子厚度的有机层(organized layer)。本发明的携带TF的酵母来源的微泡的组分(i)是酵母膜，其来自于用于制备本发 明的携带TF的酵母来源的微泡的酵母细胞。通常，膜由两层定向脂层(即脂双层)组成， 其中能够植入蛋白质。在水性环境中，作为细胞膜基本结构的脂双层通常由两性分子(例 如磷脂、脂肪酸等)形成，每一分子被定向为亲水基团在所述层的外部且疏水基团向着所 述层的内部。通常，蛋白质被植入脂双层中；因此本发明的携带TF的酵母来源的微泡包含 来自酵母细胞膜的蛋白质，其通常被整合到所述酵母细胞膜中。在具体实施方案中，所述酵母来源的微泡衍生自酵母细胞膜或其片段，例如酵母 细胞质膜或其片段。在另一具体实施方案中，所述酵母来源的微泡衍生自细胞内的酵母细 胞器膜或其片段，例如核、高尔基体、内质网等等。一般来说，所述酵母来源的微泡来自用于制备该微泡的酵母细胞(例如在将酵母 发酵产物进行如实施例1公开的方法所示的勻浆处理后)。实际上任何酵母细胞均能够用 于制备所述酵母来源的微泡，有利的是非絮凝酵母细胞(non-flocculent yeast cells), 并且优选由联邦药品管理局(FDA)分类为用于人类消耗的“公认为安全”(或GRAS)酵母 细胞的酵母细胞，因为所述GRAS批准的物质由于它们基本上对包括人类的动物无害而不 要求FDA的上市前批准。能够在制备本发明的携带TF的酵母来源的微泡方法中使用的酵 母细胞的示例性而非限制性实例是所谓的酒类酵母(liquor yeast)菌种，其通过代谢酿造 材料液体产生乙醇、二氧化碳、面包酵母(Baker’ s yeast)等等。具体地，优选的酵母细胞 包括来自酵母属(Saccharomyces sp.)的酵母细胞等等，例如酿酒酵母(S. cerevisiae)菌 株T73 ura3_、酿酒酵母T73菌株的衍生物、广泛用于酿酒(实施例1)的菌株或毕赤酵母 (Pichia sp.) 0本发明的携带TF的酵母来源的微泡的组分(ii)是具有促凝活性的组织因子(TF) 蛋白或其变异体。如本文所使用的“TF变异体”是指通过置换、插入或添加一个或多个氨基酸衍生自TF的任何多肽。在具体实施方案中，本发明的携带TF的酵母来源的微泡的所述组分(ii)是TF蛋白。本文所使用的术语“组织因子”或“TF”包括任何动物物种的天然或野生型(Wt) TF，以及保持所述wt TF的至少一种功能的突变体，有利的是，保持涉及凝血的wt TF的功 能，所述任何动物种类包括人类。TF蛋白是广泛分布于动物界的完整的膜糖蛋白，如天然发现的那样，其由蛋白质 成分(蛋白质)和磷脂组成。某些糖基化位点存在于TF蛋白中，用于将寡糖侧链添加至 所述蛋白质以提供糖基化形式的TF蛋白。根据糖基化程度能够获得不同糖基化形式的 TF蛋白。在这点上，成熟TF包含Asn-Xaa-Ser/Thr形式的三个潜在N-连接糖基化位点 (Asnn-Leu12-Thr13,Asn124-Val125-Thr126 和 Asn137-Asn138-Thr139)。酵母中的 N-连接糖基化通 常包括涉及约10个甘露糖残基的内部核心和50-100甘露糖残基的分支外链，所述内部核 心经由两个GIcNAC残基与天冬酰胺连接。因此，N-连接糖基化能够将多达300个甘露糖残 基潜在地添加至TF，分子质量增加约60kDa。此外，也可以将若干个甘露糖残基与多个(多 于25) 0-连接糖基化位点连接。在具体实施方案中，本发明的携带TF的酵母来源的微泡包 含糖基化的TF蛋白。如本文所使用的术语“糖基化”包括任何程度的糖基化。本发明的携带TF的酵母来源的微泡的示意图在图27中显示。TF蛋白具有结构域结构，即它是具有独立功能区的蛋白质。在具体实施方案中，所 述TF蛋白是人TF(hTF)蛋白。hTF蛋白的各结构域具有独特的结构特征和功能特征(1) 具有32个氨基酸前导序列的信号肽或区域，当该蛋白从未成熟形式被加工为成熟形式时， 该信号肽或区域被翻译后加工；(2)包含约219个末端氨基酸的N-糖基化亲水性胞外结构 域；(3)约23个氨基酸的片段，主要为疏水性，这些氨基酸被认为是跨膜结构域氨基酸；以 及(4)21个氨基酸的羧基端，其被认为是蛋白胞质片段的氨基酸形成部分。hTF蛋白的结 构域结构允许产生例如蛋白质或其功能片段的胞外结构域。hTF蛋白的氨基酸序列是已知 的，并可在诸如NCBI的蛋白质数据库中查到(hTF，访问号码(Access number) :P13726)。此外，TF蛋白可以是融合蛋白的一部分，所述融合蛋白包含含有TF蛋白的第一区 域，所述TF蛋白与包含另一肽或蛋白的第二区域结合。所述第二区域可以与所述TF蛋白 的氨基末端区域结合，或者所述第二区域可以与所述TF蛋白的羧基末端结合。第一区域和 第二区域均可以彼此直接连接或者可以通过所述第一区域和第二区域间的连接多肽结合。在具体实施方案中，所述融合蛋白包含TF蛋白和标签，所述标签与所述TF蛋白的 C-末端或N-末端结构域结合，通常为肽标签。所述标签通常是能够用于分离和纯化所述融 合蛋白的肽或氨基酸序列。因此，所述标签能够与一个或多个配体结合，例如，诸如色谱支 持体或高亲和力磁珠的亲和基质的一个或多个配体。所述标签的实例是能够以高亲和力与 镍(Ni2+)柱或钴(Co2+)柱结合的组氨酸标签(His-标签或HT)，例如包含6个组氨酸残基 (His6或H6)的标签。如实施例2和实施例3所示，His-标签具有能够在大部分蛋白变性 且大部分蛋白-蛋白相互作用破坏的条件下与其配体结合的期望特征。因此，它能够在诱 饵已经参与的蛋白_蛋白相互作用被破坏后用于除去用H6标签的诱饵蛋白。用于分离或纯化融合蛋白的标签的其它示例性而非非限制性实例包括Arg-标 签，FLAG-标签，Strep-标签，能够被抗体识别的表位，例如c-myc-标签(被抗c-myc抗体识别)、SBP-标签、S-标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结 构域、谷胱甘肽S-转移酶-标签、麦芽糖结合蛋白、NusA、TrxA, DsbA、Avi-标签等 等(TerpeK.，Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003)，60 :523_525)，氨基酸序列，例如 Ala-His-Gly-His-Arg-Pro ；Pro-11e_His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-11e_His_S er ；Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys ； β -半乳糖苷酶等等。在具体实施方案中，所述标签是与所述TF蛋白的C-末端结构域结合的His-标 签。在另一实施方案中，所述标签是与所述TF蛋白的N-末端结构域结合的His-标签。所述融合蛋白还具有促凝活性。所述融合蛋白的促凝活性能够如前所述进行测 定，例如通过实施例4中提到的任何凝固分析，例如通过血浆中的体外凝固分析，或者通过 非抗凝全血中的体外凝固分析，或者通过严重出血动物模型的体内测定或通过致命性动物 出血模型的体内测定，例如实施例4中提到的那些测定法。所述融合蛋白可以通过常规手段获得，例如通过使编码所述融合蛋白的核苷酸序 列在合适的酵母细胞中进行基因表达。如果需要，能够使用终标签(eventual tag)来分离 或纯化所述融合蛋白。在另一具体实施方案中，本发明的携带TF的酵母来源的微泡的所述组分(ii)是 具有促凝活性的TF片段。如本文所使用的，术语“具有促凝活性的TF蛋白片段”包括当其被脂化时具有促 凝活性的来自TF的任何肽。TF片段的促凝活性能够通过任何常规测定法容易地测定，例如 通过实施例4中提到的任何凝固分析。仅作为示例性说明，TF片段的促凝活性能够通过以 下分析测定通过血浆中的体外凝固分析，或者通过非抗凝全血中的体外凝固分析，或者通 过严重出血动物模型的体内测定或通过致命性动物出血模型的体内测定，例如实施例4中 提到的那些测定法。所述具有促凝活性的TF蛋白片段的氨基酸序列能够与天然TF蛋白的相应片段 的氨基酸序列一致，或可选地，或者它相对于天然TF蛋白可以具有一个或多个氨基酸的插 入、缺失或修饰，前提是是所得TF蛋白片段具有促凝活性。在具体实施方案中，具有促凝活性的TF片段包含成熟TF蛋白。如本文所使用的， 术语“成熟TF”是指氨基酸序列缺乏信号肽的TF蛋白。在优选实施方案中，所述成熟TF蛋 白包括人成熟TF蛋白。此外，在具体实施方案中，所述人成熟TF蛋白具有在SEQ ID NO=I 中示出的氨基酸序列。在另一具体实施方案中，具有促凝活性的TF蛋白片段是TF蛋白，其中负责与 FVIIa结合的全部或部分结构域缺失，因此所得蛋白不能与FVIIa结合。具有促凝活性但缺 失负责与FVIIa结合的结构域的所述TF蛋白片段在本说明书中有时被称为“截短TF蛋白” 或“截短型TF”。推而言之，所述“截短TF蛋白”可以包括具有促凝活性的TF蛋白突变体， 其中负责与FVIIa结合的结构域不是功能性的。在具体实施方案中，所述截短TF蛋白包含与因子X、跨膜区和胞质尾区相互作用 结构域，并部分或全部缺失负责与FVIIa结合的结构域。此外，在具体实施方案中，所述截 短TF蛋白是截短型人TF蛋白，其包含与因子X(aa 174-251)、跨膜区(aa 252-274)和胞质 尾区(aa275_295)相互作用的结构域，以及额外组氨酸标签(extra histidine tag)(实施 例3)。发明人现在意外地发现缺失负责与FVIIa结合的结构域的所述截短型TF蛋白具有促凝活性(实施例4，表3)。本发明的作者已经意外地发现缺失部分或全部负责与FVIIa结合的结构域的所 述TF片段具有促凝活性。该结果令人惊讶，因为众所周知在血液凝固的外源途径中，在损 伤部位的外膜细胞上暴露的TF结合循环凝血因子VII/活化的凝血因子VII (FVII/FVIIa)， 以形成TF: FVIIa复合物，当钙离子存在时作为使FX活化的基质。公认如果发生由血管损 伤导致的出血，则由于涉及TF与其配体，FVII/FVIIa的相互作用的外源途径活化，将启动 凝血。在另一实施方案中，修饰的TF在负责与FVIIa结合的结构域中包含一个或多个突 变，其导致修饰的TF不能与所述FVIIa结合，或虽然能够结合，但亲和力显著降低。已知TF 的FVIIa结合结构域中的点突变破坏了 TF与所述FVIIa的结合是本领域公知的(例如由 Kelley,R. F.等人在1995,Biochemistry, 34 10383-10392中描述的那些，其内容因而以引 用的方式整体并入本文)。本发明的作者还观察到当所述TF在糖基化位点中携带突变时，TF的促凝活性以 及它在酵母宿主细胞中的表达增加，所述突变防止在野生型TF中发现的三个N-连接糖基 链中的至少一个的连接。因此，在具体实施方案中，本发明的携带TF的酵母来源的微泡包 含具有促凝活性的TF蛋白的非糖基化片段。如上所述，术语“糖基化”包括任何程度的糖 基化。在优选实施方案中，TF变异体是多肽，其中TF的至少一个N-糖基化位点已经被修饰 以致于使其为非功能性的，即不能用作添加糖苷链的受体位点。能够被修饰的TF序列中的 N-糖基化位点是上文提到的那些，即Asn11-Leu12-Thr13位点、Asn124-VaI125-Thr126位点和/或 Asn137-Asn138-Thr139位点。N-糖基化共有区的任何修饰均适合，只要N-连接糖基链的添加 被取消或被基本抑制。优选地，在与成熟人TF中的11位、124位和/或136位对应的Asn 残基处引入修饰，因为这是用作连接糖基链的受体。如本发明所使用的“与成熟人TF中的 位点11、124和/或136对应的位点”涉及其它TF直向同源物(ortholog)中的N-糖基化 位点，其可以在多肽链中的不同位置出现，但是当基于序列相似性比对人和直系同源序列 时，其与成熟人TF中的N-糖基化位点匹配。因此，用于比对或重复TF序列并因此用于识 别与人成熟TF中的位点对应的TF直向同源物中的N-糖基化位点的合适算法是PILEUP程 序，其形成 GCG 软件包的一部分(GeneticsComputer Group，Program Manual for the GCG Package, Version 7，Madison, Wis. )。PILEUP使用渐进、双序列比对从一组相关序列中创 建多序列比对以显示相互关系和序列同源性百分数。它还标绘了显示用于创建比对的聚类 关系的树图或树状图。PILEUP 使用 Feng 和 Doolittle，J. Mol. Evol. ,35 351-360 (1987) 描述的渐进比对方法的简化处理。优选地，11、124和/或136位的Asn残基被Ala置换。 因此在优选实施方案中，形成微泡的一部分的TF变异体选自人成熟TF中的NlΙΑ、N124A、 N137A、NllA 和 N124A、NllA 和 N137A、N124A 和 N137A 和 Nl ΙΑ、N124A 和 N137A。在任何其 它TF直向同源物中，在形成N-连接糖基化共有位点的相应Asn残基处发生突变。此外，正如同TF蛋白那样，用于实施本发明的具有促凝活性的TF蛋白片段可以是 融合蛋白的一部分，所述融合蛋白包含含有具有促凝活性的所述TF蛋白片段的第一区域， 所述TF蛋白片段与包含另一肽或蛋白的第二区域结合。所述第二区域可以与所述TF蛋白 片段的氨基末端区域结合，或者所述第二区域可以与所述TF蛋白片段的羧基末端区域结 合。第一区域和第二区域可以彼此直接结合或者可以通过所述第一区域和第二区域间的连接多肽进行结合。在具体实施方案中，所述融合蛋白包含具有促凝活性的TF蛋白片段和与所述TF 蛋白片段的C-末端或N-末端结构域结合的标签。所述标签通常是能够用于分离或纯化所 述融合蛋白的肽或氨基酸序列。适于制备该融合蛋白的标签的示例性而非限制性实例包括 与其中第一区域是TF蛋白的融合蛋白连接的如前所述的那些。在具体实施方案中，所述标 签是与所述具有促凝活性的TF蛋白或其片段的C-末端结构域结合的His-标签。在另一 实施方案中，所述标签是与所述具有促凝活性的TF蛋白或其片段的N-末端结构域结合的 His-标签。该融合蛋白也具有促凝活性，其促凝活性能够如前所述测定，例如通过实施例4 中提到的任何凝固分析。根据本发明，所述具有促凝活性的TF蛋白或其片段的一部分被整合到所述酵母 膜中。通常，所述部分包含所述蛋白或片段的亲脂区(即TF的中心结构域)，而其亲水区 (即所述TF蛋白的氨基末端区域和羰基末端区域)面向膜的外质侧或内质侧。关于TF蛋 白的亲脂区和亲水区的信息能够从图2获得，该图是TF蛋白的亲水性图。实施例1，第1.4 节显示所述具有促凝活性的TF蛋白或其片段被整合到膜中(即它是膜相关蛋白)。在具体实施方案中，具有促凝活性的TF蛋白或其片段的N-末端结构域面向所述 膜的外质侧，而在另一具体实施方案中，所述具有促凝活性的TF蛋白或片段的N-末端结构 域面向所述膜的内质侧(图27)。本发明的携带TF的酵母来源的微泡的大小能够在较宽范围内变化，通常所述尺 寸等于或小于ι μ m,通常等于或小于0. 1 μ m。在具体实施方案中，本发明的携带TF的酵母 来源的微泡的尺寸为0. 1 μ m至0. 01 μ m，该尺寸由电子显微镜测定(实施例1，第1. 6节)。用于泡丨备本发日月的携带TF本发明的携带TF的酵母来源的微泡通常能够通过重组技术获得。因此，在其它方 面，发明涉及用于制备具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡(即本发明的携带TF的 酵母来源的微泡)的方法，下文称为“本发明的方法”，其包括a)将表达具有促凝活性的TF蛋白或其片段的重组酵母细胞的培养物在允许所述 具有促凝活性的TF蛋白或其片段表达的条件下发酵；b)将从步骤a)的发酵所得的产物沉淀，以提供发酵产物；c)将从步骤b)获得的所述发酵产物勻浆，以提供发酵勻浆液；以及d)将从步骤C)获得的所述发酵勻浆液分离，以提供沉淀和包含所述具有促凝活 性的携带TF的酵母来源的微泡(即本发明的携带TF的酵母来源的微泡)的澄清酵母提取 物(CYE)；e)收集包含所述具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡的所述澄清酵母提取 物(CYE)；以及，任选地，f)如果需要，将所述具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡分离或纯化。表达具有促凝活性的TF蛋白或其片段的重组酵母细胞能够通过本领域技术人员 已知的常规重组方法来获得。简而言之，用包含编码具有促凝活性的TF蛋白或其片段的核 苷酸序列的酵母表达载体来转化酵母细胞，所述核苷酸序列可操作地与酵母功能性启动子 连接。可以使用作为模板的cDNA库和适当引物，通过聚合酶链反应(PCR)来扩增编码具有促凝活性的TF蛋白或其片段的cDNA。实施例1中公开了编码成熟hTF蛋白的cDNA的扩 增；实施例2中公开了在3’端具有18个额外核苷酸(extra nucleotide)(编码6个组氨 酸)的编码成熟hTF蛋白的cDNA的扩增；以及实施例3公开了在3’端具有18个额外核苷 酸(编码6个组氨酸)的编码截短型hTF蛋白(TTF)的cDNA的扩增，所述截短型hTF蛋白 包含与因子X相互作用结构域、跨膜区和胞质尾区。如本文所使用的“载体”是指能够运载已经与其连接的另一核酸的核酸分子。如 本文所使用的，术语“酵母表达载体”是指能够在酵母中合成个体蛋白的DNA表达构建体， 例如核酸片段、质粒、粘粒、噬菌体、病毒或病毒颗粒，所述个体蛋白由载体携带的其各自重 组基因(即具有促凝活性的TF蛋白或其片段)编码。或者，核酸片段还可以使用不定向 (non-directional)重组或同源重组用于制备转基因酵母细胞，其中基因或感兴趣基因被 稳定地整合到酵母基因组中。通常，酵母表达载体包含可操作地与酵母细胞中的功能性启 动子(即酵母功能性启动子)连接的、编码具有促凝活性的TF或其片段的核苷酸序列。本发明中使用的载体是例如能够在酵母细胞中自主复制和/或表达与其连接的 核酸的载体。在本说明书中，术语“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用 形式。此外，本发明意旨包括发挥等同功能并此后变为本领域公知的此类其它形式的表达 载体。所述酵母表达载体可以是酵母游离表达载体或酵母整合表达载体，并且它们能够通 过本领域技术人员已知的常规技术来获得。因此，在实施方案中，所述酵母表达载体是酵母游离表达载体。如本文所使用的术 语“酵母游离表达载体”是指在酵母细胞质中作为染色体外DNA分子存在的表达载体。在 具体实施方案中，除了可操作地与酵母功能性启动子连接的、编码具有促凝活性的TF蛋白 或其片段的核苷酸序列以外，所述酵母游离表达载体还包含(i)酵母选择基因；(ii)酵母 复制起点；(iii)细菌选择基因；以及(iv)酵母转录终止信号。有利的是，所述酵母游离表 达载体还包含用于在酵母功能性启动子的控制下克隆所选基因(具有促凝活性的TF蛋白 或其片段)的唯一限制位点，其后是酵母转录终止信号。实际上任何酵母功能性启动子、酵母选择基因、酵母复制起点、细菌选择基因、酵 母转录终止信号和用于克隆的限制位点均能够用于制备所述酵母游离表达载体；然而，在 具体实施方案中，将甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(pGPD)用作酵母功能性启动子；在另一 具体实施方案中，将URA3基因(URA3)用作酵母选择基因；在另一具体实施方案中，将酵母 2微米(2 μ)复制起点用作酵母复制起点；在另一具体实施方案中，将氨苄青霉素抗性基因 (Amp)用作细菌选择基因；以及在另一具体实施方案中，将磷酸甘油酸激酶的转录终止信 号(PGKt)用作特异性酵母转录终止信号。因此在具体实施方案(实施例1-3)中，酵母游 离表达载体包含(i)URA3基因；(ii)用于在大肠杆菌中选择和增殖载体的Amp基因；(iii) 酵母2 μ复制起点；(iv)pGPD; (v)PGKt的特异性酵母转录终止信号；以及(vi)在pGPD的 控制下允许克隆所选基因的唯一 BamHI限制位点，其后是PGKt序列。在另一具体实施方案中，所述酵母表达载体是酵母整合表达载体。如本文所使用 的，术语“酵母整合表达载体”是指能够整合到酵母基因组中的载体。在具体实施方案中， 所述酵母整合表达载体包含(i)细菌选择基因；以及(ii)插入酵母选择基因中的表达盒， 所述表达盒还包含酵母功能性启动子、酵母转录终止信号和用于克隆所选基因(具有促凝 活性的TF蛋白或其片段)的唯一限制位点。
实际上任何细菌选择基因、插入酵母选择基因中的表达盒、酵母功能性启动子、酵 母转录终止信号和用于克隆所选基因的唯一限制位点均能够用于制备所述酵母整合表达 载体；然而，在另一具体实施方案中，将氨苄青霉素抗性基因(Amp)用作细菌选择基因；在 另一具体实施方案中，将插入URA3基因的中心区中的表达盒pGPD-BamHI-PGKt用作包含酵 母功能性启动子(PGDP)、酵母转录终止信号(PGKt)和用于克隆URA3基因的中心区中的所 选基因的唯一限制位点(BamHI)的表达盒。事实上易于被包含可操作地与酵母功能性启动子连接的、编码具有促凝活性的 TF蛋白或其片段的核苷酸序列的所述酵母表达载体转化的任何酵母细胞都能够用于本发 明。用所述酵母表达载体对酵母细胞的转化能够通过本领域技术人员已知的常规技术实施 (Sambrook etal. , 2001, Molecular Cloning :A Laboratory Manual)。在优选实施方案中，所述酵母是非絮凝酵母(即当将其在发酵过程中分散时不会 絮凝(聚集)的酵母细胞)。有利的是，所述酵母细胞是GRAS酵母细胞。能够用于本发明 方法的酵母细胞的示例性而非限制性实例是通过代谢酿造材料液体产生乙醇、二氧化碳、 面包酵母等的所谓酒类酵母菌种(用于产生酒类的酵母)。具体地，优选选自酿酒酵母的酵 母。这样的酒类酵母的实例包括啤酒酵母细胞、葡萄酒酵母细胞和清酒酵母细胞。在本发 明的优选实施方案中，酵母细胞是葡萄酒酵母细胞，例如酿酒酵母T73 Ura3_(实施例1_3)。一旦酵母细胞被转化，下一步骤在于使表达具有促凝活性的TF蛋白或其片段的 重组酵母细胞的培养物在允许表达所述具有促凝活性的TF蛋白或其片段的条件下发酵。 在具体实施方案中，所述酵母细胞在适当培养基中生长，其中所述酵母细胞能够表达所需 异源产物(具有促凝活性的TF蛋白或其片段)。使酵母细胞生长的适当培养基是本领域技 术人员公知的，并且根据待培养的酵母细胞从最适合的培养基中选择。可以使用制备发酵 产物的任何材料，只要它适合由所用的非凝集酵母细胞引起的发酵，并且能够任意使用已 知的材料。例如，在酒的制备中通常单独使用或适当组合使用麦芽、果汁、糖液、谷物糖化液 (cereal saccharified liquids)等等。并且当需要时可以向其中添加适当营养素等。发酵条件本质上与已知条件没有差别，并能够由本领域技术人员确定。在具体实 施方案中，发酵后在发酵的整个过程中控制主要参数的演化，当氧分压(PO2)达到稳定状态 时停止发酵。然后将由步骤a)所得的发酵产物通过常规方法沉淀，例如通过离心，并且在将所 述产物勻浆前在合适的裂解缓冲液中将其重悬浮。酵母能够通过常规方法勻浆，例如通过 勻浆器的高压来提供发酵勻浆液。然后将发酵勻浆液通过常规方法分离，例如通过离心，以提供能够分开收集的沉 淀和澄清酵母提取物(CYE)，所述酵母提取物包含所述具有促凝活性的携带TF的酵母来源 的微泡(即本发明的携带TF的酵母来源的微泡)的。本发明方法的总体方案示于图11。具有促凝活性的TF蛋白或其片段的存在能够通过常规方法测定，例如通过使用 特异性抗TF蛋白单克隆抗体(mAb)的Western印迹分析。此外，CYE的促凝活性能够通过 任何常规测定法测定，例如通过实施例4中提到的任何凝固分析，例如通常通过血浆或非 抗凝全血中的体外凝固分析等等。通过免疫电子显微镜对CYE样品的进一步检测显示出由抗TFmAb标记的酵母来源 的微泡存在于所述微泡的表面。包含具有促凝活性的TF蛋白或其片段的所述微泡还具有促凝活性，并与本发明的携带TF的酵母来源的微泡对应。任选地，如果需要，能够通过本领域技术人员已知的常规方法将根据本发明方法 预先获得的具有促凝活性的所述携带TF的酵母来源的微泡进行浓缩、分离或纯化。作为示 例性说明，在C-末端或N-末端包含肽标签(例如His-标签等等)的蛋白的亲和色谱法纯 化是用于获得大量蛋白的高纯度制剂的相当标准化的方法。作为任一种色谱方法，所述方 法能够容易地被放大试验。能够进行可选的纯化操作，如免疫亲和色谱，虽然它要求利用特 异性抗TF单克隆抗体或多克隆抗体的相当标准化的母液，尤其是对于放大生产。因此分离方法和纯化方法将取决于具有促凝活性的TF蛋白或其片段的性质，即 如果它是具有用来与亲和基质的一个或多个亲和配体结合的标签(例如His-标签等等) 的融合蛋白，所述亲和基质例如色谱支持体或高亲和力磁珠，或者如果它是能够被诸如 c-myc-标签(被抗c-myc抗体识别)的抗体识别的表位。图23通过示意图显示了用于纯化携带重组TF蛋白(或其具有促凝活性的片段) 的酵母来源的微泡[即携带(TF-His-标签蛋白)的酵母来源的微泡或如图23中提到的 “6HT-TF药品”]的方法，所述重组TF蛋白是与His-标签融合的融合蛋白形式。简言之，在 将根据上文公开的方法获得的包含携带(TF-his-标签蛋白)的酵母来源的微泡的澄清酵 母提取物(CYE)加载到适当亲和柱(例如HiTrap 亲和柱)之前进行过滤(例如通过切向 流过滤通过0. 2 μ m孔径过滤器)；然后在施加样品后，回收穿流物(flow-through)(未结 合的物质)，并且将柱进行几次洗涤，在最后洗涤后，通过在柱中添加适当缓冲液(例如包 含咪唑的缓冲液)来洗脱携带(TF-His-标签蛋白)的酵母来源的微泡并且收集洗脱组分 并透析，以提供分离或纯化的携带(TF-his-标签蛋白)的酵母来源的微泡。在另一实施方案中，也能够通过AKTA prime设备纯化本发明的携带TF的酵母 来源的微泡。AKTAprime是购自General ElectricHealthcare的自动液相色谱系统，其 能够用于标准纯化方案的开发，所述标准纯化方案能够容易地被放大以用于大规模生产。M于乡屯化包含来i真核宿t的感兴aa^iTffe本发明的作者也已经观察到存在于衍生自表达TF的细胞的澄清提取物中的泡囊 还能够使用尺寸分配(size partitioning)来富集。在不希望受任何理论约束的情况下， 应该相信使用具有确定孔径的膜的尺寸分配允许除去对蛋白的促凝活性不利的细胞提取 物的其它组分。应该相信由发明人开发的方法通常是适用于纯化真核宿主中的任何膜蛋 白，其中所述膜。因此，另一方面，本发明涉及用于制备包含感兴趣膜蛋白的微泡的制剂的 方法，其包括以下步骤(a)使真核宿主细胞的培养物在允许表达所述感兴趣膜蛋白的条件下生长；(b)将(a)的培养物中的细胞勻浆，(c)将由步骤(b)获得的勻浆液分离，以提供沉淀和澄清细胞提取物，所述细胞提 取物包含所述细胞来源的包含感兴趣膜蛋白的微泡；(d)将所述细胞来源的微泡通过尺寸分配纯化。步骤(a)使真核宿主细胞的培养物生长能够用于本发明的上下文中的真核宿主包括能够在实验室中或在生产装置中培 养的任何细胞，但是更优选能够被遗传操纵以允许感兴趣膜蛋白在细胞中表达的细胞。能 够用于本发明的宿主包括酵母(例如毕赤酵母)、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞系统(例如 COS、CHO、BHK,293, 3T3)。所用的真核宿主能够表达它们的蛋白作为正常蛋白质组的一部分或者可以通过 引入编码感兴趣膜蛋白的外源核酸而被修饰。在两种情况下，细胞需要在允许感兴趣膜 蛋白表达的条件下进行培养。如果感兴趣膜蛋白由核酸编码，该核酸在启动子的控制下可 以位于载体中。适合实施本发明的公知启动子的实例包括组成型启动子，例如在某些真 核病毒(多瘤病毒、腺病毒、SV40、CMV、禽类肉瘤病毒(avian sarcomavirus)、乙型肝炎 病毒)中发现的那些，金属硫蛋白基因启动子(metalothionein gen promoter)、单纯疱 疹病毒胸苷激酶启动子、逆转录病毒LTR区、免疫球蛋白启动子、肌动蛋白启动子、EF-I α 启动子以及诱导启动子，其中下游基因的表达要求添加外源信号物质至培养物，例如在 TO/2006/135436中描述的四环素启动子、NFkB/UV光、Cre/lox、热休克启动子、可调控的 聚合酶II启动子，以及组织特异性启动子，例如在W02006012221中描述的PSA启动子。使用任何适当的培养基来培养细胞。技术人员应该理解培养基必须根据待 使用的宿主细胞的类型来选择。然而，对于各细胞类型，技术人员可利用多种培养基， 如 Sambrook, J. et al. (Molecular Cloning ALaboratory Manual (分子克隆实验室 手册).2nd, ed. , Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY(1989))禾口 Ausubel et al. (Current Protocols in MolecularBiology (分子生物学通用方法)，eds. Ausubel et al, John Wiley & Sons (1992))中描述的那样。实际上能够根据本发明的方法表达和纯化任何膜蛋白。如果感兴趣蛋白是膜蛋 白，那么该蛋白能够如此表达，因为它会以宿主细胞的膜系统为靶标，前提是它包含信号序 列。能够使用本发明的方法表达的膜蛋白包括例如雌激素受体、氨基酸转运体、雄激素受 体、垂体受体、转铁蛋白受体、孕酮受体和葡萄糖转运体的受体、转运体。如果可溶蛋白在 N-末端与信号序列融合并在C-末端与跨膜结构域融合，也可以使用本发明的方法表达这 些可溶蛋白。这样，融合蛋白会插入到宿主细胞的膜中并在微泡中纯化。在优选实施方案 中，感兴趣膜蛋白是如上所述的rTF、其片段或其N-糖基化突变体。步骤(b)匀號在步骤(b)中，将培养物的细胞勻浆以获得勻浆液。需要使用技术人员可获得的 任何技术(离心、沉降、过滤等等)将细胞与培养基分离。一旦细胞被分离出，将这些细胞 勻浆以破裂细胞壁和质膜并将细胞内容物释放至缓冲液中，在其中进行勻浆。使用本领域 已知的任何适当方法使细胞破裂，例如高压、氮空化作用(nitrogen cavitation)、使用低 渗缓冲液的渗透休克法、超声处理、机械勻浆(mechanicalhomogeisation)、酶解组织破裂 法(enzymolytic tissue disruptionmethods)、超声破碎(sonification)。在不存在任何 去垢剂的情况下进行勻浆。优选通过高压进行勻浆。步骤(c):匀浆液的分离然后通过常规手段将勻浆液分级以将未破裂细胞细胞和大聚集物与从细胞释放 的内容物分离。优选通过在13000xg下离心进行分级。在离心后获得的上清液是澄清细胞 提取物，其包含可溶物质以及由细胞膜系统的破碎产生的不同尺寸的不同微泡群。步骤(d)尺寸分配纯化然后将由步骤(C)获得的澄清细胞提取物基于形成所述提取物的微泡的尺寸来分级，以便选择具有特定直径尺寸的那些。本发明的作者已经发现尺寸分配纯化技术可以 用于提供足够纯度的微泡制剂，其可以施用于治疗中而不需要附加的纯化步骤，例如色谱 法和以前认为需要的其它方法。在不意欲受本发明的任何特定理论约束的情况下，应该相 信澄清细胞提取物通过尺寸分配分级的处理步骤产生污染减少的产物。此外，污染物具有 的尺寸和性质使它们可以容易地通过简单尺寸分配纯化步骤从微泡中分离出。膜过滤是生物处理领域中公知的技术。膜被定义为横向尺度比它的厚度大得多的 结构，物质可以在多种驱动力下通过所述膜发生转移。虽然许多过滤器可以被认为是膜，但 是过滤器还包括这样的材料其横向尺度通常不比它们的深度大100倍并且其分离性能主 要通过俘获穿过其深度的物种或颗粒。用于表征膜特性的最常用参数分为三大类。这些是 输运性质，孔(几何)特征和表面(或者主要是化学上的)性质。然而，输运性质主要取决 于孔特征和表面特征。虽然与其它分离方法相比，膜分离是较慢并且较小容积的方法，但是 其效能是使它成为能够用于回收少量有价值产物的方法。膜过滤器系统可以以多种方式设计，以具有不同的过滤性质。设计标准包括盲端 (dead-end)操作(搅拌或不搅拌)或错流模式；流入混合物的全部或部分回收；经由泵送 的外部跨膜压的应用、惰性气体层或装置的渗透侧的排空；以及平板(单片或多片)、中空 纤维束或管状膜的使用。尺寸分配分离方法利用尺寸分配膜，其可以是本领域普通技术人 员已知的透析膜或其它类似膜。用于本发明的尺寸分配膜过滤的适当透析膜材料包括可商 购的那些材料，例如由聚醚砜、聚碳酸酯、尼龙、聚丙烯等制备的那些材料。作为示例，这些 透析膜材料的供应商包括 Akzo-Nobel、Millipore，Inc.、Poretics，Inc.和 Pall Corp.。在优选实施方案中，基于膜尺寸的分级是切向流过滤(TFF)，也被称为“错流过 滤”。切向流过滤是压力驱动的分离方法，其中将流体沿膜表面切向泵入。所施加的压力用 来迫使包含杂质的部分流体穿过膜至滤液尺寸。过大而不能穿过膜孔的微粒和大分子被阻 留在上游侧。与其中阻留的组分堵塞膜表面的常规流过滤(NFF)技术相比，切向流过滤通 过流体的流动清除了阻留的组分。TFF基于被分离组分的尺寸来分类。膜孔径规格通常给定为微米值，表明大于该规 格的颗粒会被膜阻留。另一方面标称分子量限度(NMWL)指示分子量高于NMWL的大部分溶 解的大分子和分子量低于NMWL的某些分子会被膜阻留。组分形状、变形能力和它与溶液中 的其它组分的相互作用都影响阻留。不同膜制造商使用不同标准来指定膜家族的NMWL规 格，但是普通技术人员能够根据经验确定适当的规格。超滤是最广泛使用的TFF形式之一，并用于将蛋白与用于缓冲液交换、脱盐或浓 缩的缓冲液组分分离，但是其还可以用于过滤本发明的澄清细胞提取物。微泡过滤的通常 孔径在0.2微米至0.1微米的范围内。在优选实施方案中，TFF包含孔径为0.2微米的第 一膜和孔径为0. 1微米的第二膜，使得膜之间的空间聚积直径为0. 2微米至0. 1微米的微 泡。在TFF单元操作中，使用泵来产生通过两层膜表面间通道的原料流的流动。在流 体每次穿过膜表面时，所施加的压力迫使部分流体通过膜并进入滤液流中。结果是原料浓 度从通道中心的散放条件至更集中的壁条件形成梯度。当更多流体进行性地经过滤液侧时 沿着进料道的长度从入口至出口(保留物)也存在浓度梯度。沿着膜长度的进料流引起从 通道的进料端至保留物端的压力下降。膜的滤液侧流通常较低并且几乎不受限制，因此沿着膜长度对滤液侧的压力近似恒定。膜可以由在冲洗特性和化学相容性上提供选择的各种材料制备。适合材料包括纤 维素、聚醚砜和本领域技术人员已知的其它材料。在某些实施方案中使用聚醚砜。典型的 聚醚砜膜易于吸收蛋白以及其它生物组分，导致膜污垢和通量降低。有些膜经亲水性修饰 以更不易产生污垢，例如Biomax (Millipore)。本领域技术人员应当理解各种类型的TFF组件会用于本发明的实践中。有用的 TFF组件包括但不限于平板组件(也被称为片匣(cassettes))、螺旋卷组件和中空纤维组 件。对于任何给定组件，普通技术人员可以容易地使关键处理参数最佳化。这样的参 数包括错流速率、跨膜压(TMP)、滤液控制、膜面积和渗滤设计。错流速率取决于选择哪一种 组件。通常在等TMP时更高的错流速率提供更高的通量，并增加穿过膜的清除作用以及降 低向着膜表面的浓度梯度。许多TFF应用中应用了错流和压力设定点，以及不受组件控制 和限制的滤液流。这是最简单的操作类型，但在某些情况下，期望使用某类滤液控制，其超 出了通过用保留物阀简单调节压力实现的控制。在确定待处理的工艺流和总体积后选择膜 面积，并且膜面积取决于处理时间。通常可以通过在2000g至4500g，例如2500g至4000g或2750g至3500g或3000g 至3500g，例如3000g或3100g或3200g或3300g或3400g或3500g下离心来进行浓缩。通常离心可以运行若干小时，例如1小时以上，例如运行1小时至10小时。为了使对感兴趣多肽的稳定性的任何负面影响最小化，具体地可以在2-200C的 温度范围内进行离心，例如3摄氏度至15摄氏度或3°C至10°C或3摄氏度至6摄氏度。用于TFF的优选缓冲液是磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液或TRIS缓冲液。然而，某 些实施方案中的缓冲液的浓度为5mM至15mM，包括至少5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、IOmMUlmM, 12mM、13mM、14mM和15mM的浓度，还包括它们之间的mM浓度。在某些实施方案中，缓冲液的 PH为约7. 2至7. 5。因此，在一个实施方案中，缓冲液的pH为7. 2,7. 3,7. 4或7. 5或者它 们之间的部分PH值。在另一实施方案中，缓冲液交换缓冲液还包括0. IOM至0. 20M的NaCl 和3. 5%至4. 5%的蔗糖。在优选实施方案中，还将在尺寸分级步骤后获得的微泡制剂进行二次纯化步骤， 该步骤使具有最高蛋白量/活性的微泡与存在于样品中的任何其它产物分离。在一个实施方案中，所述二次纯化步骤通过二次尺寸分级步骤来实施。在另一实 施方案中，二次纯化步骤能够通过亲和色谱法来实施。如果微泡包含TF，则使用对TF显示 亲和力的化合物(例如抗体)来实施亲和色谱法。如果微泡包含含有TF和标签的融合蛋 白，则能够通过使用对所述标签显示亲和力的配体来实施亲和色谱法。优选地，标签是六聚 组氨酸标签，在该情况下使用金属亲和柱来实施亲和色谱法。一旦微泡制剂已被纯化，则检测分级步骤的洗脱物中感兴趣蛋白的存在，然后将 包含最高蛋白量或最高活性的那些组分混合并直接使用。能够使用本领域已知的检测给定 蛋白存在的任何可利用的手段(ELISA、Western印迹、RIA等等)来测试柱洗脱谱的蛋白的 存在，或者测试感兴趣蛋白活性的存在。技术人员应该理解活性测试取决于被纯化的蛋白。 在优选实施方案中，感兴趣蛋白是TF，并且活性是如实施例5说明的促凝活性，所述活性能 够被检测以鉴别包含含有所述蛋白的泡囊的那些组分。
本发明的携带TF的酵母来源的微泡的治疗用途
不同测定法已经显示出本发明的携带TF的酵母来源的微泡显示促凝活性。实际 上实施例4包括a)体外测定，其表明了本发明的携带TF的酵母来源的微泡在健康状态下和患者 疾病状态下引起纤维蛋白凝块形成和血液凝固；即所述测定显示本发明所述的携带TF的 酵母来源的微泡能够凝固_来自健康个体的血浆(血浆中的凝固分析)；-缺乏FVIII、FIX或FXI的血浆(血浆中的凝固分析)；-来自获得性血小板缺乏的血浆(血小板减少血浆中的凝固分析)；-在抗FVII抗体存在下来自FXI缺乏血浆的血浆(血浆中的凝固分析)；_来自健康个体的血液(非抗凝全血中的凝固分析)；以及-来自血友病患者的血液(非抗凝全血中的凝固分析)；b)体内测定，其表明了本发明的携带TF的酵母来源的微泡是在严重出血模型中 用于局部抗出血治疗的药剂(通过直接应用于先前切开的血管)；即所述测定显示所述携 带TF的酵母来源的微泡在未处理和用肝素处理的试验动物中用作局部止血剂。c)体内测定，其表明了本发明的携带TF的酵母来源的微泡是在致命性出血模型 中用于局部抗出血治疗的药剂(通过直接应用于先前切开的血管)；即所述测定显示所述 携带TF的酵母来源的微泡在由近端切断FVIII缺乏小鼠尾部造成的致命性出血动物模型 中用作局部止血剂。这些结果清楚地显示出本发明的携带TF的酵母来源的微泡是用于局部治疗个体 出血的促凝剂或抗出血剂。因此，本发明的携带TF的酵母来源的微泡能够用作药物，即用作促凝剂或用作抗 出血剂，具体地用作治疗个体出血的局部应用的抗出血剂。因此，另一方面，本发明涉及作为药物的本发明的携带TF的酵母来源的微泡。在 具体实施方案中，本发明涉及作为适于治疗个体出血的具有促凝(抗出血)活性的局部药 物的本发明的携带TF的酵母来源的微泡。虽然本发明的携带TF的酵母来源的微泡能够被局部应用于治疗个体出血，即不 将其与药物可接受的介质混合，因为包含根据本发明方法获得的所述携带TF的酵母来源 的微泡的澄清酵母提取物(CYE)的组分基本上对个体无害，通常对于向个体给药无害，因 此本发明的携带TF的酵母来源的微泡被配制成适于其给药的药物给药形式，优选适于用 于局部(局域性)治疗出血的局部给药的药物给药形式。因此，另一方面，本发明涉及药物组合物，下文称为本发明的药物组合物，其包含 本发明的携带TF的酵母来源的微泡和药物可接受的介质、载体或赋形剂。然后将所述药物 组合物配制成适于向个体给药的药物给药形式。然后对于向个体给药，本发明的携带TF的酵母来源的微泡会被配制成药物给药 形式，优选适于局部给药的药物给药形式，为此将适于制备期望药物给药形式的药物可接 受的载体和赋形剂并入其中。关于所述载体和赋形剂以及关于适于本发明所述产品给药 的所述给药形式的信息能够在galenic pharmacy treatises (格林药学论述)中查到。一 般药物的不同药物给药形式及其制备方法的综述能够在C. Fauli iTrillo，1st Edition,1993, Luzan 5, S. A. of Ediciones 的题为"Tratado deFarmacia Galenica" ( "Galenic Pharmacy Treatise (格林药学论述)”)的书中查到。虽然能够使用本发明的携带TF的酵母来源的微泡的不同药物给药形式，但是在 实践中局部给予所述产品最有利；因此所述本发明的携带TF的酵母来源的微泡被配制成 适于局部给药的药物形式。所述药物形式的示例性而非限制性实例包括气雾剂、溶液、悬浮 剂、乳剂、凝胶剂、软膏、乳膏、敷料、贴片、油膏、漱口液等等。为此本发明的药物组合物包含 制备局部给药的本发明的携带TF的酵母来源的微泡的药物给药形式所需的药物可接受的 介质、载体和/或赋形剂。因此，在具体实施方案中，本发明的药物组合物是用于本发明的携带TF的酵母来 源的微泡的局部给药的药物组合物，其包含所述产品和适于所述本发明的携带TF的酵母 来源的微泡的局部给药的药物可接受的介质、载体或赋形剂。适于所述携带TF的酵母来 源的微泡的局部给药的药物可接受的介质、载体或赋形剂的示例性非限制性实例能够在 galenic pharmacy treatises (格林药学论述)中查到。在具体实施方案中，本发明的药物组合物包含含有具有促凝活性的人TF蛋白或 其片段的携带TF的酵母来源的微泡，例如成熟人TF或截短的人TF(即人TF蛋白，其中负 责与FVIIa结合的全部或部分结构域缺失，或者具有促凝活性的人TF蛋白突变体，其中负 责与FVIIa结合的结构域不是功能性的)。本发明的携带TF的酵母来源的微泡以治疗有效量存在于本发明的药物组合物 中。所述量可以在宽范围内变化，例如约1. Opg活性蛋白/ml至1. Omg活性蛋白/ml，优选 0.05 yg活性蛋白/ml至10 μ g活性蛋白/ml，以及甚至更优选约0. 1 μ g活性蛋白/ml至 2. Oyg活性蛋白/ml。本发明的携带TF的酵母来源的微泡向个体给药的剂量可以在非常宽的范围内变 化，例如约1. Opg活性蛋白/ml至1. Omg活性蛋白/ml，优选0. 05 μ g活性蛋白/ml至10 μ g 活性蛋白/ml，以及甚至更优选约0. 1 μ g活性蛋白/ml至2. 0 μ g活性蛋白/ml。本发明的 携带TF的酵母来源的微泡的给药剂量取决于多种因素，包括所使用的具有促凝活性的TF 蛋白或其片段的特征等等，例如其活性和生物半衰期、具有促凝活性的TF蛋白或其片段在 制剂中的浓度、个体或患者的临床疾病状态、待治疗的出血病症等等。因此本文提到的剂量 必须仅被认为是对本领域技术人员的指导，并且技术人员必须根据前述变量调节剂量。然 而，本发明的药物组合物用于预防或治疗目的能够一天给药一次或多次。本发明的药物组合物能够与用于预防和/或治疗出血素质的其它附加药物(例如 凝血因子、人血浆等等)一起使用以提供联合治疗。对于本发明的药物组合物的给药，所述 附加药物能够是同一药物组合物的一部分，或者它们能够以用于其同时或连续(时间上连 续)给药的独立组合物被提供。本发明的药物组合物还能够被置于支持体上。因此，另一方面，本发明涉及包含本 发明的药物组合物和支持体的产品。如本文所使用的术语“支持体”是指适当材料的基质， 其允许在其上沉积本发明的药物组合物，允许药物组合物被携带并在期望位点释放，例如 在本发明的药物组合物发挥其治疗效果的位点。所述支持体能够是固体支持体或非固体支 持体，例如液体支持体或气体支持体。固体支持体的示例性非限制性实例包括敷料、急救绷 带、敷布、硬膏等等。液体支持体的示例性非限制性实例包括凝胶、喷雾剂、漱口液等等。气体支持体的示例性非限制性实例包括空气、推进剂等等。在具体实施方案中，本发明的药物组合物包含含有具有促凝活性的人TF蛋白或 其片段的携带TF的酵母来源的微泡，例如成熟人TF或截短的人TF(即人TF蛋白，其中负 责与FVIIa结合的全部或部分结构域缺失，或者具有促凝活性的人TF蛋白突变体，其中负 责与FVIIa结合的结构域不是功能性的)。包含沉积在支持体上的本发明的药物组合物的产品能够由常规方法获得，例如通 过将本发明的药物组合物与支持体混合。本发明的药物组合物与支持体间的相互作用能 够是物理作用或化学相互作用，取决于本发明的药物组合物的组分的性质和所使用的支持 体。本发明其它方面涉及本发明的携带TF的酵母来源的微泡在制备用于治疗个体出 血的药物中的用途，具体地用于局部治疗健康个体或具有出血素质个体的出血。如本文所使用的，术语“局部治疗”是指直接在需要治疗的位点治疗的应用，例如 在由开放伤口、手术等导致的静脉出血和动脉出血中的皮肤不连续部分(切口等)和血管 组织的不连续部分(破裂的血管等)以及在皮肤粘膜出血和微血管出血中的皮肤和血管组 织的不连续部分。根据本发明并如实施例4所示，本发明的携带TF的酵母来源的微泡能够用作促凝 剂或抗出血剂，因此所述产品能够用于治疗或改善出血病症，特别是那些与出血素质有关 的出血病症。术语“出血素质”是指引起止血障碍的过程，并由此导致出血综合征的发生，该出 血综合征有时可能发生长期的大量出血。出血素质可能由先天性或后天性凝血病和/或先 天性或后天性血小板病症引起。术语“凝血病”是指凝血因子异常。这种异常可能是因为特定的凝血因子缺乏或不 足引起的，该凝血因子缺乏或不足的结果是发生出血综合征，或是因为凝血因子异常所致。 凝血病通常可以是先天性凝血病或后天性凝血病。先天性凝血病的示例性非限制性实例选自能够提及的以下凝血因子的缺乏凝血 因子V (FV)、凝血因子VII (FVII)、凝血因子VI11 (FVIII)，其不足或缺乏导致血友病A，凝血 因子IX(FIX)，其不足或缺乏导致血友病B，凝血因子X (FX)、凝血因子XI (FXI)，其不足或缺 乏导致血友病C，凝血因子XII (FXII)，凝血因子XIII (FXIII)和它们的组合。后天性凝血病可能有不同的起因。示例性实例包括在严重的肝衰竭中凝血因子合 成不足及抗凝血剂治疗(诸如肝素、低分子量肝素、华法林、香豆素衍生物、双香豆素等)。 另一可选择的机制是基于过度消耗凝血因子，使得在出血损伤中无可利用的凝血因子来形 成凝块。这种机制发生在因多种疾病消耗所致的弥散性血管内凝血综合征或凝血病中，所 述多种疾病诸如损害微循环内皮、活化血小板及凝血因子、形成多重微血栓的严重脓毒病； TF入侵血液中，如胎盘释放；死胎滞留；具有组织碎裂的多处创伤；毒蛇咬伤等等。在血管 炎中，血管壁及内皮损伤释放出凝血活化剂。由于为抗血小板剂及抗凝血剂的胞浆素的作 用及PDF释放，凝血因子的消耗因许多微血栓的纤维蛋白的溶解而加剧。术语“血小板异常”是指血小板的数量及功能上的异常，其结果是发生出血综合 征。所述血小板异常可能是先天性或后天性。在具体实施方案中，所述血小板异常是先天性血小板异常。先天性血小板异常的示例性、非限制性的实例包括格兰茨曼病(Glanzmarm' sdisease)、贝-苏综合征 (Bernard Soulier disease)、Bolin_Jamieson，s 综合征、维—奥综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)、Paris-Trousseau-Jacobsen综合征、X染色体血小板减少症、灰色血小板综合 征(Gray plateletsyndrome)、Sebastian 综合征及范禾斗尼贫血(Fanconi anemia)。在另一具体实施方案中，所述血小板异常是后天性血小板异常。后天性血小板异 常的示例性非限制性实例包括骨髓增生性疾病，诸如血小板增多、红细胞增多或慢性粒细 胞白血病等；髓样化生(myeloidmetaplasia)中的功能性血小板异常，伴随出血时间延长、 玻璃珠滞留缺陷(retention defects)、血小板聚集缺陷、异常释放及血小板因子III缺 陷。已在坏血病、先天性心脏疾病和肝硬化中的异常蛋白血症中发现了功能性血小板缺陷。术语“后天性凝血病”及“后天性血小板异常”指疾病的起因，其可能为医源性或 继发于其它疾病。本文所使用的术语“个体”包括动物种类的任何成员，包括人类；以示例性非限制 性方式举例来说，所属个体能够是哺乳动物，诸如灵长类、家畜、啮齿类等，所述个体优选为 以任何年龄和种族的男人或女人。在具体实施方案中，所述个体是无止血障碍史的人，诸如 无凝血病或血小板异常的个体。在另一具体实施方案中，所述个体是有止血障碍史的人，诸 如具有出血素质的个体，例如凝血病，如先天性或后天性凝血病，或血小板异常，诸如先天 性或后天性血小板异常。因此在具体实施方案中，本发明涉及本发明的携带TF的酵母来源的微泡在制备 用于局部治疗无止血障碍史的人类出血的药物中的用途。在另一具体实施方案中，本发明 涉及本发明的携带TF的酵母来源的微泡在制备用于局部治疗具有出血素质的人类出血的 药物中的用途。如上所述，为了对个体局部给药，本发明的携带TF的酵母来源的微泡将被配制成 适于其局部给药以局部(局域性)治疗个体出血的药物形式。所述药物形式的示例性非限 制性实例包括气雾剂、溶液、悬浮液、乳剂、凝胶、软膏、乳膏、敷料、贴片、油膏、漱□液等。为 此，含有本发明的携带TF的酵母来源的微泡的药物制剂将包括为制备所选定的药物给药 形式所需的药物可接受的介质、载体及赋形剂。已经提到了关于与本发明的药物组合物相 关的药物组合物(药物给药形式、剂量、活性组分的量等)的信息。还已经报导了 TF诱导血管生成并增加VEGF的生成(Ollivier et al.，2000， Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. ,20 1374-1381 ；Chen et al.,2000,Thromb. Haemost., 86:334-345 y Watanabe et al.，1999，Thromb. Res.，96 183-189)。因此，另一方面，本发 明涉及用于治疗其中需要增加血管生成或增加细胞迁移的疾病的本发明的酵母来源的微 泡。与血管生成减少有关的并能够得益于本发明的促进血管生成组合物治疗的疾病 包括冠心病，如心肌缺血、心肌梗死、缺血性心肌病，或外周动脉疾病，如慢性肢体缺血性跛 行(chronic limb ischemiaclaudication)(骨骼肌)或静止痛/缺血溃疡/坏疽。在缺 血性脑卒中/神经病中也需要促进血管生成，例如脑/神经组织，如在脑卒中/梗死周围 的缺血半暗带(ischemic pneumbra) 0可选择地，本发明的组合物的促血管效应可以用于 促进血管内腔表面的愈合和/或内皮化，例如在例如冠状动脉/颈动脉中或在去内皮化内 腔表面上促进不稳定/溃疡性动脉粥样硬化斑块的内皮化，所述去内皮化内腔表面例如在诸如颈动脉的动脉内膜切除术，血栓切除术(或者动脉/静脉)，诸如充气囊、激光或低 温血管成形术的血管成形术，动脉粥样硬化斑块切除术，或者在通过给予包含一氧化氮剂 的组合物进行血栓溶解之后发现的那些去内皮化内腔表面。本发明的促血管生成组合物 还可以用于解决急性或慢性动脉和/或静脉血栓形成，例如血运重建和/或新血管形成 和/或再通。在另一实施方案中，本发明的组合物促进新毛细血管床(neocapillary bed) 的发生，所述新毛细血管床用于基因治疗应用、器官再生应用，和用于生物人工杂化器官 (bioartificial hybrid organ)(例如胰、肾、肺、肝)放置以及促进和/或增强伤口愈合 和/或用于促进肉芽组织，例如用于慢性伤口，如基于缺血性、糖尿病性、神经性、静脉停滞 性(venous statis)伤口。已经报导了 TF 促进细胞迁移(Ott et al.，2005，Circulation, 111 :349_355 和 W00105353)。因此，另一方面，本发明涉及用于在有需要的患者中促进细胞迁移的包含本发 明的TF的组合物。应该理解，取决于刺激迁移的细胞类型，本发明的组合物能够治疗不同 的疾病。例如，诸如血管、动脉、冠状动脉、静脉、食管腔和尿道的身体内腔损伤的患者需要 内皮细胞迁移的刺激；由缺血和出血性脑卒中引起的中枢神经系统损伤和创伤患者需要刺 激神经细胞迁移到损伤位点；慢性顽固性溃疡患者，例如糖尿病患者和老年患者，例如下肢 溃疡和褥疮、角膜伤口、烧伤、擦伤、手术切口、供体移植位点和由传染剂引起的损伤)。能够 被治疗的其它医学疾病状态是慢性疾病状态(例如慢性静脉性溃疡、糖尿病溃疡、压迫性 溃疡、压疮(pressure sore)和粘膜表面的溃疡或伤口)、由持续性炎性疾病状态或感染或 由基因缺陷(例如瘢痕疙瘩形成和凝血异常)引起的皮肤和上皮表面损伤将得益于重建受 损组织所需的上皮细胞迁移的刺激。伺含TF_删原白備包_劲勿本发明其它方面涉及组合物，下文称为“本发明的组合物”，其包含本发明的携带 TF的酵母来源的微泡和介质。实际上，不对本发明的携带TF的酵母来源的微泡产生不利影响的任何介质均能 够用于所述本发明的组合物。在实施方案中，所述介质基本上是液体介质，例如包裹通过实施本发明方法获得 的本发明的携带TF的酵母来源的微泡的介质。因此，在具体实施方案中，本发明的组合物 包含在实施本发明方法中获得的澄清酵母提取物。缺失全部或部分负责与FVIIa结合的结构域的截短TF如上所述，发明人已经令人惊讶地发现不能与FVIIa结合的截短TF蛋白具有促凝 活性。如能够在实施例4中所观察到的，发明人已经表明所述截短型TF蛋白在血浆的凝血 测定中具有促凝活性。因此，另一方面，本发明涉及缺失全部或部分负责与FVIIa结合的结构域的截短 TF，下文称为“本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF”，其中全部或部分负责与FVIIa结 合的结构域缺失，因此其不能与FVIIa结合，但是具有促凝活性。由此扩展，所述“本发明的 缺失FVIIa结合结构域的截短TF”包括具有促凝活性的TF蛋白突变体，其中负责与FVIIa 结合的结构域由于突变不是功能性的。本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF可以通过常规手段来获得，例如通过将 编码所述蛋白的核苷酸序列在适当表达系统(酵母、细菌、真核细胞、昆虫细胞等等)中进行基因表达。为了测定本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF是否能够与FVIIa结合，可以 使用如国际申请W000/04148中描述的结合测定法。此外，本发明的缺失FVIIa结合结构域 的截短TF的促凝活性能够如前所述测定，例如通过实施例4中提到的任何凝固分析，例如 通过血浆中的体外凝固分析、或通过非抗凝全血中的体外凝固分析、或通过严重出血动物 模型中的体内测定或通过致命性出血动物模型中的体内测定，例如在实施例4中提到的那 些测定法。在具体实施方案中，本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF包含与因子X相互 作用的结构域、跨膜区和胞质尾区，并缺失部分或全部负责与FVIIa结合的结构域。此外， 在具体实施方案中，所述本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF是截短型人TF蛋白，所 述截短型人TF蛋白包含与因子X相互作用的结构域(aa 174-251)、跨膜区(aa 252-274) 和胞质尾区(aa 275-295)，以及额外组氨酸标签(实施例3)。发明人现在已经令人吃惊地 发现，缺失负责与FVIIa结合的结构域的所述截短型TF蛋白具有促凝活性(实施例4，表 3)在另一具体实施方案中，TF在FVIIa结合结构域中被一个或多个点突变修饰，使 得所述结构域不再能够结合FVIIa。TF的FVIIa结合结构域中的点突变是本领域公知的，所 述点突变可以破坏与所述FVIIa的结合(例如在Kelley，R. F. et al. , 1995,Biochemistry, 34:10383-10392中描述的那样，其内容因此通过引用的方式整体并入本文)。已经令人吃惊地观察到缺失全部或部分负责与FVIIa结合的结构域的所述TF 片段具有促凝活性，因为公知在血液凝固的外源途径中，TF结合循环FVII/FVIIa以形成 TF: FVIIa复合物，以及当钙离子存在时作为基质以使FX活化发生。公认如果发生由血管 损伤导致的出血，则由于涉及TF与其配体FVII/FVIIa相互作用的外源途径激活，将启动凝 血。本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF可以被糖基化或不被糖基化。因此，在 具体实施方案中，本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF不被糖基化，而在另一具体实 施方案中，本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF被糖基化。如上所述，术语“糖基化” 包括任何程度的糖基化。携带一个或多个非公能性糖基化为点的TF变体。如上所述，本发明的作者也已经观察到当所述TF在糖基化位点中携带突变时，TF 的促凝活性以及它在酵母宿主细胞中的表达增加，所述突变防止在野生型TF中发现的三 个N-连接糖基链中的至少一个的连接。因此，在具体实施方案中，本发明的携带TF的酵母 来源的微泡包含具有促凝活性的TF蛋白的非糖基化片段。如上所述，术语“糖基化”包括任 何程度的糖基化。在优选实施方案中，TF变异体是多肽，其中TF的至少一个N-糖基化位点 已经被修饰以对使其呈现非功能性，即不能用作添加糖苷链的受体位点。能够被修饰的TF 序列中的N-糖基化位点是前述的那些位点，即Asn11-Leu12-Thr13位点、Asn124-Val125-Thr126 位点和/或Asn137-Asn138-Thr139位点。N-糖基化共有区的任何修饰均适合，只要N-连接 糖基链的添加被除去或被基本抑制。优选地，将修饰引入与成熟人TF中的11、124和/或 136位对应的Asn残基，因为这是用作连接糖基链的受体的残基。如本发明所使用的“与成 熟人TF中的位点11、124和/或136对应的位点”涉及在其它TF直向同源物中的N-糖基化位点，当将人和直向同源序列基于序列相似性进行比对时，所述位点可以出现在多肽链 的不同位置但与成熟人TF中的N-糖基化位点匹配。比对或倍增TF序列并因此用于识别 与人成熟TF中的位点对应的TF直向同源物中的N-糖基化位点的适当算法是PILEUP程 序，其组成 GCG 软件包的一部分(GeneticsComputer Group，Program Manual for the GCG Package (GCG包的程序手册)，Version 7，Madison, Wis. )。PILEUP使用逐级、成对序列比 对算法从一组相关序列创建多序列比对以显示相互关系和序列同源性百分数。它还标绘了 显示用于创建比对的聚类关系的树图或树状图。PILEUP使用Feng和Doolittle，J. Mol. Evo 1. ,35 351-360(1987)中逐级比对方法的简化。优选地，11、124和/或136位的Asn残基 被Ala取代。因此在优选实施方案中，形成部分微泡的TF变异体选自人成熟TF中的m 1A、 N124A、N137A、NllA 和 N124A、NllA 和 N137A、N124A 和 N137A 和 Nl ΙΑ、N124A 和 N137A。在 任何其它TF直向同源物中，在形成N-连接糖基化共有位点的相应Asn残基处发生突变。缺失FVIIa结合结构域的截短TF、携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF和 携带本发明的一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体可以是融合蛋白的一部分， 所述融合蛋白包含第一区域，所述第一区域包含所述缺失FVIIa结合结构域的截短TF，所 述携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF，以及所述携带本发明的一个或多个非功能 性N-糖基化位点的TF突变体，其与包含另一肽或蛋白的第二区域结合。所述第二区域可 以与所述缺失FVIIa结合结构域的截短TF的氨基末端区域结合，所述突变体TF携带非功 能性FVIIa结合结构域，以及所述TF突变体携带一个或多个本发明的非功能性N-糖基化 位点，或者可选择地，所述第二区域可以与所述缺失FVIIa结合结构域的截短TF、所述携带 非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF以及所述携带一个或多个本发明的非功能性N-糖 基化位点的TF突变体的羰基末端区域结合。第一区域和第二区域可以直接结合或通过第 一区域与第二区域间的连接多肽结合。在具体实施方案中，所述融合蛋白包含缺失FVIIa结合结构域的截短TF、携带非 功能性FVIIa结合结构域的突变体TF或携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突 变体，以及与本发明的缺失FVIIa结合结构域的所述截短TF的C-末端或N-末端结构域结 合的标签，通常为肽标签。所述标签通常是能够用于分离或纯化所述融合蛋白的肽或氨基 酸序列。所述标签的示例性、非限制性实例已经在上文中提到。在具体实施方案中，所述标 签是与所述TF蛋白的C-末端结构域结合的His-标签。在另一实施方案中，所述标签是与 所述TF蛋白的N-末端结构域结合的His-标签。所述融合蛋白可以通过常规手段来获得，例如通过将编码所述融合蛋白的核苷酸 序列在适当酵母细胞中进行基因表达。如果需要，能够使用终标签(eventual tag)来分离 或纯化所述融合蛋白。缺失FVIIa结合结构域的截短TF、携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF和 携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体能够用作药物，例如用作治疗个体出 血的促凝剂。因此，另一方面，本发明涉及作为药物的缺失FVIIa结合结构域的所述截短TF、携 带非功能性FVIIa结合结构域的所述TF突变体和携带一个或多个非功能性N-糖基化位点 的所述TF突变体。在具体实施方案中，本发明涉及作为适于治疗个体出血的具有促凝活性 药物的缺失FVIIa结合结构域的所述截短TF、携带非功能性FVIIa结合结构域的所述TF突变体和携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的所述TF突变体。此外，另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含缺失FVIIa结合结构域的截短 TF、携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF或携带一个或多个非功能性N-糖基化位 点的TF突变体和药物可接受的介质。在具体实施方案中，所述药物组合物是用于局部给予 缺失FVIIa结合结构域的截短TF、携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF或携带一 个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体以及药物可接受的载体的药物组合物，所述 载体适于局部给予本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF或携带一个或多个非功能性 N-糖基化位点的TF突变体。另一方面，本发明涉及缺失FVIIa结合结构域的截短TF、携带非功能性FVIIa结 合结构域的突变体TF或携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体，其用于治疗 需要促进个体细胞迁移和/或血管生成的疾病。另一方面，本发明涉及缺失FVIIa结合结 构域的截短TF、携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF或携带一个或多个非功能性 N-糖基化位点的TF突变体，其用于促进有需要的个体的血管生成或细胞迁移。通常，为了对个体给药，缺失FVIIa结合结构域的截短TF、携带非功能性FVIIa结 合结构域的突变体TF或携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体会被配制成 适于用于局部(局域性)治疗出血的局部给药的药物形式。所述药物形式的示例性非限制 性实例包括气雾剂、溶液、悬浮剂、乳剂、凝胶、药膏、乳膏、敷料、贴片、软膏、漱□液等等。为 此，包含本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF的药物组合物包含制备所选药物给药形 式所需的药物可接受的载体和赋形剂。因此，在具体实施方案中，除了本发明的截短TF蛋 白以外，本发明的药物组合物还包含能够在galenic pharmacy treatises (格林药物论述) 中查到的药物可接受的介质。本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF、本发明的携带非功能性FVIIa结合结 构域的突变体TF以及本发明的携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体以治 疗有效量存在于该药物组合物中。所述量可以在宽范围内变化，例如约1. Opg活性蛋白/ml 至1. Omg活性蛋白/ml，优选0. 05 μ g活性蛋白/ml至IOyg活性蛋白/ml，以及甚至更优 选地，约0. 1 μ g活性蛋白/ml至2. 0 μ g活性蛋白/ml。另一方面，本发明涉及编码所述缺失FVIIa结合结构域的截短TF、所述携带非功 能性FVIIa结合结构域的突变体TF或所述携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF 突变体的多核苷酸序列(下文称为“本发明的多核苷酸”)。另一方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸序列的载体(下文称为“本发明的 载体”)。用于本发明的适当载体包括例如PUC18、pUC19，Bluescript及其衍生物mpl8、 mpl9、pBR322、pMB9、CoIEl、pCRl、RP4、诸如pSA3和pAT28的噬菌体和穿梭载体的原核表达 载体，例如2微米质粒(2 micro plasmids)、整合型质粒、YEP载体、着丝粒质粒等的酵母表 达载体，例如 pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE 载体等的植 物表达载体，例如PAC和pVL载体的昆虫细胞表达载体，基于病毒载体(腺病毒、腺相关病 毒、反转录病毒和慢病毒)以及例如 pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3. 1、pEFl/His、pIND/GS、pRc/ HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5_His、ρ VAX U pZeoSV2、pCI、pSVL 和 pKSV-10、 pBPV-1、pML2d和pTDTl的非病毒载体的真核表达载体。另一方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸或本发明的载体的宿主细胞(下文称为“本发明的宿主细胞”)。能够用于本发明目的的细胞优选真核细胞，更优选脊椎动物 细胞或无脊椎动物细胞、昆虫细胞或真菌细胞，甚至更优选地，脊椎动物细胞是爪蟾卵母细 胞(Xenopuscell)，从斑马鱼或哺乳动物细胞分离出的细胞。优选地，哺乳动物细胞是来自 诸如CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK 293、3T3、WI38等建立的细胞系、胚胎干细胞、成体干 细胞或体细胞的细胞。另一方面，本发明涉及与本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF、携带非功能 性FVIIa结合结构域的突变体TF或携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体 特异性结合的抗体。用于本发明的适当抗体包括包含抗原结合可变区以及轻链恒定结构域 (CL)和重链恒定结构域CHI、CH2和CH3的“完整”抗体，其包含抗原结合可变区以及轻链 恒定结构域(CL)和重链恒定区、CHU CH2和CH3，由完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生的包 含单一抗原结合位点和CL和CHl区域的“Fab”片段，由完整抗体的木瓜蛋白酶胃蛋白酶消 化产生的包含两个抗原结合位点的“F (ab’)2”片段，包含轻链恒定区和重链第一恒定结构 域(CHl)并仅具有一个抗原结合位点的“Fab’”片段。Fab’片段通过在包含一个或多个来 自抗体铰链区域的半胱氨酸的重链CHl结构域的羰基末端处添加几个残基而不同于Fab片 段，"Fv"是包含完全整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段；单链FV或“scFv”抗体 片段包含抗体的VL结构域和VH结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中；“双链抗体 (diabody)”包含与同一多肽链(VH-VL)上的轻链可变区(VL)连接的重链可变区(VH)，所 述多肽链由过短而不能使同一链的两个结构域间配对的肽连接子连接，以及“双特异性抗 体”(BAb)是具有两个不同特异性抗原结合位点的单个二价抗体(或其免疫治疗有效的片 段)。以下实施例示例性说明本发明，不应该被理解为是对本发明的限制。 实施例实施例1-3公开了酵母中基于以下表达的促凝产物的制备(i)任选地以与 His-标签融合的融合蛋白形式的成熟人TF蛋白(实施例3)，(ii)与His-标签融合的截短 型人TF蛋白(实施例4)，以及(iii)人TF蛋白的N-糖基化突变体(实施例5)。为简单起 见，在实施例6中将所述所有促凝产物一般地命名为微泡化组织因子(microvesiculated tissuefactor)、微泡化TF或mTF。实施例2教导了微泡化TF的纯化。实施例6公开了为了评估所述mTF以不同浓度在健康个体和血友病个体中产生纤 维蛋白凝块的能力而进行的一些体外测定，以及为了评估所述mTF治疗严重和致命性出血 模型出血的能力而进行的一些体内测定。实施例1基于全长TF蛋白在酵母(CYE-TF)中表达的促凝产物的制备1. 1.酵母表达载体根据图1所示的克隆策略，对于重组TF表达，酵母游离载体(pTT-10301)由质粒 pGl (ATCC # 37305)和 Y印352 (ATCC # 37673)产生。质粒 pTT-10301 包含以下元件i)URA3基因，允许在缺乏尿嘧啶的生长培养基中筛选重组酵母，ii)氨苄青霉素抗性基因(Amp)，用于在大肠杆菌中筛选和繁殖质粒载体，iii)酵母2微米(2 μ)复制起点，允许载体在酵母中游离复制，
iv)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)启动子，控制位于下游的基因的转录，ν)磷酸甘油酸激酶(PGK)的特异性酵母转录终止信号，以及vi)唯一 BamHI限制位点，允许所选基因GPD启动子(pGPD)的控制下进行克隆，且 所述限制位点后是PGK停止序列(PGKt)。图IA显示质粒载体PTT10301的图谱。图IB中显示证实质粒中的所有元件正确 组织的限制性内切核酸酶分析。将大肠杆菌菌株DH5 α (Stratagene)用于质粒扩增。使携带质粒ρΤΤ10301的细菌 细胞于37°C下在Luria Broth Ampicilin(LBA)培养基(每ml含1 %胰蛋白胨、1 % NaCl、 0.5%酵母提取物、50mg氨苄青霉素)中生长。将包含pTT-10301质粒的重组细菌的培养物 的甘油储备液(Glycerol stock)储存在_80°C。1. 2.重组基因组织因子(TF)是具有32-aa前导序列的295-氨基酸(aa)蛋白。成熟蛋白能 够被分成三个结构域胞外结构域(aa 33-251)、跨膜区(aa252_274)和胞质尾区(aa 275-295)。图2显示人TF(hTF)蛋白的亲水性图。编码成熟hTF蛋白(aa 33-295)的cDNA通过聚合酶链反应(PCR)扩增为 816-bp 片段。对于该 PCR 反应，将人胎盘 cDNA 文库(Marathon-Ready cDNA, Clontech Laboratories, Inc.)用作模板，并将分别在人TF基因的5’或3’端退火的寡核苷酸A(SEQ ID NO 1)和 B(SEQ ID NO 2)用作引物。图3显示hTF DNA序列(基因库登录号#BC011029)中的引物A (SEQ ID NO 1)和 B(SEQ ID NO 2)的退火序列。鉴定为SEQ ID NO 1的引物编码缺乏信号肽的成熟hTF的 前四个氨基酸并包含带有hTFORF的框内的起始密码子ATG。PCR条件如下35个循环的PCR(94°C，30秒；45°C 30秒；72°C 1分钟)和在72°C 下7分钟的最后延伸步骤。然后纯化PCR产物(QiagenDNA纯化系统)。1. 3. rTF质粒表达载体的产生将如1. 2节所述获得的PCR-扩增的DNA片段用BamHI消化以除去端部，乙醇沉淀， 并克隆至预先用BamHI消化的pTT10301载体中。在对几个克隆进行内切核酸酶限制性分 析后，筛选包含相对于GDP启动子(pGDP)正确定位的重组成熟hTF(下文称为rTF)基因的 质粒，其命名为pTT10302(图4)。包含在质粒ρΤΤ10302中的rTF的DNA序列与公布序列(基因文库 #BC011029) 100%—致。使用引物 A(SEQ ID NO 1)和 B(SEQ ID NO 2)以及 Big Dye 终止 剂(Big Dye Terminator reagents)在自动测序仪(ABIprism 370, Applied Biosystems) 上测序编码DNA的rTF的DNA序列。使携带pTT10302质粒的DH5 α大肠杆菌细胞在37°C下 在LBA培养基中生长过夜，并将其用于制备甘油储备液，将所述甘油储备液储存在-80°C。1. 4. rTF由重组酵母的表达为了产生表达重组成熟人组织因子的重组酵母(rTF)，使用表达载体pTT10302来 转化Τ73 ura3-酵母细胞。T73 ura3_是广泛用于葡萄酒生产中的良好表征的酿酒酵母T73菌株的衍生物。 T73 是在西班牙阿利坎特(Colecci0n Espanola de CultivosTipo,登录号 #CECT1894)地 区筛选出的二倍体菌株，并且它被Lallemand Inc. (Montreal,Quebec,Canada)在全世界范围内商品化用于食品工业。菌株T73 111^3_是了73衍生物，其中URA3基因的两个拷贝都已 被破坏(J. Agric. Food Chem. 1998. 46，1689-1693)。T73 ura3-是允许使用携带 URA3 选择 标记基因的质粒载体产生T73重组酵母的表型稳定的URA-和食品安全酵母菌株。为了产生工作储备液，使T73 ura3_细胞在培养皿(Petri dish)中生长，并 且分离出单菌落并使其在30°C下在YPD培养基(1%酵母提取物、2%细菌学蛋白胨 (bacteriological ρ印tone)，2%葡萄糖)中生长直到达到密度为IO7个细胞/ml。然后通 过离心沉淀酵母细胞，在15%甘油的基本选择性培养基(酵母提取物氮基和不含尿嘧啶的 完全合成培养基；YNB CSM-URA)中重悬浮，并在_80°C下分装冷冻直到使用。将三个随机选 择的代表性试样(aliquot)解冻，并检验是否无细菌污染。首先将新鲜的T73 Ura3_代表 性试样解冻并根据 LiAc/SS-DNA/PEG 方案(Methods in Enzymology (酶学方法)1994. 350 87-96的方法)使细胞易获得质粒载体。根据相似策略来产生携带空质粒PTT10301的对照 重组酵母。通过它们在缺乏尿嘧啶的培养基中生长的能力来筛选重组酵母克隆。分离用 PTT10302转化的八个独立克隆并将其在不含尿嘧啶的培养基中培养过夜。利用玻璃微珠沉 淀这些被称为yTT10301的重组酵母培养物并勻浆。类似地，还可以对来自用PTT10301转 化的酵母(被称为yTT10300)的独立克隆进行相同操作。将来自两种类型重组酵母的不同克隆的蛋白通过SDS-PAGE分离，并转移至硝 酸纤维素膜，将所述膜进行Western印迹分析。如图5所示，所有从yTT10301培养物 中筛选出的克隆(克隆1至克隆8)表达被抗人TF特异性单克隆抗体(mAb)⑶142 (BD BiosciencesPharmingen)识别的几种多肽。然而，没有yTT10300克隆显示出与特异性抗人 TF mAb免疫反应性多肽(图5中的泳道C，对应于这些克隆中的一个)。如图5所示，yTT10301中的主要免疫反应性产物(泳道1至泳道8)的分子大小 为约35kDa (由星号表示)。还能够观察到分子质量为44kDa和46kDa的其它产物(由箭头 表示)和大小范围为70kDa至115kDa的大聚集体(箭头)。分子量低于35kDa的多肽可能 与rTF降解产物对应。显示不同电泳迁移率的几种TF相关产物的出现是由于蛋白聚集、不同程度的糖 基化或两者导致。为了研究这些可能性，用内切糖基化酶Endo H和PNGase F处理yTT10301 的提取物(克隆#7)。如图6所示，在用Endo H(泳道2)或PNGase F(泳道3)孵育后，较 大聚集体(75kDa至150kDa)消失，而清楚地观察到75kDa产物(将泳道1与泳道2和泳道 3比较)。此外，经过上述两种处理，44kDa和46kDa蛋白带也消失。在用Endo H处理的样 品(泳道2)中，44kDa和46kDa产物看起来产生约36kDa的产物。PNGase F处理导致出现 37kDa和39kDa (泳道3)两条带。另一方面，35kDa产物在用这些糖基化酶处理后保持不变。 因此，看起来35kDa产物与未糖基化的rTF蛋白对应，并且在内切糖基化酶处理后能够被识 别的75kDa产物可以代表非糖基化蛋白的二聚体。在未处理样品中观察到的大聚集体能够 与相同但具有不同糖基化程度的二聚体对应。类似地，44kDa和46kDa蛋白看起来与具有不 同糖基化模式的35kDa蛋白对应。根据氨基酸序列确定的缺乏信号肽的hTF的预测分子量是29. SkDa0预测的与 观察到的分子质量的偏差可能是由于疏水氨基酸存在伸展而使蛋白在SDS-PAGE中异常迁 移。
此外，通过激光扫描共聚焦显微镜来分析rTF通过yTT10301的表达。为了进行这 些研究，将来自未表达(yTT10300)和表达rTF(yTT10301，克隆#7)的重组酵母的原生质球 (即通过酶处理产生的缺乏细胞壁的酵母)固定，并用抗人TF mAb或用抗酵母膜ATPase mAb孵育。如图7所示，抗ATPase mAb仅特异性标记原生质球的表面(图7A，1和图片3)。 然而，抗人TF mAb显示出分布于整个细胞的信号，表明rTF不仅存在于质膜中，而且存在于 细胞内部，可能与内膜细胞区室结合(图7B，图片5和图片7)。另一方面，如图8所示，在 携带空质粒的酵母细胞(yTT10300)中，抗ATPase mAb也在细胞表面给出特异性信号(图 8A，图片1)，但是如期望的那样，未检测到抗人TF抗体的标记(图8B，图片3)。为了证实rTF是膜相关蛋白，将yTT10301酵母细胞用含有去垢剂Triton X_114(至终浓度为)的裂解缓冲液处理。在4°C下孵育1小时后，将裂解液加载至6% 蔗糖垫(sucrose cushion)上方，在30°C下温热3分钟，并在300xg下离心3分钟以将上部 水相与下部去垢剂相分离。收集水相并将去垢剂沉淀置于冰上。在取出少量试样用于随后 的分析后，将水相进行第二轮Triton X-114提取。在进行新的相分离后，收集第二水相并 将新的去垢剂沉淀添加到前次沉淀中。通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色(图9A)，以及通过 用抗人TF mAb的Western印迹(图9B)来分析两次去垢剂沉淀的混合物和两水相。如图 9B所示，仅在去垢剂相(泳道4)中观察到特征性的rTF来源的产物，而在两水相中的任一 个(泳道2和泳道3)中都未观察到。在考马斯蓝染色的凝胶中，我们能够观察到来自酵母 提取物的大部分蛋白保留在水相(泳道2和泳道3)中。该结果清楚地显示出由yTT10301 表达的rTF是膜相关的。1.5.发酵方法为了测试工业化前水平下的yTT10301酵母提取物的产生，发明人将其在2升生物 反应器(Biostat B-2L. BRAUN)中进行发酵。操作条件和培养基如下操作条件=T:30°C ；搅拌速度:250-300rpm ；pH 4. 5 ；气流6L/m。培养基=CSM-URA0. 78g/L ；YNB 6. 7g/L ；蔗糖:20g/L。图10中的图表显示在整个发酵过程中主要参数的演化。唯一不受控制的参数氧 分压(PO2)的变化反映了在该过程中细胞需氧量的变化。当PO2达到稳定状态时(由箭头 表示)(18h)停止发酵。通过在3，000rpm(l，200xg)下离心10分钟沉淀由发酵产生的产物，并将其 在200ml裂解缓冲液(25mM PIPES (pH 7. 8), 50mM NaCl)中重悬浮。将酵母通过高 压(1，000巴(108Pa))(勻浆器NIRO SOAVIS. Panda 2K)勻浆，并于4 °C将勻浆液在 13, OOOrpm(13, OOOxg)下离心30分钟，分别收集沉淀(50ml)和澄清酵母提取物(CYE)上清 液(150ml)。图11表示操作的总体方案。通过标准比色BCA测定(Pierce)来定量两种制剂中的蛋白浓度，并通过Western 印迹分析来测定rTF的存在。这些测定的结果表明两种样品的总蛋白浓度相似(沉淀 3. 8mg/ml和CYE 3. 9mg/ml)，因此如图12所示，通过Western印迹检测到的CYE和沉淀中 的rTF量也相等。当将两种样品在制备当天(1，400ng/ml活性rTF)进行分析时，如实施例4中所述 测定的CYE和沉淀的促凝活性也相似，但是可能由于沉淀组分中存在蛋白酶，因此在制备 后第四天沉淀提取物中的rTF稳定性低得多(l，500ng/ml比199ng/ml)。因此，选择CYE组分用于制备随后的药品。1.6.电子显微镜为了更好地表征CYE产物而进行免疫电子显微镜分析。通过电子显微镜(EM)对 CYE样品的检测显示出存在大量不同尺寸(从0. 1 μ m至0. 01 μ m)的酵母来源的囊泡。如 通过在它们周边存在的金颗粒所观察到的，约5%至10%的这些泡囊被抗人TF mAb标记 (图13)。另一方面，在用无关mAb孵育的控制栅(control grid)中观察到非常少的金颗 粒，并且它们未与囊泡结合(未示出)。 目前已知最佳凝血活性需要TF与脂质的结合(Thromb. Haemost. 2001 ；86 66-74)，且由于来自yTT10300的非表达TF的酵母提取物不显示任何促凝活性，因此这些结 果显示出CYE的促凝活性存在于由rTF与酵母来源的膜微泡结合产生的脂化的rTF，下文称 为CYE-TF(即具有促凝活性并包含与酵母来源的膜微泡结合的rTF的CYE组分)。实施例2&伺含姊TF(mTF)白備包Φ龍臓疑內_艦2. 1纯化方法根据前述操作(实施例1，第1. 1节至第1. 5节)制备从yTT10301中获得的包含 rTF的澄清酵母提取物(下文称为CYE-TF)。使用孔径逐渐减小的过滤器(0. 45 μ m、0. 2 μ m 和 0. Ιμπι膜(Sartorius，聚砜)将 CYE-TF 在错流过滤系统(Sartorius sartoflow Slice 200 Benchtop)中进行切向流过滤的连续步骤。所参照的流程图在图14A中示出。为了纯化包含rTF(mTF)的微泡，将对应于尺寸为0. 1 μ M至0. 2 μ M(0. 1 μ M保 留物)的IOmL过滤的CYE-TF提取物加载至预先用磷酸盐缓冲液平衡过并与AKTA-FPLC 系统连接的尺寸排阻色谱柱(S印hacryl S500coIumn-HR (60cm-26mm, 320mL-general Electric)。使用相同缓冲液在流速lmL/min下进行洗脱，并且收集42个组分，每个4mL。通 过在280nm处测量组分的吸光度来监测洗脱模式。在不同纯化试验中获得的色谱图相似。 图15中的图表显示代表性的色谱图。通过Western印迹和通过活性测定法来分析来自每一组分的等分试样以鉴别具 有促凝活性的那些组分。图16显示出聚积mTF的组分5-25 (如通过Western印迹观察到 的)也是活性集中的组分(表1)。表 1尺寸排阻纯化后获得的组分5-42中的mTF促凝活性
F.5169F.23171F.6236F.24146F.7353F.25106F.8298F.2632F.9261F.273F.10246F.280F.11197F.290F.12237F.300F.13239F.310F.14261F.320F.15241F.330F.16125F.340F.17269F.350F.18312F.360F.19263F.370F.20265F.380F.21282F.390F.22248F.400F.23171F.410F.24146F.420F.25106F.430最后，为了集中活性，将从来自各纯化过程的组分5-43混合，并通过0. 1 μ m过 滤器再次进行TFF。如表2所示，通过这些手段可以获得生物活性mTF的可再现批次 (reproducible lots) (14. 31,14. 32,15. 32,15. 36)，并且这些批次全部显示出相似的蛋白 图谱(图17)。表2 批次间的总蛋白含量和促凝活性的比较
总蛋白Pg/mL 活性蛋白ng/mL
权利要求
1.携带组织因子(TF)的酵母来源的微泡，其包含⑴酵母膜，以及(ii)具有促凝活性 的组织因子(TF)蛋白或其变异体，其中所述具有促凝活性的组织因子(TF)蛋白或其片段 的一部分被整合到所述膜内。
2.如权利要求1所述的酵母来源的微泡，其中所述具有促凝活性的TF因子蛋白或其变 异体是糖基化的。
3.如权利要求1或2所述的酵母来源的微泡，其中所述具有促凝活性的TF因子蛋白或 其变异体是融合蛋白的一部分，所述融合蛋白包含含有所述具有促凝活性的TF蛋白或其 片段的第一区域，其与包含另一肽或蛋白的第二区域结合。
4.如权利要求3所述的酵母来源的微泡，其中所述融合蛋白包含具有促凝活性的TF蛋 白或其变异体，以及标签。
5.如权利要求4所述的酵母来源的微泡，其中所述标签是组氨酸标签(His-标签)。
6.如权利要求1-5中任一权利要求所述的酵母来源的微泡，所述微泡包含成熟TF蛋 白，优选人成熟TF蛋白。
7.如权利要求1-6中任一权利要求所述的酵母来源的微泡，所述微泡包含具有促凝活 性的截短TF蛋白，在所述截短TF蛋白中负责与FVIIa(aa 32-174)结合的结构域全部或部 分缺失。
8.如权利要求7所述的酵母来源的微泡，其中所述截短TF蛋白包含与因子X相互作用 的结构域、跨膜区和胞质尾区，并部分或全部缺失负责与FVIIa结合的结构域。
9.如权利要求8所述的酵母来源的微泡，其中所述截短TF蛋白包含人TF的与因子X 相互作用的结构域(aa 174-251)、跨膜区(aa252-274)和胞质尾区(aa 275-295)，以及额 外的组氨酸标签。
10.如权利要求1-6中任一权利要求所述的酵母来源的微泡，其中所述TF包含至少一 个非功能性N-糖基化位点。
11.如权利要求10所述的酵母来源的微泡，其中一个或多个所述非功能性N-糖基化位 点是与成熟人rTF中的11-13位的NLT、124-126位的NVT或137-139位的NNT的N-糖基 化位点对应的那些位点。
12.如权利要求11所述的酵母来源的微泡，其中所述TF在与成熟人TF中的11、124或 137位对应的位置处携带Asn残基的一个或多个Asn至Ala的突变。
13.如权利要求1-12中任一权利要求所述的酵母来源的微泡，其中所述具有促凝活性 的TF蛋白或其变异体的N-末端结构域朝向所述膜的外质侧。
14.如权利要求1-12中任一权利要求所述的酵母来源的微泡，其中所述具有促凝活性 的TF蛋白或其变异体的N-末端结构域朝向所述膜的内质侧。
15.组合物，其包含权利要求1-14中任一权利要求所述的携带TF的酵母来源的微泡。
16.如权利要求1-14中任一权利要求所述的携带TF的酵母来源的微泡，其作为药物。
17.如权利要求16所述的携带TF的酵母来源的微泡，其作为具有促凝活性的药物。
18.药物组合物，其包含权利要求1-14中任一权利要求所述的携带TF的酵母来源的微 泡和药物可接受的介质。
19.如权利要求1-14中任一权利要求所述的携带TF的酵母来源的微泡，其用于治疗个 体出血。
20.如权利要求19所述的携带TF的酵母来源的微泡，其用于局部治疗个体出血。
21.如权利要求1-14中任一权利要求所述的携带TF的酵母来源的微泡，其用于治疗需 要促进个体细胞迁移和/或血管生成的疾病。
22.用于制备权利要求1所述的具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡的方法，其 包括a)将表达具有促凝活性的TF蛋白或其片段的重组酵母细胞的培养物在允许所述具有 促凝活性的TF蛋白或其片段表达的条件下发酵；b)将由步骤a)的发酵得到的所述产物沉淀，以提供发酵产物；c)将从步骤b)获得的所述发酵产物勻浆，以提供发酵勻浆液；以及d)将从步骤c)获得的所述发酵勻浆液分离，以提供沉淀和澄清酵母提取物(CYE)，所 述酵母提取物包含所述具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡；e)收集包含所述具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡的所述澄清酵母提取物 (CYE)；以及，任选地，f)如果需要，将所述具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡分离或纯化。
23.如权利要求22所述的方法，其中通过标签纯化或通过免疫亲和色谱法实施所述纯化。
24.用于制备包含来自真核宿主细胞的感兴趣膜蛋白的微泡的方法，所述方法包括以 下步骤a)使所述真核宿主细胞的培养物在允许所述感兴趣膜蛋白表达的条件下生长；b)将a)的培养物的细胞部分勻浆；c)将从步骤b)获得的勻浆液分离，以提供沉淀和澄清细胞提取物，所述细胞提取物包 含所述含有感兴趣膜蛋白的细胞来源的微泡；d)通过尺寸分配来纯化所述细胞来源的微泡。
25.如权利要求24所述的方法，其中使用切向流过滤和/或使用保留直径为0.1 μ m至 0. 2 μ m的微泡的膜过滤器来实施步骤d)。
26.如权利要求24或25所述的方法，所述方法包括通过尺寸排阻色谱法的附加浓缩步 骤或通过亲和色谱法的附加纯化步骤，所述亲和色谱法使用对所述感兴趣膜蛋白显示亲和 力的配体。
27.如权利要求24-26中任一权利要求所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞。
28.如权利要求24-27中任一权利要求所述的方法，其中所述感兴趣蛋白是rTF、rTF的 片段或rTF的N-糖基化突变体。
29.修饰的组织因子(TF)脂化蛋白，其选自(i)具有促凝活性的截短组织因子(TF)，其缺失全部或部分负责与FVIIa结合的结构域，( )具有促凝活性的TF蛋白突变体，其中负责与FVIIa结合的结构域不是功能性的，以及(iii)具有促凝活性的TF蛋白突变体，其携带至少一个非功能性N-糖基化位点。
30.如权利要求29所述的修饰的TF脂化蛋白，其中所述截短TF蛋白包含与因子X相 互作用的结构域、跨膜区和胞质尾区，并缺失部分或全部负责与FVIIa结合的结构域。
31.如权利要求30所述的修饰的TF脂化蛋白，其中所述截短TF蛋白包含人TF的与因 子X(aa 174-251)相互作用的结构域、跨膜区(aa252-274)和胞质尾区(aa 275-295)，以及 额外的组氨酸标签。
32.如权利要求29所述的修饰的TF脂化蛋白，其中所述突变的TF蛋白携带至少一个 非功能性N-糖基化位点。
33.如权利要求32所述的修饰的TF脂化蛋白，其中一个或多个所述非功能性N-糖基 化位点对应于成熟人rTF中的11-13位的NLT、124-126位的NVT或137-139位的NNT的 N-糖基化位点。
34.如权利要求33所述的修饰的TF脂化蛋白，其中所述TF在与成熟人TF中的11、124 或137位对应位置处携带Asn残基的一个或多个Asn至Ala的突变。
35.如权利要求29-34中任一权利要求所述的修饰的TF脂化蛋白，其用作药物。
36.如权利要求35所述的修饰的TF脂化蛋白，其作为具有促凝活性的药物。
37.药物组合物，其包含权利要求29-34中任一权利要求所述的修饰的TF脂化蛋白和 药物可接受的介质。
38.如权利要求29-34中任一权利要求所述的修饰的TF脂化蛋白，其用于治疗个体出血。
39.如权利要求38所述的修饰的TF脂化蛋白，其用于局部治疗个体出血。
40.如权利要求29-34中任一权利要求所述的修饰的TF脂化蛋白，其用于治疗需要促 进个体细胞迁移和/或血管生成的疾病。
41.多核苷酸，其编码在权利要求29-34中任一权利要求中所定义的修饰的TF蛋白。
42.载体，其包含在权利要求41中所定义的多核苷酸。
43.宿主细胞，其包含在权利要求41中所定义的多核苷酸或在权利要求42中所定义的 载体。
44.抗体，其与在权利要求29-34中任一权利要求中所定义的修饰的TF蛋白特异性结合。
全文摘要
本发明公开了具有促凝活性的携带组织因子的酵母来源的微泡，其包含酵母膜和组织因子蛋白或其片段，或者与另一肽融合为融合蛋白的组织因子蛋白或其片段。所述产物在治疗个体出血中能够被用作促凝剂。
文档编号C07K14/745GK102007144SQ200780051494
公开日2011年4月6日 申请日期2007年12月28日 优先权日2006年12月29日
发明者哈维尔·佩德雷尼奥埃赫亚, 胡安·拉蒙·罗德里格斯费尔南德斯-阿尔瓦, 路易斯·卡韦达卡塔苏斯 申请人:斯洛柏塔盖兹欧洲有限公司